通過在低ph下發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸的制作方法
【專利說明】通過在低PH下發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 該申請要求保護(hù)2012年9月14日提交的美國臨時(shí)申請系列號61/701，293的優(yōu) 先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明是使用生物催化劑產(chǎn)生可再生化學(xué)原料的領(lǐng)域，已經(jīng)遺傳改造了所述生物 催化劑以增加其將可再生碳源轉(zhuǎn)化成有用的化合物的能力。更尤其是，本發(fā)明提供使用遺 傳修飾的生物催化劑從可再生碳源產(chǎn)生有機(jī)酸，如琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸和乳酸的方 法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 琥珀酸（為了簡潔，本文中也稱為"琥珀酸"）是在多種產(chǎn)品，包括動(dòng)物飼料、增塑 劑、冷凍劑、聚合物、纖維和塑料，最特別的是聚琥珀酸丁酯（也稱為"聚琥珀酸亞丁酯"、"聚 (琥珀酸亞丁酯）"和"PBS"）的制造中早已使用或可能使用的潛在大體積化學(xué)物。由琥珀 酸制備的許多聚合物以比來源于石油的其他聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚對苯 二甲酸乙二酯（PET)快得多的速率被生物降解。像這樣，由琥珀酸制備的塑料是高度想要 的，因?yàn)樗鼈冊诶蚱渌逊虱h(huán)境中會(huì)更迅速地腐爛（Kunioka等，2009)。這種性質(zhì)擴(kuò)展 至許多其他聚合物和塑料，其中單體亞基是生物來源的化合物或其化學(xué)等同物，而不是正 常在活生物體中沒有大量發(fā)現(xiàn)的石油化學(xué)來源的化合物。例如，來源于延胡索酸（延胡索 酸）、蘋果酸（蘋果酸）、己二酸（己二酸）、L-乳酸（L-乳酸）、D-乳酸（D-乳酸），和其他 天然發(fā)生的有機(jī)酸的聚合物均比堆肥環(huán)境中的許多石油化學(xué)來源的聚合物降解地更迅速。 像這樣，為了人類的利益，期望利用由生物化學(xué)物（由活生物體制備和/或代謝的化學(xué)物） 制備的聚合物和塑料替換目前由石油化學(xué)物制備的聚合物和塑料。
[0006] 當(dāng)然，可以從石油制造許多生物化學(xué)物，如琥珀酸、延胡索酸，和己二酸，并且實(shí)際 上，目前使用的制備PBS和尼龍的方法（2012)使用石油來源的單體。然而，因?yàn)槭澜缡凸?應(yīng)是有限的，還期望開發(fā)通過從可再生碳源，如糖、糖聚合物、甘油、脂肪酸、二氧化碳、木質(zhì) 素或生物量的任何其他形式或來源于生物量的廢物發(fā)酵產(chǎn)生生物化學(xué)單體的材料和方法。 因此，期望開發(fā)從可再生生物資源制備生物可降解塑料的方法。
[0007] 已經(jīng)開發(fā)了若干方法用于通過發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，例如通過乳桿菌 (Lactobacillus)、埃希氏菌（Escherichia)和芽抱桿菌（Bacillus)屬的細(xì)菌產(chǎn)生L-乳 酸（Grabar等，2006 ;Patel等，2006)，通過絲狀真菌米根霉（Rhizopus oryzea)產(chǎn)生 延胡索酸（Roa Engel等，2008)，通過遺傳改造的大腸桿菌（Escherichia coli)或凝 結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)產(chǎn)生 D-乳酸（Wang 等，2011 ;Jarboe 等，2010 ; Grabar等，2006)，通過遺傳改造的大腸桿菌（E. coli)產(chǎn)生己二稀二酸（Niu等，2002)， 通過酵母（Saccharomyces)、克魯維酵母（Kluyveromyces)、假絲酵母（Candida)和伊 薩酵母（Issatchenkia)屬的多種遺傳改造的酵母種產(chǎn)生L-乳酸（Zhang等，2011 ;US 7,049，108，US 7, 229, 805)，通過遺傳改造的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)產(chǎn) 生蘋果酸（US 2008/0090273)，和通過遺傳改造的大腸桿菌、釀酒酵母、東方伊薩酵母 (Issatchenkia orientalis)和解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)產(chǎn)生瑭泊酸（Zhang 等，2009a ;Zhang 等 2009b ;Jantama 等，2008a ;Jantama 等，2008b ;W0 2010/003728 ;W0 2008/128522 ;W0 2010/043197 ;W0 2012/103261 ;US2012/0015415)。
[0008] 許多上述方法，包括基于細(xì)菌的所有那些使用不能在低pH下生長的生物體。如本 發(fā)明中所用，術(shù)語"低pH"定義為5. 6或更低的pH。當(dāng)?shù)蚿H不耐受的生物催化劑，如細(xì)菌 生物催化劑用于產(chǎn)生有機(jī)酸，如琥珀酸時(shí)，培養(yǎng)基的pH變成酸性的并且通過加入堿，一般 是鈉、鉀、銨、鎂或鈣的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或其混合物將pH維持在約5. 6至約7. 5。 因此，培養(yǎng)液中的有機(jī)酸以鹽存在，并且大多數(shù)有機(jī)酸分子是帶電荷的。荷電狀態(tài)具有優(yōu)點(diǎn) 和缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)是荷電鹽不輕易地穿過細(xì)胞膜彌散回到細(xì)胞內(nèi)。缺點(diǎn)是有機(jī)酸的聚合化學(xué)或 其他進(jìn)一步的化學(xué)用途一般需要有機(jī)酸的質(zhì)子化形式（也稱為"游離酸"），所以發(fā)酵產(chǎn)生 的鹽需要可能昂貴的下游處理來提供游離的酸形式。像這樣，在低PH(接近或更優(yōu)選低于 有機(jī)酸的最低PKa的pH)下產(chǎn)生有機(jī)酸將是有利的，從而大多數(shù)分子處于游離酸狀態(tài)。將 其他考慮因素放在一邊，低PH發(fā)酵液處理較廉價(jià)以給出游離酸的純制劑，因?yàn)楸仨毞蛛x的 平衡離子（如鈉、鉀、銨、鎂、鈣）少得多。然而，該方法遇到的問題至少在理論上是質(zhì)子化 的酸比其各自的鹽更疏水，所以所述質(zhì)子化的酸更易于通過細(xì)胞膜的疏水脂雙層彌散回到 細(xì)胞內(nèi)（van Maris等，2004)。如果需要能量將有機(jī)酸泵出細(xì)胞，那么接著發(fā)生無效循環(huán)， 其會(huì)消耗細(xì)胞的資源遠(yuǎn)離想要的生物合成（van Maris等，2004)。
[0009] 但是，存在通過在低pH發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸的方法。最有名且最古老的是通過黑曲 霉（Aspergillus niger)和相關(guān)種產(chǎn)生梓檬酸的方法（Papagianni, 2007)，盡管梓檬酸可 能是特例，因?yàn)橘|(zhì)子化形式可能比一羧酸和二羧酸的質(zhì)子化形式更極化。近期，已經(jīng)開發(fā)了 方法用于通過多種酵母在pH下產(chǎn)生L-乳酸，并且這些酵母之一已經(jīng)商業(yè)化，盡管還未揭示 是哪一種酵母（Aker 等，Session Abstract 170, Society for Industrial Microbiology Annual Meeting, July 24-28, 2011，New Orleans, LA, USA)。已經(jīng)改造了 釀酒酵母菌株 以產(chǎn)生蘋果酸，但是pH維持在5 (Zelle等，2008)。甚至更近期，已經(jīng)遺傳改造了釀酒酵 母、東方伊薩酵母（Issatchemkia orientalis)和解脂耶氏酵母菌株以在相對低的pH下 產(chǎn)生琥珀酸（W0 2008/128522 ;TO 2010/043197 ;US 2012/0040422 ;TO 2010/003728 ;W0 2011/023700 ;W0 2009/101180 ;W0 2012/038390 ;W0 2012/103261;和 US 2012/0015415)。 然而，當(dāng)提及時(shí)，在這些現(xiàn)有技術(shù)專利申請中已經(jīng)發(fā)表的滴度和產(chǎn)量相比于通過在中性pH 下操作的細(xì)菌產(chǎn)生系統(tǒng)獲得的那些相對低，所以來自發(fā)表的酵母方法的滴度和產(chǎn)量足夠的 高以與中性pH細(xì)菌方法競爭并不明顯（Jantama等2008a ;Jantama等，2008b)。此外，如 本發(fā)明所公開，在從腐爛的甘蔗渣和其他環(huán)境中存在若干酵母菌株，其在低PH下比釀酒酵 母菌株更耐受琥珀酸和L-乳酸。
[0010] WO 2012/103261公開了已經(jīng)被改造以產(chǎn)生琥珀酸或蘋果酸的東方伊薩酵母菌株。 這些菌株來源于在許多不同酵母種類的集合中被選擇為在低PH對高濃度的琥珀酸最有抗 性的野生型親本。具體而言，當(dāng)與馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)菌株相 比時(shí)，所選的東方伊薩酵母（I. orientalis)菌株對琥珀酸更有抗性。WO 2012/103261沒有 公開被改造以過量產(chǎn)生琥珀酸的克魯維酵母屬的酵母。然而，如本發(fā)明將公開，本發(fā)明人已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)了馬克思克魯維酵母的新野生型菌株，其在富含稀釋劑的培養(yǎng)基中生長時(shí)比東方伊 薩酵母菌株在低pH下對琥珀酸更耐受（參見圖1)。因此，種類內(nèi)不同菌株之間在低pH下 對有機(jī)酸的耐受性方面明顯地存在一些變異，并且完成篩選的精確條件可能影響該篩選的 結(jié)果。例如，在將東方伊薩酵母鑒定為對琥珀酸最耐受的WO 2012/103261中篩選對琥珀酸 的耐受性推測在YH)培養(yǎng)基（含有2%葡萄糖作為碳源），pH 2.5下完成，而在將野生馬克 思克魯維酵母（K. marxianus)菌株（其與馬克思克魯維酵母的任何已知菌株不同）鑒定為 對琥珀酸最耐受菌株的下文中公開的篩選在含有5%葡萄糖的1/4強(qiáng)度YP培養(yǎng)基（2. 5g/l 酵母提取物加5g/l蛋白胨）中和3. 3的起始pH下完成。WO 2012/103261公開了缺失編碼 PEP羧激酶的PCK基因?qū)︾晁岙a(chǎn)生有益，因?yàn)橐话阏J(rèn)為PEP羧激酶是葡萄糖異生酶，并在 想要方向的反方向起作用。然而，在適當(dāng)改造的菌株中，本發(fā)明人提出了完全相反的方面， BP，使用PEP羧激酶用于回補(bǔ)（二氧化碳摻入）反應(yīng)比使用如WO 2012/103261中要求的丙 酮酸羧化酶或PEP羧化酶更有利。WO 2012/103261的發(fā)明人提出通過增加戊糖磷酸途徑流 量而提供用于產(chǎn)生琥珀酸的還原途徑的還原當(dāng)量。相反，本發(fā)明人建議用于琥珀酸合成的 還原當(dāng)量最好通過TCA循環(huán)的氧化和還原分支平衡流來提供。
[0011] 已經(jīng)公開了東方伊薩酵母的菌株，其已經(jīng)被改造以產(chǎn)生蘋果酸或延胡索酸（W0 2012/103263)。然而，WO 2012/103263沒有公開克魯維酵母作為產(chǎn)生蘋果酸或延胡索酸的 宿主的用途，并且如上用于WO 2012/103261，其教導(dǎo)反對使用PEP羧激酶用于從PEP至草酰 乙酸（OAA)的羧化反應(yīng)。
[0012] 在任何情況下，TO 2102/103261中公開的琥珀酸產(chǎn)生參數(shù)和TO 2012/103263中 公開的蘋果酸產(chǎn)生參數(shù)分別對琥珀酸或蘋果酸的商業(yè)生產(chǎn)不足以有吸引力，所以仍有改善 的空間，并且仍然需要開發(fā)改善的方法用于在低PH下通過發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸和其他有機(jī)酸， 如延胡索酸、L-蘋果酸、D-乳酸、L-乳酸。
[0013] 釀酒酵母當(dāng)在作為碳源的葡萄糖上需氧或厭氧生長時(shí)天然產(chǎn)生大量的琥珀 酸（〇11四，1977;]^61(16和1^(1161'，1978;(16 1(161^1^2010)。在酵母中產(chǎn)生瑭泊酸的氧 化和還原生物化學(xué)途徑是眾所周知的（de Klerck，2010)并且與大腸桿菌和許多其他 生物體的那些類似，除了在酵母中，許多氧化步驟主要在線粒體或原線粒體（也稱為 protomitochindria)內(nèi)被催化。琥泊酸是克雷伯氏循環(huán)，也稱為三羧酸循環(huán)或TCA循環(huán) 中的中間物。在存在氧氣的條件下，大多數(shù)需氧生物體氧化運(yùn)行TCA循環(huán)，其以草酰乙酸 (OAA)和乙酰-CoA開始，運(yùn)行經(jīng)過檸檬酸、烏頭酸、異檸檬酸、α -酮戊二酸、琥珀酰-CoA、 琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸并回到0ΑΑ。在該方法中，產(chǎn)生NADH、NADPH和FADH2形式的還原 當(dāng)量，和2摩爾的CO 2/摩爾乙酰-CoA。因此，乙酰-CoA的乙?；糠衷谘h(huán)中實(shí)際上被氧 化成CO2和水，并且OAA作為獲得再生的引物或催化劑而起作用。琥珀酸是中間物。在需氧 條件下，還原當(dāng)量最終通過氧化磷酸化被氧氣氧化，以產(chǎn)生水和ATP，因此，再生NAD、NADP 和FAD用于下一個(gè)循環(huán)。然而，在缺少氧氣或其他氧化劑的情況下，TCA循環(huán)不能在上述氧 化循環(huán)中專一運(yùn)行，因?yàn)榧?xì)胞不能再生TCA循環(huán)所需量的NAD、NADP和FAD。雖然在基本培 養(yǎng)基中厭氧條件下，需要至少三個(gè)TCA循環(huán)中間物α -酮戊二酸、琥珀酰-CoA和OAA作為 其他生物合成途徑的生物化學(xué)中間物，但是大多數(shù)TCA循環(huán)的酶反應(yīng)物必須仍然是有活性 的。在這些條件下，將TCA"循環(huán)"分成兩個(gè)線性的非環(huán)形的叉或分支，一個(gè)氧化分支如上所 述開始，但以琥珀酰CoA終止，和一個(gè)還原分支也以O(shè)AA開始，但以與上述方向相反的方向， 通過蘋果酸和延胡索酸運(yùn)行，以琥珀酸終止。該第一個(gè)分支在本文中應(yīng)該稱為氧化分支，而 第二個(gè)分支在本文中應(yīng)該稱為TCA循環(huán)的還原分支，因?yàn)樽鳛閺腛AA到琥珀酸的途徑之一， 其消耗作為NADH和FADH2的還原當(dāng)量，以再生NAD和FAD。
[0014] 如在本發(fā)明中所定義，術(shù)語TCA循環(huán)的"產(chǎn)生琥珀酸的氧化途徑"或"氧化分支"指 克雷伯氏循環(huán)的一部分，其以磷酸烯醇丙酮酸開始并以琥珀酸終止，并且包括中間物如草 酰乙酸、乙酰CoA、檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸、α -酮戊二酸和琥珀酰CoA，并涉及還原當(dāng) 量如NADH的產(chǎn)生。另一方面，如本發(fā)明中所定義，術(shù)語TCA循環(huán)的"產(chǎn)生琥珀酸的還原途 徑"或"還原分支"指克雷伯氏循環(huán)的一部分，其以草酰乙酸開始并以琥珀酸終止，包括作為 中間物的蘋果酸和延胡索酸并消耗還原當(dāng)量如NADH和FADH 2。在野生型酵母細(xì)胞中，克雷 伯氏循環(huán)完全在線粒體中運(yùn)轉(zhuǎn)。本發(fā)明涉及遺傳改造的酵母細(xì)胞，其中產(chǎn)生琥珀酸的氧化 途徑和產(chǎn)生琥珀酸的還原途徑完全在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0015] 草酰乙酸在酵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中通過丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸的羧化反應(yīng)產(chǎn)生。 丙酮酸羧化成草酰乙酸由丙酮酸羧化酶介導(dǎo)，而磷酸烯醇丙酮酸的羧化由磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶介導(dǎo)。草酰乙酸從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線粒體并起始克雷伯氏循 環(huán)。
[0016] 來自異檸檬酸（克雷伯氏循環(huán)的氧化部分中的中間物）的碳也進(jìn)入乙醛酸循環(huán)， 導(dǎo)致在細(xì)胞質(zhì)中形成乙醛酸和琥珀酸。乙醛酸循環(huán)在本領(lǐng)域中也稱為乙醛酸旁路。乙醛 酸途徑在線粒體中從檸檬酸循環(huán)中分支出來并導(dǎo)致在細(xì)胞質(zhì)中作為終產(chǎn)物的琥珀酸的產(chǎn) 生。已經(jīng)作出努力以在琥珀酸產(chǎn)生中開發(fā)乙醛酸途徑。為了在細(xì)胞質(zhì)中通過運(yùn)轉(zhuǎn)乙醛酸循 環(huán)來積累琥珀酸，必須實(shí)現(xiàn)以下三個(gè)遺傳操作：（i)在適當(dāng)位置上阻斷檸檬酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)， 以便來自檸檬酸循環(huán)的碳再次導(dǎo)入乙醛酸循環(huán)；（ii)增強(qiáng)參與乙醛酸循環(huán)的酶的運(yùn)轉(zhuǎn)；和 (iii)通過遺傳操作在線粒體包被中去除二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來阻止琥珀酸從胞質(zhì)溶膠再次進(jìn) 入線粒體。
[0017] 本發(fā)明的目標(biāo)是在線粒體外沒有乙醛酸循環(huán)參與的情況下產(chǎn)生琥珀酸。這通過在 酵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)一般在線粒體內(nèi)表達(dá)的并且參與克雷伯氏循環(huán)的氧化或還原部 分的那些酶來實(shí)現(xiàn)。
[0018] 已經(jīng)遺傳改造了大腸桿菌（E. coli)菌株以在厭氧或微需氧條件下產(chǎn)生琥珀酸 (Jantama等，2008a ;Jantama等，2008b)。理論上，為了從葡萄糖實(shí)現(xiàn)琥?自酸的最大可能 產(chǎn)量，必須通過TCA循環(huán)的氧化和還原分支合成琥珀酸（W02011/063157)。還原途徑比氧 化途徑固有地從葡萄糖更高地產(chǎn)出，因?yàn)樗鲞€原途徑并不丟失任何碳原子，并且其在PEP 羧激酶反應(yīng)中從二氧化碳摻入碳原子。然而，因?yàn)檫€原途徑需要一個(gè)NADH和一個(gè)FADH2/^! 珀酸，并且因?yàn)閺钠咸烟堑絇EP的糖酵解途徑僅產(chǎn)生一個(gè)NADH/3個(gè)碳單位，因此從葡萄糖 到琥珀酸的還原途徑不是氧化還原平衡的，并因而不能通過自身厭氧運(yùn)轉(zhuǎn)。氧化途徑每消 耗3個(gè)碳單位（如丙酮酸）產(chǎn)生兩個(gè)NADH和一個(gè)NADPH。因而，如果還原和氧化途徑以正 確的比例運(yùn)轉(zhuǎn)，那么即使在缺少氧氣的情況下也能平衡氧化還原當(dāng)量（如NADH、NADPH和 FADH2)的產(chǎn)生和消耗。
[0019] 在大腸桿菌中，并且可能在運(yùn)轉(zhuǎn)TCA循環(huán)的大部分或全部其他生物中，TCA的調(diào) 節(jié)已經(jīng)很可能進(jìn)化到保存碳和能量，并且不使琥珀酸從葡萄糖的產(chǎn)量最大化。像這樣，使 被改造用于同型發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)生的大腸桿菌菌株進(jìn)行"再進(jìn)化"（也稱為代謝進(jìn)化），其可 能導(dǎo)致平衡TCA循環(huán)的兩個(gè)分支，以在厭氧或微需氧的條件下提供氧化還原平衡（Jantama 等，2008a ;Jantama 等，2008b) ο
[0020] 盡管在酵母低pH發(fā)酵中產(chǎn)生二羧酸，如琥珀酸具有理論上的優(yōu)勢，但是由于酵 母中膜結(jié)合細(xì)胞器形式的亞細(xì)胞區(qū)室化，在酵母中改造琥珀酸產(chǎn)生幾乎不像在大腸桿菌 中那樣直接。首先，在酵母中，可能在大多數(shù)（如果不是所有）其他酵母中，在需氧條件 下，TCA循環(huán)在線粒體或原線粒體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)（W0 2008/128522, WO 2010/043197)。在缺少 特定的琥?白酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下，線粒體內(nèi)膜對琥?白酸是不通透的（Lee等，2011)，但是 在延胡索酸或磷酸的交換中將琥珀酸輸入到線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是已知的（Lee等，2011 ; Palmieri等，1999 ;Palmieri等，2000)。然而，對于琥?自酸從線粒體分泌到細(xì)胞質(zhì)沒有任 何已知的機(jī)制，所以從TCA循環(huán)，即使是以分支模式產(chǎn)生的琥珀酸也不能輕易地分泌到線 粒體外并因此分泌到細(xì)胞外。像這樣，現(xiàn)有技術(shù)中公認(rèn)的是，將期望通過在產(chǎn)生蘋果酸和 琥珀酸的還原途徑中安排關(guān)鍵的酶，如丙酮酸脫酸酶、蘋果酸脫氫酶和延胡索酸酶來改造 細(xì)胞質(zhì)中的二羧酸，如蘋果酸和琥珀酸，以在線粒體外的細(xì)胞質(zhì)中存在并足夠的有活性（US 2008/0090273、US 2012/0040422、WO 2010/003728、WO 2011/023700. WO 2009/101180 和 TO 2012/038390、W0 2008/128522、W0 2010/043197、W0 2009/011974)。然而，現(xiàn)有技術(shù)還 未認(rèn)識到或解決在酵母中怎樣從線粒體輸出琥珀酸或怎樣在厭氧或微需氧條件下達(dá)到氧 化還原平衡，同時(shí)使琥珀酸從葡萄糖（或其他碳源）的產(chǎn)量最大化的問題。
[0021] 兩個(gè)線粒體膜蛋白被報(bào)道在酵母中將琥珀酸泵入線粒體中交換磷酸或延胡索酸 (Lee等，2011 ;Palmieri等，1999 ;Palmieri等，2000)。像這樣，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案 中，編碼那些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的任一或兩個(gè)基因，即DICl (W0 2008/128522)和SFCl將從酵母中缺 失，這與被改造以產(chǎn)生琥珀酸的本發(fā)明的酵母的新特征組合。
[0022] 使用酵母或細(xì)菌用于琥珀酸生產(chǎn)的現(xiàn)有技術(shù)參考依賴于使用乙醛酸旁路來產(chǎn)生 還原當(dāng)量（如NADH)，以供應(yīng)還原琥珀酸途徑（W0 2009/101180、WO 2008/128522、Vemuri 等，2002 ;Cox等，2006 ;Zhu等，2013)。此外，因?yàn)橐胰┧崤月访府悪幟仕崃呀饷负吞O果 酸合酶在酵母中是在細(xì)胞質(zhì)中的，所以依賴于使用這些酶在酵母細(xì)胞質(zhì)中合成琥珀酸（W0 2009/101180, WO 2008/128522)。然而，當(dāng)與使用TCA循環(huán)的氧化分支比較時(shí)，在細(xì)菌或酵 母中使用用于琥珀酸合成的乙醛酸旁路內(nèi)在更沒有效力，因?yàn)門CA循環(huán)的氧化分支在琥珀 酰-CoA到琥珀酸步驟產(chǎn)生ATP或GTP，而乙醛酸旁路在任何步驟均不產(chǎn)生ATP或GTP。因此， 使用乙醛酸旁路是不經(jīng)濟(jì)的，所以有利地避免其用于生物合成琥珀酸和其他二羧酸、TCA循 環(huán)中間體及其衍生物。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到使TCA循環(huán)的還原和氧化分支為琥珀酸產(chǎn)生 運(yùn)轉(zhuǎn)的重要性，并且在酵母中，期望使兩個(gè)分支在細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)轉(zhuǎn)，并且避免使用乙醛酸旁路 酶。為此，可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法從宿主酵母菌株中缺失編碼異檸檬酸裂解酶（例 如 ScICLl、ScICL2、KmICLl、IoILCl 及其他）和蘋果酸合酶（例如 ScMLSl、ScMLS2、KnMLSl、 IoMLSl，及其他）的基因。
[0023] 具體而言，盡管在現(xiàn)有技術(shù)中討論了平衡還原和氧化途徑用于琥珀酸產(chǎn)生的概念 (Jantama等，2008b ;Abbott等，2009)，但是沒有現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)提示在酵母中將TC