大白菜est-ssr標(biāo)記及其引物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明專利設(shè)及大白菜EST-SSR標(biāo)記及其引物與應(yīng)用，特別設(shè)及S組大白菜 EST-SSR標(biāo)記及其引物和在品種指紋圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標(biāo)記的出現(xiàn)使得育種工作中的選擇由傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛐瓦x擇， 大大提高了選擇的準(zhǔn)確性和效率，因此分子標(biāo)記自一出現(xiàn)即成為育種工作及遺傳學(xué)研究 重要的不可缺少的工具。特別是基于PCR的分子標(biāo)記如RAPD(Williamsetal. ,1990)、 SSR(A化ayaetal.，1992)、AFLP(Vosetal. ,1995)等的出現(xiàn)，因其簡便、快速和高效等特 點(diǎn)，使分子標(biāo)記的開發(fā)與利用已遍及各種作物。SR(Simplesequencerepeat),又稱微衛(wèi)星 DM,是由1-6個(gè)核巧酸組成的基序串聯(lián)重復(fù)序列。同一物種的不同材料SSR基序重復(fù)次數(shù) 不同，用重復(fù)區(qū)兩側(cè)相對保守的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，對基因組總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷 的長度多態(tài)性可作為不同材料的特異分子標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、可靠性高、 技術(shù)難度低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各種作物遺傳圖譜的構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇、功能基 因定位W及各種作物種質(zhì)資源遺傳多樣性的評價(jià)等研究中（PlieskeandStruss，2001 ;方 宣釣等，2001)。
[0003] 近年來植物結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)迅猛發(fā)展，人們獲得了許多植物大量的 基因組序列、EST序列W及全基因序列。該種時(shí)代背景下，在評價(jià)種質(zhì)資源多樣性時(shí)，人們 更希望能了解資源材料中功能基因的多樣性（Varshneyetal.，2005a)。該就促使人們 從功能基因序列中尋找可遺傳變異。經(jīng)過分析，人們在EST序列中（包括基因的編碼區(qū)、 5' -UTR區(qū)及3' -UTR區(qū)）發(fā)現(xiàn)了大量的可變異的SSR位點(diǎn)，即EST-SSR。此外，人們在功能基 因區(qū)還開發(fā)了SNP(SingleNucleotidePolymo;rphism)、COS(Conse;rvedOrthologousSets ofmarkers)等標(biāo)記技術(shù)，該些標(biāo)記均可用來對功能基因的多樣性進(jìn)行評價(jià)（Varshneyet al.，2005a)。但由于具有多態(tài)性高、可靠性高、技術(shù)難度低、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，EST-SSR成為 目前植物功能基因多樣性研究的主要工具。現(xiàn)已在小麥、水稻、玉米、棉花等許多作物中開 發(fā)出大量的EST-SSR引物，用于該些作物的遺傳多樣性評價(jià)W及其它工作中（Varshneyet al. , 2005b)。
[0004] 大白菜炬rassicarapassp.pekinensis，AA基因組，2n= 20)為十字花科蕓臺(tái) 屬植物，原產(chǎn)于我國，現(xiàn)廣泛栽培于我國、韓國、朝鮮及日本。因其營養(yǎng)豐富且富含膳食纖 維，人們普遍喜歡食用，在我國W及世界許多國家的蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)中占有非常重要的地 位。目前根據(jù)大白菜基因組測序結(jié)果W及數(shù)據(jù)庫中的EST序列，已經(jīng)開發(fā)了大量EST-SSR 標(biāo)記（LiandZheng, 2009;Lietal. , 2009b;Xinetal. , 2006;Paidaetal. 2010;Geet al.，2011;Ramchiaryetal.，2011;Shietal. 2014)。但是有關(guān)大白菜EST-SSR引物的開 發(fā)仍未達(dá)到飽和。開發(fā)新的EST-SSR引物，對于構(gòu)建高密度遺傳圖譜和品種指紋圖譜具有 重要意義，對于大白菜的分子育種工作將有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)W及實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供大白菜EST-SSR標(biāo)記及其引物與應(yīng)用。本發(fā)明 提供了 3組EST-SSR標(biāo)記BR-eslO、BR-esl3和BR-esl5的引物，并將它們應(yīng)用于品種指紋 圖譜的構(gòu)建中。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下；
[0007] 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO,核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO的引物，該檢測引物為一對，上游引物核巧酸序列如 SEQIDNO. 2所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl3,核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0010] 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl3的引物，該檢測引物為一對，上游引物核巧酸序列如 SEQIDNO. 5所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0011] 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl5,核巧酸序列如SEQIDNO. 7所示。
[0012] 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl5的引物，該檢測引物為一對，上游引物核巧酸序列如 SEQIDNO. 8所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 9所示。
[0013] 上述大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO的引物、大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl3的引物 和/或大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl5的引物在大白菜品種鑒定及品種指紋圖譜構(gòu)建中的應(yīng) 用。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明首次公開了大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO及其引物、大白菜EST-SSR標(biāo)記 BR-es13及其引物和大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-es15及其引物，通過對24個(gè)大白菜品種的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，并利用6 %變性聚丙締酷氨凝膠和/或12 %非變性聚丙締酷氨凝膠電進(jìn)行檢測， 發(fā)現(xiàn)上述3組EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型明顯，且在品種間具有很好的多態(tài)性，能夠很好 的區(qū)分不同的品種，可用于大白菜品種的鑒定及品種指紋圖譜的構(gòu)建。
【附圖說明】
[0016] 圖1是大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO的引物在24個(gè)大白菜材料中的PCR擴(kuò)增電 泳圖；
[0017] 圖2是大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl3的引物在24個(gè)大白菜材料中的PCR擴(kuò)增電 泳圖；
[001引圖3是大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl5的引物在24個(gè)大白菜材料中的PCR擴(kuò)增電 泳圖；
[001引圖中；泳道1、682 ;泳道2、廣東早；泳道3、早皇白；泳道4、Z61-8 ;泳道5、福山包 頭；泳道6、Li-3 ;泳道7、212-7 ;泳道8、天津青麻葉；泳道9、快菜6號(hào)；泳道10、黃金小白 菜J ;泳道11、四季小白菜；泳道12、四季黃秩小白菜；泳道13、品早1號(hào)；泳道14、韓育特 選黃屯、；泳道15、全能四季快菜；泳道16、京優(yōu)小白菜快菜；泳道17、高麗金娃娃；泳道18、 可義夏娃娃；泳道19、金諾春秋娃娃菜；泳道20、四季綠桿小苦菜；泳道21、油綠157 ;泳道 22、束腰油菜；泳道23、德高油亮青梗菜；泳道24、青秀F1青梗菜。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保 護(hù)范圍不限于此。
[0021] 生物材料來源
[002引 682、廣東早、早皇白、Z61-8、福山包頭、Li-3、212-7、快菜6號(hào)、品早1號(hào)均購自山 東登海種業(yè)股份有限公司西由種子分公司；
[0023] 天津青麻葉購自北京澳碩豐農(nóng)業(yè)科技有限公司；
[0024] 黃金小白菜購自安徽仁信種子有限公司；
[0025] 四季小白菜購自天津英良種業(yè)；
[0026] 四季黃秩小白菜購自江西省豐城市航城種業(yè)有限公司；
[0027] 韓育特選黃屯、購自青縣純豐蔬菜良種繁育場；
[002引全能四季快菜購自青島市黃島區(qū)黃海澤農(nóng)種苗研究所；
[0029] 京優(yōu)小白菜快菜購自北京澳碩豐農(nóng)業(yè)科技有限公司；
[0030] 高麗金娃娃購自北京市特種蔬菜種苗公司；
[0031] 可義夏娃娃購自北京卓生農(nóng)業(yè)科技有限公司；
[0032] 金諾春秋娃娃菜購自北京金諾陽光種子有限責(zé)任公司；
[0033]四季綠桿小苦菜購自云鴻蔬菜花弁種苗研究所；
[0034] 油綠157購自北京澳碩豐農(nóng)業(yè)科技有限公司；
[0035] 束腰油菜購自北京澳碩豐農(nóng)業(yè)科技有限公司；
[0036] 德高油亮青梗菜購自山東德州市德高蔬菜種苗研究所德州市蔬菜工程技術(shù)研究 中屯、；
[0037] 青秀F1青梗菜購自青島國際種苗有限公司。
[0038] 實(shí)施例1. EST-SSR引物的開發(fā)
[0039] 開發(fā)EST-SSR引物所用的EST序列來自于本課題組對大白菜炬.rapaSSP. pekinensis)蓮座葉和球葉的高通量轉(zhuǎn)錄組測序（Wangetal. ,2012)。通過轉(zhuǎn)錄組測 序，共獲得5, 347萬條高質(zhì)量EST序列。對該些EST序列利用Trinity軟件(http:// trinitvrnase日sourceforge.net/)進(jìn)行組裝，得到相應(yīng)的contig和unigene,然后利用 TGI化軟件包（TIGRGeneIndicesClustering)去冗余，共獲得5. 2萬個(gè)Unigene。本研究 利用MISA軟件化ttp://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)對該 5. 2 萬個(gè)Unigene進(jìn) 行了EST-SSR的分析和鑒定（標(biāo)準(zhǔn)參見aiangetal. ,2004)，共獲得1. 04萬個(gè)EST-SSR。 通過與大白菜SSR數(shù)據(jù)庫(http://oilcroDs.inf(VSSRdb)中已知的SSR進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn) 2701個(gè)新的EST-SSR。選取其中的3對引物用于品種鑒定分析（見表1)。
[0040] 表1.本研究開發(fā)的3對EST-SSR引物
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
2. 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO的引物，該檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如 SEQIDNO. 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
3. 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl3,核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
4. 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl3的引物，該檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如 SEQIDNO. 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
5. 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl5,核苷酸序列如SEQIDNO. 7所示。
6. 大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-esl5的引物，該檢測引物為一對，上游引物核苷酸序列如 SEQIDNO. 8所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO. 9所示。
7. 權(quán)利要求2所述大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-eslO的引物、權(quán)利要求4所述大白菜 EST-SSR標(biāo)記BR-es13的引物和/或權(quán)利要求6所述大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-es15的引物 在大白菜品種鑒定及品種指紋圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及大白菜EST-SSR標(biāo)記及其引物與應(yīng)用。本發(fā)明公開了大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-es10及其引物、大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-es13及其引物和大白菜EST-SSR標(biāo)記BR-es15及其引物，通過對24個(gè)大白菜品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并利用6％變性聚丙烯酰氨凝膠和/或12％非變性聚丙烯酰氨凝膠電進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)上述3組EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型明顯，且在品種間具有很好的多態(tài)性，能夠很好的區(qū)分不同的品種，可用于大白菜品種的鑒定及品種指紋圖譜的構(gòu)建。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104774951
【申請?zhí)枴緾N201510192389
【發(fā)明人】李景娟, 高建偉, 王鳳德, 李化銀, 張一卉, 丁謙
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月22日