一種檢測與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺傳標記的引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及男性不育癥檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺 傳標記的引物對。
【背景技術(shù)】
[0002] 全球約有10%~15%的育齡夫婦面臨不能生育的問題，其中一半是由于男性不 育。原發(fā)性無精子癥是造成男性不育的一個非常重要的原因，約影響1%的成年男性。男性 不育發(fā)病因素具有復雜性和多樣性的特點，包括疾病、營養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂、基因缺陷和 環(huán)境因素等，其具體發(fā)病機制尚不明確，但從家族病例報道和小鼠模型的研究成果中可以 推斷遺傳因素起了很大作用。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展，人們已發(fā)現(xiàn)近200 個基因與男性不育癥的發(fā)生密切相關(guān);采用基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)近400個基因與小鼠精子發(fā) 生密切相關(guān)，這些基因的突變、缺失或表達異常，可能是男性不育癥發(fā)生的重要原因。對這 些突變基因的研究將有助于男性不育癥的診斷，也有助于將來在體外受精過程中防止將遺 傳缺陷帶給下一代。
[0003] 雄激素受體(AR，NCBI Gene ID: 367)是一種重要的類固醇激素受體，在男性性分 化和維持正常精子發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AR屬于核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的類固醇激素作用的 家族。AR有4個蛋白結(jié)構(gòu)，包括N末端反式激活結(jié)構(gòu)域(NTD)，DNA結(jié)合域(DK))，鉸鏈區(qū)(HR)和 羧基配體結(jié)合域(LBD)。它能結(jié)合雄激素，包括睪酮(T)和5α_二氫睪酮(DHT)的配體結(jié)合域， 從而介導核易位和AR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。
[0004] 在過去的幾年中，確定了一些AR突變或多態(tài)性，可以導致或與遺傳疾病相關(guān)，如完 全或部分雄激素不敏感綜合征(CAIS和PAIS)。然而，還需要深入地研究以揭示AR突變與特 發(fā)性無精子癥(IA)的關(guān)系，為特發(fā)性無精子癥的診斷提供依據(jù)和指導。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了確定IA患者AR基因突變的情況，我們將776例IA患者和709例正常生育男性的 AR基因外顯子測序，首次新發(fā)現(xiàn)5個錯義突變和1個同義突變與IA的發(fā)生相關(guān)。
[0006] 基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺傳標記，其位于 AR基因的編碼區(qū)，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其中，上述序列的突變位點選自 c · 868T>C、c · 1484G>A、c · 1888C>T、c · 569C>T、c · 616A>G和c · 1149C>T中的一個或多個。
[0007] 前5個突變位點是錯義突變，第6個突變位點是同義突變。
[0008] 上述突變分別是在如SEQ ID NO: 1所示的AR基因序列的編碼區(qū)的第868位、1484 位、1888位、569位、616位、1279位和 1149位。
[0009] 前5個突變位點依次分別對應(yīng)的氨基酸變化情況是p.C290R、p.S495N、p.R630W、 p. T1901和p. S206G，即第290位氨基酸由C變?yōu)镽、第495位氨基酸由S變?yōu)镹、第630位氨基酸 由R變?yōu)閃、第190位氨基酸由T變?yōu)镮、第206位氨基酸由S變?yōu)镚。第6個突變位點沒有對應(yīng)的 氨基酸變化。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c.868T>C、c.1484G>A和 c. 18880T中的一個或多個。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c. 18880T。
[0012] 本發(fā)明還提供一種檢測與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺傳標記的引物對，其中，該遺 傳標記位于AR基因的編碼區(qū)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，其中，上述序列的突變位 點選自 c · 868T>C、c · 1484G>A、c · 1888C>T、c · 569C>T、c · 616A>G和c · 1149C>T中的一個或多 個;上述引物對的上游引物和下游引物分別位于上述突變位點的上游和下游。
[0013] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述引物對選自primer l、primer 2或primer 3引物對， 其中，
[0014] 上述primer 1引物對的上游引物的序列如SEQ ID N0:2所示，其下游引物的序列 如SEQ ID N0:3所示；
[0015] 上述primer 2引物對的上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示，其下游引物的序列 如SEQ ID N0:5所示；
[0016] 上述primer 3引物對的上游引物的序列如SEQ ID N0:6所示，其下游引物的序列 如SEQ ID N0:7所示。
[0017] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c.868T>C、c.1484G>A和 c. 18880T中的一個或多個。
[0018]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c. 18880T。
[0019] 通過大規(guī)模測序在特發(fā)性無精子癥病人中篩選出了 AR基因的6個新的突變位點， 構(gòu)建AR基因野生型及突變體表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)進行研究，通過實驗發(fā)現(xiàn)其功能有明顯 差異，表明AR基因的上述突變可能導致特發(fā)性無精子癥的發(fā)生，從而能夠通過上述突變來 實現(xiàn)對男性不育癥(尤其是特發(fā)性無精子癥)的診斷檢測。本發(fā)明在突變位點的上游和下游 分別設(shè)計上游引物和下游引物用于檢測上述突變位點，實現(xiàn)特發(fā)性無精子癥的診斷檢測。
【附圖說明】
[0020] 圖1為無精子癥患者AR基因的3個錯義突變位點測序圖譜；
[0021 ]圖2為無精子癥患者AR基因的3個錯義突變位點影響的進化保守性的氨基酸；
[0022]圖3為在AR基因上發(fā)現(xiàn)的3個IA病人特異的錯義突變的位置；
[0023] 圖4為3個AR突變體對下游靶基因 MMTV表達的影響，NC表示陰性對照，WT表示野生 型。
【具體實施方式】
[0024]下面通過【具體實施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0025] 1實驗內(nèi)容
[0026] 1.1標本的收集
[0027]本申請人從2007年6月到2011年10月共收集1880例無精子癥病人，其中特發(fā)性無 精子癥病人為776例，我們的篩選標準為：1)隨機檢查三次精液中無精子;2)生殖系統(tǒng)或盆 腔無阻塞、炎癥和損傷;3)無核型異常和Y染色體微缺失，另將709例正?？捎行?至少育 有一個孩子且未行IVF、ICSiaMSI等人類輔助生殖技術(shù))作為對照進行研究。每例受試者均 認真簽署知情同意書，本次研究通過醫(yī)院倫理委員會的審查批準。
[0028] 1.2外顯子測序
[0029]抽取外周血提取基因組DNA，用枸櫞酸鈉抗凝管收集研究對象的外周血，迅速置 于-80°C冰箱中備用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血DNA。
[0030] 取出5微克基因組DNA送華大基因研究中心（深圳）進行外顯子捕獲、測序，在特發(fā) 性無精子癥患者中篩選出AR基因中的9個突變位點中，其中7個錯義突變和2個同義突變，與 dbSNP135數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫和ExAC數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，有5種錯義突變和1個 同義突變是我們首次發(fā)現(xiàn)的新突變。
[0031] 1.3驗證錯義突變
[0032]以提取的外周血基因組DNA為模板，使用設(shè)計合成的3對引物對僅在特發(fā)性無精子 癥患者(W320，W691，W530)AR基因存在的3個錯義突變位點（c. 868T>C、c. 1484G>A和c. 1888C >T)進行特異性擴增，AR序列從NCBI數(shù)據(jù)庫中查得(NCBI Gene ID:367)<^|**Invitrogen 公司合成，所合成的3對引物對見表1。
[0033] 表1 AR突變位點驗證引物 [0034]
L〇〇35J PCR 擴增條仵為：98X：m 變性 2min，然后以 98X：10s、6(rC：30s、72X：45s 進仃 35 個循 環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0036] DNA電泳:取3μ1的PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠孔中，140V電泳，15min，紫外凝膠成像 系統(tǒng)拍照觀察電泳圖，確保單一條帶，其余PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司測序，引物對 Primerl、Primer2和Primer3擴增到的PCR產(chǎn)物片段序列分別如序列表中SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示。
[0037] 1.4AR突變體表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0038] 以pcDNA3 · l_AR(Mou L等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells .Bio IReprod. 2013Aug 15;89(2) :32.)為模 板，使用設(shè)計合成的3對點突變引物，構(gòu)建AR的3種突變體表達質(zhì)粒。引物由Invitrogen公司 合成，所合成的3對點突變引物見表2。
[0039] 表2 AR 3對定點突變引物 [0040]
[0041 ] 1.5雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>[0042] 1.5.1質(zhì)粒準備
[0043] 野生型AR表達載體:pcDNA3.1-AR WT(WT組）
[0044] 突變型AR表達載體:pcDNA3.1-AR C290R(C290R組）
[0045] pcDNA3.1-AR S495N(S495N組）
[0046] pcDNA3.1-AR R630W(R630W組）
[0047] 1 · 5 · 2HeLa 細胞培養(yǎng)
[0048] 將HeLa細胞用含10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37°C、5 %⑶2和95 %濕度條件下培 養(yǎng)。貼壁細胞在長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化后按比例進行傳代培養(yǎng)。
[0049] 1.5.3HeLa細胞瞬時轉(zhuǎn)染
[0050]將HeLa