方英寸，頻率為40kHz，時間為 100分鐘的條件下進行超聲波處理，其中，超聲波處理的時間分5個階段，每個階段20分鐘， 相鄰的兩個階段之間保持靜置100分鐘的靜置間隔。超聲處理結(jié)束后，撈出球狀顆粒，即得 到乙醇發(fā)酵的固定化種子。
[0035] 實施例3
[0036] 將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養(yǎng)基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養(yǎng)基）中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養(yǎng)液， 將該培養(yǎng)液離心去除培養(yǎng)基得到活菌體，將活菌體用蒸餾水懸浮為活菌體濃度5X 1012個 細(xì)胞/升的懸浮液，將該懸浮液與4. 5重量％的海藻酸鈉溶液混合均勻，使得混合后得到的 第一混合液中的海藻酸鈉的濃度為2. 1重量％。
[0037] 將上述得到的第一混合液以50滴/分鐘的速度滴入到以350轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速 率攪拌中的6重量％的氯化鈣溶液中，得到直徑為5毫米左右的球狀顆粒。撈出上述球狀 顆粒，浸沒于4重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料。
[0038] 將所述含有球狀顆粒的物料放置在外貼超聲振子設(shè)備（購自蘇州富怡達超聲波 有限公司，升降式單槽超聲波清洗機）中，在強度為60W/平方英寸，頻率為30kHz，時間為 50分鐘的條件下進行超聲波處理，其中，超聲波處理的時間分3個階段，每個階段16分鐘， 相鄰的兩個階段之間保持靜置104分鐘的靜置間隔。超聲處理結(jié)束后，撈出球狀顆粒，即得 到乙醇發(fā)酵的固定化種子。
[0039] 實施例4
[0040]將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養(yǎng)基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養(yǎng)基）中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養(yǎng)液， 將該培養(yǎng)液離心去除培養(yǎng)基得到活菌體，將活菌體用蒸餾水懸浮為活菌體濃度2. 5X 1012 個細(xì)胞/升的懸浮液，將該懸浮液與4重量％的海藻酸鈉溶液混合均勻，使得混合后得到的 第一混合液中的海藻酸鈉的濃度為2重量％。
[0041] 將上述得到的第一混合液以30滴/分鐘的速度滴入到以300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速 率攪拌中的5重量％的氯化鈣溶液中，得到直徑為5毫米左右的球狀顆粒。撈出上述球狀 顆粒，浸沒于5重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料。
[0042] 將所述含有球狀顆粒的物料放置在外貼超聲振子設(shè)備（購自蘇州富怡達超聲波 有限公司，升降式單槽超聲波清洗機）中，在強度為20W/平方英寸，頻率為40kHz，時間為 120分鐘的條件下進行超聲波處理，其中，超聲波處理的時間分4個階段，每個階段30分鐘， 相鄰的兩個階段之間保持靜置90分鐘的靜置間隔。超聲處理結(jié)束后，撈出球狀顆粒，即得 到乙醇發(fā)酵的固定化種子。
[0043]實施例5
[0044] 將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養(yǎng)基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養(yǎng)基）中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養(yǎng)液， 將該培養(yǎng)液離心去除培養(yǎng)基得到活菌體，將活菌體用蒸餾水懸浮為活菌體濃度2. 5X 1012 個細(xì)胞/升的懸浮液，將該懸浮液與4重量％的海藻酸鈉溶液混合均勻，使得混合后得到的 第一混合液中的海藻酸鈉的濃度為2重量％。
[0045] 將上述得到的第一混合液以30滴/分鐘的速度滴入到以300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速 率攪拌中的5重量％的氯化鈣溶液中，得到直徑為5毫米左右的球狀顆粒。撈出上述球狀 顆粒，浸沒于5重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料。
[0046] 將所述含有球狀顆粒的物料放置在外貼超聲振子設(shè)備（購自蘇州富怡達超聲波 有限公司，升降式單槽超聲波清洗機）中，在強度為90W/平方英寸，頻率為20kHz，時間為 10分鐘的條件下進行超聲波處理，其中，超聲波處理的時間分5個階段，每個階段2分鐘，相 鄰的兩個階段之間保持靜置30分鐘的靜置間隔。超聲處理結(jié)束后，撈出球狀顆粒，即得到 乙醇發(fā)酵的固定化種子。
[0047] 對比例1
[0048] 將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養(yǎng)基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養(yǎng)基）中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養(yǎng)液， 將該培養(yǎng)液離心去除培養(yǎng)基得到活菌體，將活菌體用保存液（種子培養(yǎng)基和甘油按9:1的 體積比混合得到）懸浮為活菌體濃度2. 5X1012個細(xì)胞/升的懸浮液，將該懸浮液作為乙醇 發(fā)酵的種子。
[0049] 對比例2
[0050] 將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養(yǎng)基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養(yǎng)基）中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養(yǎng)液， 將該培養(yǎng)液離心去除培養(yǎng)基得到活菌體，將活菌體用蒸餾水懸浮為活菌體濃度2. 5X 1012 個細(xì)胞/升的懸浮液，將該懸浮液與4重量％的海藻酸鈉溶液混合均勻，使得混合后得到的 第一混合液中的海藻酸鈉的濃度為2重量％。
[0051] 將上述得到的第一混合液以30滴/分鐘的速度滴入到以300轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速 率攪拌中的5重量％的氯化鈣溶液中，得到直徑為5毫米左右的球狀顆粒。撈出上述球狀 顆粒，即得到本對比例的乙醇發(fā)酵的固定化種子。
[0052] 測試實施例1
[0053] 將100重量份的玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為1500微米的粉碎產(chǎn)物，將粉 碎后的產(chǎn)物與200重量份的水混合得到淀粉漿液。在50°C下，將得到的淀粉漿液與a_淀 粉酶（購自諾維信公司），調(diào)節(jié)混合物的pH值為5,并保持55分鐘，得到酶解產(chǎn)物，將該酶 解產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0054] 將實施例1-5和對比例1-2得到的乙醇發(fā)酵種子在4°C下儲藏35天后取出，分 別接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，相對于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的每克的總糖，酵母活細(xì) 胞的接種量為1〇5個菌落形成單位，接種后的物料在32°c和pH值為4. 5下于發(fā)酵罐中攪 拌培養(yǎng)，從10小時后每隔2小時即取樣測定菌體濃度，并且于55小時的時候，根據(jù)《GB/ T10345-2007白酒分析方法》中的酒精計測量方法，測定實施例1-5和對比例1-2的發(fā)酵液 中的酒度。結(jié)果如圖1和表1所示。
[0055]表1
【主權(quán)項】
1. 一種制備乙醇發(fā)酵的固定化種子的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 將含有釀酒酵母活菌體的懸濁液與海藻酸鈉水溶液混合，得到第一混合液，其中， 混合的條件使得所述第一混合液中海藻酸鈉的濃度為1. 5-2. 5重量％ ; (2) 將所述第一混合液滴加到處于攪拌中的3-7重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球 狀顆粒的物料，攪拌的條件使得所述球狀顆粒的直徑為3-10毫米； (3) 將所述含有球狀顆粒的物料進行超聲波處理，超聲波處理的條件包括：強度為 10-100W/平方英寸，頻率為10-50kHz，時間為5-120分鐘。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，超聲波處理的條件包括：強度為10-100W/平方 英寸，頻率為10-50kHz，時間為5-120分鐘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，超聲波處理的條件還包括：超聲波處理的時 間分1-6個階段，相鄰的兩個階段之間保持靜置5-120分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述含有釀酒酵母活菌體的懸濁液中釀酒酵 母活菌體的濃度為IOll-IO13個細(xì)胞/升。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述含有釀酒酵母活菌體的懸濁液的懸浮介質(zhì) 為蒸餾水。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉的濃度為 3-5重量％。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟（2)中，攪拌的速率為50-500轉(zhuǎn)/分 鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟（2)中，滴加所述第一混合液的滴加速 率為5-80滴/分鐘。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，混合的條件使得所述第一混合液中海藻酸鈉 的濃度為1-4重量％。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述超聲波處理在外貼超聲振子設(shè)備中進 行。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種制備乙醇發(fā)酵的固定化種子的方法，其中，該方法包括如下步驟：(1)將含有釀酒酵母活菌體的懸濁液與海藻酸鈉水溶液混合，得到第一混合液，其中，混合的條件使得所述第一混合液中海藻酸鈉的濃度為1.5-2.5重量％；(2)將所述第一混合液滴加到處于攪拌中的3-7重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料，攪拌的條件使得所述球狀顆粒的直徑為3-10毫米；(3)將所述含有球狀顆粒的物料進行超聲波處理，超聲波處理的條件包括：強度為10-100W/平方英寸，頻率為20-50kHz，時間為5-120分鐘。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的制備方法獲得的乙醇發(fā)酵的固定化種子乙醇發(fā)酵效率高，且在儲藏20-40天后還能保持較高的發(fā)酵活性。
【IPC分類】C12N11-04, C12R1-865, C12N11-10
【公開號】CN104762290
【申請?zhí)枴緾N201510200488
【發(fā)明人】孔德柱, 趙兵, 袁曉凡, 張樹峰
【申請人】億利資源集團有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月24日