保護(hù)堿基；小寫斜體 為Xbal酶切識別序列，大寫字母與序列表序列1的第1-22位相同）；
[0045]P2:5' -cgcgagctcTCACTCCTCCATCAGCAGCAGC-3' (小寫字母為保護(hù)堿基；小寫斜體 為SacI酶切識別序列，大寫字母與序列表序列1的第3527-3549位反向互補(bǔ)序列相同）
[0046] 2、將步驟1獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Xbal和SacI雙酶切，并回收獲得大小為 3549bp的Zm-CrylA(h)基因片段；將載體pBI121(購自上海北諾生物科技有限公司） 用限制性內(nèi)切酶Xbal和SacI雙酶切，回收大小約為11. 5kb的骨架載體片段；將大小 為3549bp的Zm-CrylA(h)基因片段與骨架載體片段連接，獲得重組載體，將其命名為 pBI121-ZmCrylA(h) 〇
[0047] 對重組載體pBI121-ZmCrylA(h)進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明：重組載體 pBI121-ZmCrylA(h)為將pBI121載體的Xbal和SacI酶切位點(diǎn)間的DNA替換為序列表中序 列1所示的Zm-CrylA(h)，保持pBI121載體的其他序列不變得到的重組載體。
[0048] 三、重組農(nóng)桿菌的獲得
[0049]取步驟二獲得的重組載體pB1121-ZmCry1A(h)，采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 EHA105 (購自上海北諾生物科技有限公司），獲得含重組載體pBI121-ZmCrylA(h)的根癌農(nóng) 桿菌EHA105,將其命名為EHA105/pBI121-ZmCrylA(h)。
[0050] 取空載體pBI121，采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105,獲得含載體pBI121的根癌 農(nóng)桿菌EHA105,將其命名為EHA105/pBI121。
[0051] 四、轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米的獲得及鑒定
[0052]1、取步驟三獲得的重組農(nóng)桿菌EHA105/pBI121-ZmCrylA(h)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分 別將其轉(zhuǎn)化玉米自交系綜31和18599的幼胚，獲得轉(zhuǎn)基因玉米共19株，分別命名為T-1~ T-19,其中，T-1~T-10為轉(zhuǎn)化玉米自交系綜31得到的轉(zhuǎn)基因植株；T-11~T-19為轉(zhuǎn)化玉 米自交系綜31得到的轉(zhuǎn)基因植株。
[0053] 2、取步驟三獲得的重組農(nóng)桿菌EHA105/pBI121，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化玉米 自交系18599的幼胚，獲得轉(zhuǎn)空載體對照共7株。
[0054] 上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米的具體方法如下：
[0055] 將取步驟三獲得的重組農(nóng)桿菌EHA105/pBI121-ZmCrylA(h)和EHA105/pBI121分 別用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化適齡的玉米幼胚，轉(zhuǎn)化后的幼胚經(jīng)過共培養(yǎng)，再進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)恢復(fù)過 程中開始形成愈傷組織，再進(jìn)行梯度篩選培養(yǎng)：在加有不同濃度選擇壓的草甘膦培養(yǎng)基上 逐步培養(yǎng)，篩選過程中愈傷組織會產(chǎn)生不同程度的褐化現(xiàn)象，挑選沒有褐化的愈傷經(jīng)過繼 續(xù)篩選培養(yǎng)獲得致密的抗性愈傷組織，然后經(jīng)過胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)和分化培養(yǎng)，陸續(xù)分化出 簇狀綠色小苗。小心將小苗分株經(jīng)過促壯培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，約7d左右就長成5-7條新鮮 根，開蓋煉苗l-2d后，移栽進(jìn)溫室營養(yǎng)杯營養(yǎng)土中生長（圖1)，得到轉(zhuǎn)ZmCrylA(h)玉米及 轉(zhuǎn)空載體對照。
[0056] 誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基的制備方法：在MS基本培養(yǎng)基中添加維生素Bilmg/UNAAO.lmg/ L、6-BAlmg/L、肌醇100mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂7g/L、卡那霉素75mg/L和羧芐青霉素 500mg/L，pH5.8。
[0057] 3、PCR檢測
[0058] 分別提取步驟2獲得的轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米及野生型玉米植株（18599)(陰性 對照）的基因組DNA，用Zm-CrylA(h)基因特異引物lAh-F(GACTCGGGAGATCTACACCAAC)和 lAh-R(CGGAAGCAATGATGTTATTGAA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（目的產(chǎn)物大小為 0. 6kb)。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，含有0. 6kb條帶的植株即為陽性，不含有 0.6kb條帶的植株即為陰性。
[0059] 結(jié)果表明：經(jīng)多次重復(fù)PCR檢測，檢測到4株能擴(kuò)增出614bp目標(biāo)條帶的陽性植株 (其中來源于綜31的2株：T-1和T-2 ;來源于18599的2株：T-3和T-4)。部分結(jié)果如圖 2所示。
[0060] 4、RT_PCR檢測
[0061]分別提取按步驟3的PCR方法檢測為陽性的轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米（T-1，T-2和T-3) 及野生型玉米植株（CK)葉片的mRNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-PCR分析。用引物RT-F和RT-R 檢測Zm-CrylA(h)在玉米葉片中的表達(dá)，用引物ACTIN(F)和ACTIN(R)檢測玉米內(nèi)參基因 ACTIN作為對照。引物序列如下：
[0062]RT-F:5, -ATCCTCAACTCGATCACCATCT-3,；
[0063] RT-R :5, -GCTGGAGAGTGTCCTGTAGACC-3,；
[0064]ACTINF1 :5, -AGAAGAAGACCTACACCAAGCC-3,；
[0065]ACTINR1 :5' -TCCCAAGGGTTGTCACATACATC-3'。
[0066] 結(jié)果表明：轉(zhuǎn)Zm-Cry1A(h)玉米株系T-1、T-2和T-3中檢測到高水平的 Zm-CrylA(h)表達(dá)，而野生型玉米植株（CK)中無Zm-CrylA(h)表達(dá)（如圖3所示）。
[0067] 五、轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米的抗蟲性分析
[0068] 取經(jīng)上述PCR和RT-PCR方法檢測Zm-CrylA(h)異源表達(dá)的轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米 T-1、野生型玉米植株（CK)及轉(zhuǎn)空載體對照的植株在大喇叭口期接種玉米螟蟲卵，15天后 通過觀察蟲眼情況，判斷抗蟲性。
[0069] 結(jié)果如圖4所示：轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T-1的葉片上的蟲眼明顯少于野生型植株 的葉片上的蟲眼。說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的Zm-CrylA(h)基因已經(jīng)整合到玉米的基因組中，且功 能表達(dá)正常。轉(zhuǎn)空載體對照和野生型玉米植株的表型無顯著性差異。
[0070] 六、轉(zhuǎn)基因苗的毒蛋白表達(dá)檢測
[0071] 取轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米（T-l、T-2、T-3、T-4)后代種子1粒，研缽中磨成粉末，稱 取200mg左右，放入2mLEP管，加蒸餾水1. 5mL，搖勾浸提8min左右，靜止5min，上清液中 放入抗蟲毒蛋白金標(biāo)免疫試紙條，3min后觀察記載檢測結(jié)果。以野生型玉米植株18599為 陰性對照。
[0072] 檢測結(jié)果如圖5所示：圖5中左側(cè)的1、2、3、4分別是轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T-1、轉(zhuǎn) Zm-CrylA(h)玉米T-2、轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T-3、轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米T-4,右側(cè)的 1、2、3 和4均為陰性對照。與陰性對照相比，轉(zhuǎn)Zm-CrylA(h)玉米（T-l、T-2、T-3、T-4)的試紙條 上均出現(xiàn)了條帶，檢測結(jié)果與田間抗性鑒定及PCR鑒定結(jié)果吻合。說明目的基因整合到玉 米基因組并進(jìn)行了有效的翻譯和表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DNA分子，其是如下1)或2)或3)的DNA分子： 1) 如序列表中序列1所示的DNA分子； 2) 與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98 %或至少具有 99%同源性且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA 分子。
2. 與權(quán)利要求1所述的DNA分子相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B4)中的任一種： B1)含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的表達(dá)盒； B2)含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的重組載體或含有B1)所述表達(dá)盒的重組載體； B3)含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的重組菌或含有B1)所述表達(dá)盒的重組菌或含有B2)所述重組載體的重組菌； B4)含有權(quán)利要求1所述的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系或含有B1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn) 基因植物細(xì)胞系或含有B2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
3. 權(quán)利要求1所述的DNA分子或權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗蟲性中 的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲為玉米螟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為單子葉植物或雙子葉植 物。
6. 權(quán)利要求1所述的DNA分子或權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料在培育抗蟲性轉(zhuǎn)基因 植物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述蟲為玉米螟。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為單子葉植物或雙子葉植 物。
9. 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向出發(fā)植物中導(dǎo)入權(quán)利要求1所述的DNA分子得 到抗蟲性高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物的步驟。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述蟲為玉米螟；所述出發(fā)植物為單子 葉植物或雙子葉植物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗蟲基因Zm-Cry1A(h)及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。本發(fā)明的抗蟲基因Zm-Cry1A(h)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。通過試驗(yàn)證明：將本發(fā)明的Zm-Cry1Ah基因?qū)胗衩缀螳@得的轉(zhuǎn)Zm-Cry1Ah玉米，其抗蟲性明顯高于野生型玉米植株。本發(fā)明為提高植物的抗蟲性提供了新的基因，對培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，尤其是玉米，具有重要意義。
【IPC分類】C12N15-32, C12N15-82, A01H5-00
【公開號】CN104711268
【申請?zhí)枴緾N201510137679
【發(fā)明人】余桂容, 曹穎, 杜文平, 宋軍, 陳謙, 徐利遠(yuǎn)
【申請人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年3月26日