一種檢測蛹蟲草菌絲體中腺苷和蟲草素的含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測蛹蟲草菌絲體中腺苷和蟲草素的含量的方法，特別涉及一種 利用高效液相色譜同時(shí)測定超聲處理過的蛹蟲草濕菌絲體中腺苷和蟲草素的含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛹蟲草（Cordyceps militaries)又名北蟲草，在我國分布廣泛，蛹蟲草作為藥食 兩用真菌已被選入食品新資源目錄。近年來，人們已經(jīng)從蛹蟲草子實(shí)體及菌絲中分離得到 多種生物活性物質(zhì)，主要有腺苷、蟲草素、蟲草多糖、D-甘露醇、S0D酶、留醇類等成分，具有 抗炎、抗氧化，抗腫瘤、抗癌、提高免疫力等多種生理功能。研究顯示蛹蟲草中的腺苷、蟲草 素等有效成分的含量與野生冬蟲夏草相當(dāng)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前，蛹蟲草人工培育技術(shù)已較為成熟，根據(jù)培養(yǎng)方式的不同可分為固體栽培和 液體發(fā)酵兩種，與固體栽培相比，液體發(fā)酵具有周期短、工藝簡單、不易污染、菌絲體產(chǎn)量大 等優(yōu)點(diǎn)。作為蛹蟲草質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)，腺苷和蟲草素成為蛹蟲草菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)的重 要指示性物質(zhì)，因此，快速、有效的檢測方法對于指導(dǎo)蛹蟲草液體發(fā)酵工藝研究具有重要的 意義。
[0004]目前，腺苷和蟲草素含量是利用高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等方法來檢測的，而蛹 蟲草濕菌絲中腺苷和蟲草素含量的測定普遍是采用檢測干菌絲中兩種成分含量來實(shí)現(xiàn)的， 在濕菌絲干燥過程存在耗時(shí)長、耗能多、成分易于變化等缺點(diǎn)。如牛雙等人對蛹蟲草菌絲 體中腺苷測定（NIU Shuang，GA0 Xiang, AN Jin_shuang，GU0 Jing-jing，TENG Li_rong，LU Jia-hui. Optimization of the Water Extraction Technique of Cordyceps militaris Mycelium Adenosine via Response Surface Methodology[J]. Li Shizhen Medicine and Medical Research. 2009, 20 (2) : 323-324.)中采用真空冷凍干燥作為樣品前處理，只測定 了腺苷一種組分，不能同時(shí)檢測腺苷、蟲草素，且此方法耗時(shí)耗能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測蛹蟲草菌絲體中腺苷和蟲草素的含量的方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測蛹蟲草菌絲體中腺苷和/或蟲草素的含量的方法，具體可包 括如下步驟：
[0007] (1)將蛹蟲草菌絲體反復(fù)凍融后進(jìn)行水浴超聲，以超聲后濾液作為待測樣品；
[0008] (2)將步驟（1)獲得的待測樣品，以及腺苷和/或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，在相同條 件下分別進(jìn)行高效液相色譜檢測，根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算得到所述待測樣品中的腺苷和/或蟲 草素的含量。
[0009] 在所述方法的步驟（1)中，所述反復(fù)凍融的次數(shù)可為1-3次(如2-3次）；1次所述 凍融為：液氮中冷凍20-30min，轉(zhuǎn)至50-60°C解凍10_15min。進(jìn)一步，對于蟲草素，所述反 復(fù)凍融的次數(shù)以2-3次更佳。
[0010] 在所述方法的步驟（1)中，所述水浴超聲的條件為35-45KHZ(如40KHZ)持續(xù)超聲， 溫度可為30-50°C (如40-50°C)，時(shí)間可為2-4h。進(jìn)一步，對于腺苷，所述溫度以40-50°C 更佳。
[0011] 在所述方法的步驟（2)中，所述高效液相色譜的條件如下：色譜柱可為C18色譜 柱；流動相為甲醇和水按照體積比為（10-20) : (80-90)(如15:85)的比例混合而成的溶液； 洗脫方式為單一流動相洗脫，洗脫時(shí)間為15min。
[0012] 在本發(fā)明中，所述色譜柱為 Klomasail C18 (150mmX4. 6mm5 u m particle size) 色譜柱。更加具體的，為瑞典AKZO NOBEL公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為EH04713。
[0013] 進(jìn)一步，步驟（2)中，所述高效液相色譜的流速可為lmL/min，進(jìn)樣量可為20iiL， 柱溫可為25 °C。
[0014] 在所述方法的步驟（1)中，所述蛹蟲草菌絲體具體是按照如下方法獲得：將蛹蟲 草發(fā)酵液1600-1800g (如1700g)離心15-20min，棄上清，獲得所述蛹蟲草菌絲體。
[0015] 所述蛹蟲草發(fā)酵液是將所述蛹蟲草菌絲體的種子液(菌體濃度為lg/l〇〇mL，菌絲 質(zhì)量/菌液體積)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)后獲得的。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其 濃度如下：蔗糖70g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母浸提物30g/L、豆餅粉15g/L、K2HP04，3H202g/ L、MgS04?7H201g/L ;pH為7。所述培養(yǎng)為25°C 200r/min振蕩培養(yǎng)7天。所述接種的比例 為：所述蛹蟲草菌絲體的種子液為所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的5%。
[0016] 所述蛹蟲草菌絲體的種子液是按照如下方法獲得的：將蛹蟲草的菌種接種于種子 培養(yǎng)基，培養(yǎng)后獲得的。所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：葡萄糖l〇g/L、酵 母粉10g/L、K2HP04 ? 3H200.5g/L、KH2P040.5g/L、MgS04? 7H200.5g/L;pH 為 7。所述培養(yǎng)為 25°C 200r/min振蕩培養(yǎng)3天。
[0017] 在所述方法的步驟（1)中，在將所述蛹蟲草菌絲體進(jìn)行所述反復(fù)凍融后，所述水浴 超聲前，還包括向所述蛹蟲草菌絲體中加水的步驟，加水量為每8-10mL所述蛹蟲草發(fā)酵液 中獲得的所述蛹蟲草菌絲體中加水40mL。
[0018] 在所述方法的步驟（2)中，所述超聲后濾液按照如下方法獲得：將超聲后液體離 心(如1700g離心20min)后取上清用0. 45 ii m過濾膜過濾，所得濾液即為所述超聲后濾液。[0019] 在所述方法的步驟（2)中，所述腺苷和/或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為腺苷和/或蟲 草素標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液。
[0020] 進(jìn)一步，所述腺苷和/或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品具體可為如下任一種：
[0021] (1)腺苷標(biāo)準(zhǔn)品；(所述方法為檢測蛹蟲草菌絲體中腺苷的含量的方法時(shí)）
[0022] (2)蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品；(所述方法為檢測蛹蟲草菌絲體中蟲草素的含量的方法時(shí)）
[0023] (3)腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的混合物；(所述方法為同時(shí)檢測蛹蟲草菌絲體中 腺苷和蟲草素的含量的方法時(shí)）
[0024] 更加具體的，在本發(fā)明中，所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為 A925 ;所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為C33941。
[0025] 在所述方法的步驟（2)中，所述"將步驟（1)獲得的待測樣品，以及腺苷和/或蟲 草素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，在相同條件下分別進(jìn)行高效液相色譜檢測，根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算得到所 述待測樣品中的腺苷和/或蟲草素的含量"，具體可為：
[0026] A1)將系列濃度的所述腺苷和/或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液按照如上所述條件進(jìn)行高 效液相色譜檢測，以所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐 標(biāo)，繪制腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；將步驟（1)獲得的待測樣品按照如上所述條件進(jìn)行高效液相色譜 檢測，將與所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時(shí)間的色譜峰的峰面積帶入所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到 所述待測樣品中的腺苷的含量；和/或
[0027] A2)將系列濃度的所述腺苷和/或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液按照如上所述條件進(jìn)行高 效液相色譜檢測，以所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為 縱坐標(biāo)，繪制蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線；將步驟（1)獲得的待測樣品按照如上所述條件進(jìn)行高效液 相色譜檢測，將與所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時(shí)間的色譜峰的峰面積帶入所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn) 曲線，得到所述待測樣品中的蟲草素的含量。
[0028] 在如上A1)和A2)中，繪制所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線和所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，橫縱坐標(biāo) 可以互換。
[0029] 在如上A1)和A2)中，所述系列濃度的所述腺苷和/或蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的溶液具體 為：溶劑為水，溶質(zhì)為等質(zhì)量的所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和所述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，所述腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和所 述蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度均為9 y g/mL、18 y g/mL、27 y g/mL、36 y g/mL、45 y g/mL。
[0030] 在本發(fā)明中，所述蛹蟲草具體為蛹蟲草菌株CM-jd。
[0031] 本發(fā)明所提供的檢測蛹蟲草菌絲體中腺苷和蟲草素的含量的方法，與現(xiàn)有方法相 比不需要對液體發(fā)酵培養(yǎng)的濕菌絲進(jìn)行干燥處理，可同時(shí)測定菌絲體中腺苷和蟲草素含 量，測得腺苷的線性范圍為2-50 y g/mL，蟲草素的線性范圍為3-50 y g/mL，腺苷和蟲草素 的檢出限分別為1. 1 U g/mL、2. g/mL，兩種成分的回收率分別為94%-100%、99%_103%。該 方法具有省時(shí)、節(jié)能、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品混合物的HPLC色譜圖。其中，峰1為腺苷標(biāo)準(zhǔn) 品(保留時(shí)間為5. 314min)，峰2為