一種利用益生菌發(fā)酵海洋生物加工下腳料制備降血壓肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用益生菌發(fā)酵海洋生物加工下腳料制備降血壓肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是種困擾全球的慢性心血管疾病，潛伏期長，并發(fā)癥多，需要長期的藥物治療才能控制病情的發(fā)展。人工合成的降血壓藥物雖然療效顯著，但在臨床應(yīng)用的過程中產(chǎn)生了多種副作用。然而，存在于天然動植物資源中的降血壓功能因子，具有安全有效、無毒副作用等特點(diǎn)，在國內(nèi)外得到了廣泛的關(guān)注。其中，降血壓肽已成為了當(dāng)今高血壓防治研宄中的一個(gè)熱點(diǎn)。大量基于降血壓肽構(gòu)效關(guān)系的研宄表明，高活性降血壓肽主要是分子量小于IkDa的低聚肽，其氨基酸序列中通常含有脯氨酸和羥脯氨酸殘基。膠原蛋白的氨基酸序列中含高達(dá)15-25%的脯氨酸和羥脯氨酸殘基，是潛在的制取高活性降血壓肽的優(yōu)質(zhì)蛋白。我國海域遼闊，海洋生物豐富，其在加工過程中產(chǎn)生了大量的富含膠原蛋白的下腳料，如魚皮、魷魚皮、魚鰾、魚鱗等，為高活性降血壓肽的產(chǎn)業(yè)化制備提供了豐富的自然資源。
[0003]目前，降血壓肽主要是通過酶水解蛋白的方法制得，可采用單酶或復(fù)合酶，可以是一步或多步水解，但是產(chǎn)物的降血壓活性和制備效率較低。然而，植物乳桿菌、干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌等益生菌，能夠分泌特異性的胞外蛋白酶，定向水解基質(zhì)中的蛋白產(chǎn)生高活性降血壓肽，從而對人體產(chǎn)生降血壓作用；此外，這類益生菌的特定代謝產(chǎn)物，如肽聚糖，也具有顯著的降血壓作用。因此，具有降血壓作用的益生菌已成為了當(dāng)今高血壓防治研宄中的另一個(gè)熱點(diǎn)。這類益生菌為定向水解蛋白制備高活性降血壓肽提供了潛在的特異性胞外酶。
[0004]目前，利用海洋生物加工下腳料制備降血壓肽主要是采用酶法水解的技術(shù)路線；此外，利用益生菌發(fā)酵制備降血壓肽主要是采用乳蛋白作為水解蛋白。如何增強(qiáng)高活性降血壓低聚肽的制備效率是一個(gè)亟待解決的問題，其中，蛋白和酶的選擇以及技術(shù)方案的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵技術(shù)。目前，還未見到以富含膠原蛋白的海洋生物加工下腳料為原料、采用蛋白酶液化和益生菌發(fā)酵相結(jié)合的技術(shù)方案來制備降血壓肽的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種以富含膠原蛋白的海洋生物加工下腳料為原料、采用蛋白酶液化和益生菌發(fā)酵相結(jié)合的技術(shù)方案來制備降血壓肽的方法。該方法的原料選取科學(xué)，工藝合理有效，制備效率高，開創(chuàng)了一新的工藝路線，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種利用益生菌發(fā)酵海洋生物加工下腳料制備降血壓肽的方法，其是以魚皮、魷魚皮、魚鰾或魚鱗等富含膠原蛋白的海洋生物加工下腳料為原料，經(jīng)清洗后進(jìn)行打漿處理，加熱滅除微生物，冷卻后加入蛋白酶進(jìn)行液化處理，滅酶后加入葡萄糖得初始發(fā)酵液，然后放入發(fā)酵罐，滅菌后接種益生菌液體發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后濾去殘?jiān)?，在發(fā)酵濾液中加入冷凍保護(hù)劑，經(jīng)冷凍干燥直接得到含活性益生菌與活性肽的復(fù)合降血壓生物制劑；另外，發(fā)酵濾液還可經(jīng)進(jìn)一步管式膜除雜、超濾膜截留分級、納濾膜濃縮脫鹽后，通過噴霧干燥或冷凍干燥得到降血壓肽制品。
[0007]所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一種或多種，其用量為海洋生物重量的I?10%。。
[0008]所述的益生菌液體發(fā)酵劑是將益生菌種按重量百分?jǐn)?shù)0.01?I %接入滅菌的初始發(fā)酵液中37?42°C恒溫?fù)u床密封培養(yǎng)2?4天而成，接種量是初始發(fā)酵液體積百分?jǐn)?shù)的0.1?10%，益生菌種為植物乳桿菌、以及干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中的一種或多種。
[0009]本發(fā)明科學(xué)合理的選取魚皮、魷魚皮、魚鰾或魚鱗等海洋生物的加工下腳料為原料，其所富含的膠原蛋白是富含高活性降血壓肽特征性序列的優(yōu)質(zhì)蛋白；所用的植物乳桿菌等具有降血壓作用的益生菌，能夠分泌定向水解蛋白產(chǎn)生高活性降血壓肽的特異性胞外蛋白酶；采用蛋白酶初步液化處理，提高了益生菌后續(xù)發(fā)酵制備降血壓肽的效率。發(fā)酵后，可在發(fā)酵液中加入冷凍保護(hù)劑，經(jīng)冷凍干燥直接得到復(fù)合降血壓生物制劑，該制劑富含高活性降血壓低聚肽、活性益生菌、降血壓肽聚糖等益生菌代謝產(chǎn)生的其它功能因子，該制劑還保留了海洋生物加工下腳料中天然存在的其它功能因子；另外，發(fā)酵液還可進(jìn)一步采用膜過濾純化后，通過噴霧干燥或冷凍干燥得到降血壓肽制品。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了高活性降血壓低聚肽的高效定向制備，開創(chuàng)了一新的工藝路線，所得的復(fù)合降血壓生物制劑和降血壓肽制品具有較好的應(yīng)用前景和社會經(jīng)濟(jì)效益，并且提高了海洋生物加工下腳料的附加值。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0011]實(shí)施例1
[0012]一種利用益生菌發(fā)酵魚皮制備降血壓肽的方法，其具體工藝步驟如下:
[0013]a.原料的選取與預(yù)處理:選取1kg鮮魚皮，清水洗凈后撈出瀝干水分，加入100L的純凈水后使用打漿機(jī)進(jìn)行打漿處理，得漿狀物；
[0014]b.蛋白酶液化:將所得的漿狀物加熱至中心溫度達(dá)到100°C，保持lOmin，滅除微生物，冷卻到50°C，用HCl調(diào)節(jié)pH到5.2，加入50g木瓜蛋白酶進(jìn)行液化處理2h后，將液化液加熱至中心溫度達(dá)到100°C，保持lOmin，滅除酶活，得滅酶液化液；
[0015]c.初始發(fā)酵液的制備:在所得的滅酶液化液中，加入2kg葡萄糖，用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，得初始發(fā)酵液；
[0016]d.益生菌發(fā)酵:將初始發(fā)酵液放入空消發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)消，空消和實(shí)消的條件均為121°C、20min，待罐溫降至37°C，接入2L益生菌液體發(fā)酵劑，該液體發(fā)酵劑是將植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌均按重量百分?jǐn)?shù)I %接入滅菌的初始發(fā)酵液中37°C恒溫?fù)u床密封培養(yǎng)3天而成，該接種混合液在37°C和150rpm攪拌轉(zhuǎn)速的條件下密封發(fā)酵4天，發(fā)酵液濾去殘?jiān)?，得發(fā)酵濾液；
[0017]e.降壓肽的粗制:在所得的發(fā)酵濾液中加入5%海藻糖、3%麥芽糊精、1%甘油等冷凍保護(hù)劑，_50°C預(yù)凍2h，然后在_50°C冷阱溫度和10Pa真空度的條件下冷凍干燥48h，粉碎成粉，直接得到含活性益生菌與活性肽的復(fù)合降血壓生物制劑。
[0018]本復(fù)合降血壓生物制劑富含高活性降血壓低聚肽、活性益生菌、降血壓肽聚糖等益生菌代謝產(chǎn)生的其它功能因子，該制劑還保留了魚皮中天然存在其它功能因子，功能、營養(yǎng)、口感和風(fēng)味俱佳。
[0019]實(shí)施例2
[0020]一種利用益生菌發(fā)酵魷魚皮制備降血壓肽的方法，其具體工藝步驟如下:
[0021]a.原料的選取與預(yù)處理:選取1kg鮮魷魚皮，清水洗凈后撈出瀝干水分，加入100L的純凈水后使用打漿機(jī)進(jìn)行打漿處理，得漿狀物；
[0022]b.蛋白酶液化:將所得的漿狀物加熱至中心溫度達(dá)到95°C，保持lOmin，滅除微生物，冷卻到55°C，加入50g風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行液化處理2h后，將液化液加熱至中心溫度達(dá)到95°C，保持lOmin，滅除酶活，得滅酶液化液；
[0023]c.初始發(fā)酵液的制備:在所得的滅酶液化液中，加入Ikg葡萄糖，調(diào)節(jié)pH到7.0，得初始發(fā)酵液；
[0024]d.益生菌發(fā)酵:將初始發(fā)酵液放入空消發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)消，空消和實(shí)消的條件均為121 °C、20min，待罐溫降至37°C，接入IL益生菌液體發(fā)酵劑，該液體發(fā)酵劑是將植物乳桿菌按重量百分?jǐn)?shù)I %接入滅菌的初始發(fā)酵液中37°C恒溫?fù)u床密封培養(yǎng)4天而成，該接種混合液在37°C和200rpm攪拌轉(zhuǎn)速的條件下密封發(fā)酵4天，發(fā)酵液濾去殘?jiān)?，得發(fā)酵濾液；
[0025]e.降壓肽的純化:將所得的發(fā)酵濾液采用孔徑為0.2um的管式膜脫除大分子，然后采用截留分子量為3kDa的超濾膜截留分級，截留液采用納濾膜濃縮脫鹽，然后在180°C進(jìn)風(fēng)溫度、80°C出風(fēng)溫度和0.4MPa噴霧壓力的條件下噴霧干燥，得到