一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，經(jīng)過(guò)蟲(chóng)草菌種的篩選、馴化，得到性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株，通過(guò)液體逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和分離培養(yǎng)，采用一定的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及分離培養(yǎng)基配方等，并在培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)一定的溫差及光照刺激、分離培養(yǎng)方法等工藝，得到無(wú)需進(jìn)行提純和深加工的固體活性蟲(chóng)草菌絲體，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出現(xiàn)有人工制備蟲(chóng)草菌絲體的含量，更加適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而且本發(fā)明所制備的蟲(chóng)草菌絲體可不經(jīng)加工直接食用，最大限度的保留了蟲(chóng)草菌絲體的生物活性，且具有氣味清香、口感好、食用便捷和藥用保健功效高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及保健食品生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們生活水平的日益提高，社會(huì)活動(dòng)頻率的不斷加快，社會(huì)各界成功人士和廣大中青年工作者負(fù)荷進(jìn)一步加大，中老年人和部分少年兒童急需改善和增強(qiáng)體質(zhì)，為此研制高級(jí)天然營(yíng)養(yǎng)保健食品成為一個(gè)急待開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域。
[0003]冬蟲(chóng)夏草為我國(guó)具有悠久藥用歷史的滋補(bǔ)強(qiáng)壯名貴中藥，近代藥理藥化研究表明其含有腺苷、甘露醇及人體必須的18種氨基酸和富含多種有益于身體健康的微量元素，具有降血脂、防治動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張血管、保護(hù)心腦組織、鎮(zhèn)靜安神、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、提高免疫功能、抑制小鼠艾氏腹水癌、抗炎、抗菌、耐缺氧的良好作用。
[0004]由于天然蟲(chóng)草有其嚴(yán)格的寄生性及特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，加之近年來(lái)生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞，天然蟲(chóng)草資源銳減，價(jià)格猛漲。隨著人民生活水平的不斷提高，對(duì)蟲(chóng)草的需求量正日益增大，因此，人工培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體替代天然蟲(chóng)草成為當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，蟲(chóng)草菌絲體中大部分有效成分的含量基本與天然冬蟲(chóng)夏草相同，蟲(chóng)草菌絲體同樣具有提高人體免疫力、抗疲勞、預(yù)防心腦血管疾病及抗腫瘤等多種促進(jìn)人體健康的功能，產(chǎn)品保健功效顯著，是天然冬蟲(chóng)夏草理想的替代品，有廣闊的發(fā)展前景。 [0005]但是，目前蟲(chóng)草菌絲體難以工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，目前所公開(kāi)的人工蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中一方面普遍具有菌絲體含量低的缺點(diǎn)，菌絲體與培養(yǎng)基的質(zhì)量比約為1: 61，且含量不穩(wěn)定；另一方面普遍存在蟲(chóng)草菌絲體與培養(yǎng)基不易完全分離，且分離的工藝方法非常復(fù)雜，一方面影響蟲(chóng)草菌絲體的生物活性，另一方面影響蟲(chóng)草菌絲體的純度和口感，且大大增加蟲(chóng)草菌絲體的生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)一般蟲(chóng)草菌絲體制備方法的不足，提供一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，本發(fā)明經(jīng)過(guò)將含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行一定條件的分離培養(yǎng)，使蟲(chóng)草菌絲體在生長(zhǎng)過(guò)程中自然與分離培養(yǎng)基分離，從而得到純的固體活性蟲(chóng)草菌絲體，省略一般蟲(chóng)草菌絲體人工制備中的分離純化工藝，降低生產(chǎn)成本，更加適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，而且最大可能的保留并提高蟲(chóng)草菌絲體的生物活性，提高產(chǎn)品的藥用保健功效。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，通過(guò)在對(duì)蟲(chóng)草菌種的篩選、馴化過(guò)程中采取一定的溫差及光照刺激培養(yǎng)，得到優(yōu)良的，性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌種，有利于蟲(chóng)草菌種的后期培養(yǎng)。
[0008]本發(fā)明的又一個(gè)目的是，通過(guò)在蟲(chóng)草菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)液中添加一定的微量元素，使蟲(chóng)草菌絲體的產(chǎn)量得到大幅度提高。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案為:[0010]一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，包括以下步驟:
[0011]將含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物低溫出罐后分裝到裝有一定分離培養(yǎng)基的分裝器皿中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)至有蟲(chóng)草菌絲體長(zhǎng)出并與所述分離培養(yǎng)基分離，其中所述分離培養(yǎng)基包含下列重量份的組分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及無(wú)菌水800-1200 ；
[0012]此外，還包括以下步驟:
[0013]步驟一、蟲(chóng)草菌種的篩選，將蟲(chóng)草菌絲接種于蠶蛹，通過(guò)自然培育法進(jìn)行培育，在經(jīng)過(guò)一定條件的溫差和光照刺激后，選取優(yōu)良蟲(chóng)草菌株作為蟲(chóng)草菌種，并將蟲(chóng)草菌種繼續(xù)培養(yǎng)至孢子成熟；
[0014]步驟二、蟲(chóng)草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲(chóng)草菌種的子囊部位組織懸于裝有一定濃度生理鹽水的組織培養(yǎng)瓶頂部，進(jìn)行一定條件的光照培養(yǎng)后將生理鹽水轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株；
[0015]步驟三、發(fā)酵培養(yǎng)，將所得到的性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種發(fā)酵罐進(jìn)行一定時(shí)間的變溫好氧發(fā)酵，得到含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物。[0016]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，步驟三中發(fā)酵所用培養(yǎng)基包含下列重量份的組分:土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖20-30及無(wú)菌水800-1200 ；
[0017]所述變溫好氧發(fā)酵的發(fā)酵條件為:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培養(yǎng)2_3天后，繼續(xù)于18-19度培養(yǎng)1-2天，然后于19-21度培養(yǎng)3_5天。
[0018]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，步驟四中所述發(fā)酵產(chǎn)物與分離培養(yǎng)基的重量比為1: 13-18，所述分裝器皿的裝量為總?cè)莘e的16-18%，分裝完成后于20-24度進(jìn)行暗培養(yǎng)35-40天。
[0019]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，步驟一中所述蟲(chóng)草菌絲通過(guò)以下方法得到:切取蟲(chóng)草菌株子囊部位組織，將其進(jìn)行外部消毒處理后，加入到裝有少量無(wú)菌0.5-1%葡萄糖培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)瓶中，于22-24度進(jìn)行組織分離培養(yǎng)3-7天后，經(jīng)過(guò)分離得到蟲(chóng)草菌絲。
[0020]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，步驟一中所述自然培育法包括以下步驟:
[0021]步驟一，將蟲(chóng)草菌絲接種于蠶蛹，將接種蟲(chóng)草菌絲的蠶蛹進(jìn)行變溫培養(yǎng)，所述變溫培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度順次為:12-14度培養(yǎng)2-3天，14-16度培養(yǎng)1_2天，18-19度培養(yǎng)1_2天，
19-21度培養(yǎng)至蠶蛹僵化且有菌絲長(zhǎng)出蠶蛹；
[0022]步驟二、將長(zhǎng)出菌絲的蠶蛹進(jìn)行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養(yǎng)2-7天，設(shè)定濕度為60-70度，溫度變化率為1-2度/小時(shí)。
[0023]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，所述自然培育法的步驟二中，在進(jìn)行溫度刺激培養(yǎng)至菌絲呈一定的團(tuán)球狀時(shí)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行不低于200勒克斯的光照刺激。
[0024]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，步驟二中所述光照培養(yǎng)方法為26-30度光照培養(yǎng)30-40小時(shí)；所述液體培養(yǎng)方法為將所述生理鹽水接種于含有全麥汁的試管中，于17-19度培養(yǎng)2-5天。
[0025]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，可將得到的性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進(jìn)行保存，所述固體斜面采用全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基制成，保存溫度為3-4度。
[0026]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，所述性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進(jìn)行保存后，在使用前需對(duì)菌株進(jìn)行菌株活化，所述菌株活化的方法為:將接種有性狀穩(wěn)定的菌株的固體斜面于16-18度放置1-2小時(shí)后，將菌株轉(zhuǎn)接至麥汁營(yíng)養(yǎng)液中，于16-18度培養(yǎng)2-4天。
[0027]優(yōu)選的是，所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，步驟三中所述逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)方法為:將性狀穩(wěn)定的菌株逐級(jí)轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行液體搖床培養(yǎng)，每級(jí)轉(zhuǎn)接擴(kuò)培比例小于或等于40倍，其中所述營(yíng)養(yǎng)液包括下列重量份的組分:土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無(wú)菌水800-1200 ;其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1-3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。[0028]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，通過(guò)將含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行一定條件的分離培養(yǎng)，使蟲(chóng)草菌絲體在生長(zhǎng)過(guò)程中自然與分離培養(yǎng)基分離，從而得到純的固體活性蟲(chóng)草菌絲體，得到無(wú)需進(jìn)行提純和深加工的固體活性蟲(chóng)草菌絲體,節(jié)省了一般方法中對(duì)蟲(chóng)草菌絲體進(jìn)行提純和加工的生產(chǎn)成本，且其蟲(chóng)草菌絲體含量達(dá)95 %以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出現(xiàn)有人工制備蟲(chóng)草菌絲體的含量，避免了一般的人工培養(yǎng)蟲(chóng)草菌絲體含量低且不穩(wěn)定的不足，而且最大可能的保留并提高蟲(chóng)草菌絲體的生物活性，提高了產(chǎn)品的藥用保健功效，其生物活性比一般人工制備的蟲(chóng)草菌絲體的生物活性提高30%以上，且具有氣味清香、口感好、食用便捷和藥用保健功效高等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0029]另外，通過(guò)在對(duì)蟲(chóng)草菌種的篩選、馴化過(guò)程中采取一定的溫差及光照刺激培養(yǎng)，得到優(yōu)良的，形態(tài)穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌種，有利于蟲(chóng)草菌種的后期培養(yǎng)，尤其是通過(guò)在蟲(chóng)草菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)液中添加一定的微量元素組合物，使蟲(chóng)草菌絲體的產(chǎn)量得到大幅度提高，其產(chǎn)量比目前一般人工制備蟲(chóng)草菌絲體的方法提高20-30%。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為本發(fā)明所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法流程圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖1對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參閱本說(shuō)明書后能夠據(jù)以實(shí)施。
[0032]如圖1所示，一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，包括以下步驟:
[0033]步驟一、蟲(chóng)草菌種的篩選。選取優(yōu)良的新鮮冬蟲(chóng)夏草菌株，切取蟲(chóng)草菌株子囊部位組織，將其進(jìn)行外部消毒處理后，加入到底部裝有少量無(wú)菌0.5-1%葡萄糖培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)瓶中，于22-24度進(jìn)行組織分離培養(yǎng)3-7天后，經(jīng)過(guò)離心等分離方法分離得到蟲(chóng)草菌絲。將蟲(chóng)草菌絲接種于蠶蛹，在生物培養(yǎng)箱中設(shè)定一定的培養(yǎng)條件，通過(guò)自然培育法進(jìn)行培育，在經(jīng)過(guò)一定的溫差和光照刺激的培育后，選取優(yōu)良蟲(chóng)草菌株作為蟲(chóng)草菌種，并將蟲(chóng)草菌種繼續(xù)培養(yǎng)至孢子成熟。[0034]其中所述自然培育法具體為:將接種有蟲(chóng)草菌絲的蠶蛹在生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行變溫培養(yǎng)，所述變溫培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度順次為:12-14度培養(yǎng)2-3天，14-16度培養(yǎng)1_2天，18-19度培養(yǎng)1-2天，19-21度培養(yǎng)至蠶蛹僵化且有菌絲長(zhǎng)出蠶蛹，將長(zhǎng)出菌絲的蠶蛹進(jìn)行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養(yǎng)2-7天，設(shè)定濕度為60-70度，溫度變化率為1_2度/小時(shí)，既通過(guò)設(shè)定生化培養(yǎng)箱的參數(shù)，使培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度從13度開(kāi)始以每小時(shí)上升I度的速度升至20-21度后，按照該速度逐漸下落到13度，并按照此規(guī)律循環(huán)變動(dòng)進(jìn)行梯度溫度變化刺激，當(dāng)培養(yǎng)至菌絲呈一定的團(tuán)球狀時(shí)，肉眼辨別為接種蟲(chóng)草菌絲處出現(xiàn)直徑約0.2-1毫米的凸起時(shí)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行不低于200勒克斯的光照刺激，并繼續(xù)培養(yǎng)至形成子實(shí)體，選擇優(yōu)良的菌株，待其孢子成熟后進(jìn)行蟲(chóng)草菌種的馴化。
[0035]步驟二、蟲(chóng)草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲(chóng)草菌種的子囊部位組織用解剖刀切下，懸于裝有0.5-1%濃度生理鹽水的組織培養(yǎng)瓶頂部，進(jìn)行一定條件的光照培養(yǎng)后將生理鹽水轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到性狀穩(wěn)定蟲(chóng)草菌株，其中所述光照培養(yǎng)方法為26-30度光照培養(yǎng)30-40小時(shí)；所述液體培養(yǎng)方法為將所述生理鹽水接種于含有全麥汁的試管中，于17-19度培養(yǎng)2-5天，全麥汁優(yōu)選濃度為10-12%的全大麥麥汁。
[0036]步驟三、發(fā)酵培養(yǎng)，將所得到的性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種發(fā)酵罐進(jìn)行一定時(shí)間的變溫好氧發(fā)酵，得到含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物。其中所述逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)方法為:將性狀穩(wěn)定的菌株逐級(jí)轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行液體搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為16-19度，每級(jí)轉(zhuǎn)接擴(kuò)培比例小于或等于40倍，所述營(yíng)養(yǎng)液包括下列重量份的組分:土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無(wú)菌水800-1200 ;其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1_3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。
[0037]發(fā)酵所用的培養(yǎng)基 包含下列重量份的組分:土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖
20-30及無(wú)菌水800-1200。所述變溫好氧發(fā)酵的發(fā)酵條件為:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培養(yǎng)2-3天后，繼續(xù)于18-19度培養(yǎng)1-2天，然后于19-21度培養(yǎng)3_5天，然后低溫出罐。
[0038]步驟四、分離培養(yǎng)，將發(fā)酵產(chǎn)物低溫出罐后分裝到裝有一定分離培養(yǎng)基的分裝器皿中進(jìn)行暗培養(yǎng)，待蟲(chóng)草菌絲體與所述分離培養(yǎng)基分離后進(jìn)行采收，其中所述分離培養(yǎng)基包括下列重量份的組分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及無(wú)菌水800-1200。所述發(fā)酵產(chǎn)物與分離培養(yǎng)基的重量比為1: 13-18，所述分裝器皿的裝量為總?cè)莘e的16-18%，分裝完成后于20-24度在無(wú)菌間進(jìn)行暗培養(yǎng)35-40天，待蟲(chóng)草菌絲體與分離培養(yǎng)基有效分離后，將蟲(chóng)草菌絲體采收，并在無(wú)菌環(huán)境下自然低溫晾干。
[0039]所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法中，也可將得到的性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進(jìn)行保存，所述固體斜面采用全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基加瓊脂制作而成，保存溫度為3-4度。在接種使用前需對(duì)固體斜面保存的菌株進(jìn)行菌株活化，所述菌株活化的方法為:將接種有性狀穩(wěn)定的菌株的固體斜面于16-18度放置1-2小時(shí)后，將菌株轉(zhuǎn)接至麥汁營(yíng)養(yǎng)液中，于16-18度培養(yǎng)2-4天，得到活化復(fù)壯的蟲(chóng)草菌株。
[0040]實(shí)施例1
[0041]選取優(yōu)良的新鮮冬蟲(chóng)夏草菌株，切取蟲(chóng)草菌株子囊部位組織，將其進(jìn)行外部消毒處理后，加入到底部裝有少量無(wú)菌1%葡萄糖培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)瓶中，于22-24度進(jìn)行組織分離培養(yǎng)3-7天后，經(jīng)過(guò)離心等分離方法分離得到蟲(chóng)草菌絲。選取優(yōu)質(zhì)蠶蛹，將蟲(chóng)草菌絲接種于蠶蛹，在生物培養(yǎng)箱中設(shè)定一定的培養(yǎng)條件，通過(guò)自然培育法進(jìn)行培育，培養(yǎng)溫度順次為13度2天，14度I天，19度一天，20度培養(yǎng)至蠶蛹僵化且有菌絲長(zhǎng)出蠶蛹，將長(zhǎng)出菌絲的蠶蛹進(jìn)行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養(yǎng)2-7天，設(shè)定濕度為60-70度，溫度變化率為1-2度/小時(shí)，既通過(guò)設(shè)定生化培養(yǎng)箱的參數(shù)，使培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度從13度開(kāi)始以每小時(shí)上升I度的速度升至20-21度后，按照該速度逐漸下落到13度，并按照此規(guī)律循環(huán)變動(dòng)進(jìn)行梯度溫度變化刺激，當(dāng)培養(yǎng)至菌絲呈一定的團(tuán)球狀時(shí)，肉眼辨別為接種蟲(chóng)草菌絲處出現(xiàn)直徑約0.2-1毫米的凸起時(shí)，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行不低于200勒克斯的光照刺激，并繼續(xù)培養(yǎng)至形成子實(shí)體，選擇優(yōu)良的菌株，待其孢子成熟后進(jìn)行蟲(chóng)草菌種的馴化。
[0042]蟲(chóng)草菌種的馴化方法為，將孢子成熟的蟲(chóng)草菌種的子囊部位組織用解剖刀切下，懸于裝有0.75%濃度生理鹽水的組織培養(yǎng)瓶頂部，28度光照培養(yǎng)36小時(shí)后將生理鹽水轉(zhuǎn)接含有10-12%的全大麥麥汁的試管中，于18度培養(yǎng)4-5幾天,得到性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株。將得到的性狀穩(wěn)定的菌株接種全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基加瓊脂制作的斜面，于3-4度進(jìn)行保存。在接種使用前進(jìn)行菌株活化和復(fù)壯，所述菌株活化的方法為:將接種有性狀穩(wěn)定的菌株的固體斜面于16-18度放置1-2小時(shí)后,將菌株轉(zhuǎn)接至麥汁營(yíng)養(yǎng)液中，于18度培養(yǎng)3天。
[0043]將性狀穩(wěn)定的菌株逐級(jí)轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行液體搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為18度，每級(jí)轉(zhuǎn)接擴(kuò)培比例小于或等于40倍，其中營(yíng)養(yǎng)液包括下列重量份的組分:土豆粉20，磷酸二氫鉀2，硫酸亞鐵I，硫酸鎂0.5，葡萄糖20及無(wú)菌水1000。經(jīng)過(guò)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種發(fā)酵罐進(jìn)行一定時(shí)間的變溫好氧發(fā)酵，發(fā)酵所用的培養(yǎng)基包含下列重量份的組分:土豆粉10，蛋白胨3，葡萄糖25及無(wú)菌水1000，發(fā)酵罐充氧量8.5-9.0ppm,發(fā)酵溫度和時(shí)間順次為，16度培養(yǎng)2天，18度培養(yǎng)I天，20度培養(yǎng)4天得到含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物，然后低溫出罐。將含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物分裝到裝有一定分離培養(yǎng)基的分裝器皿中于22度在無(wú)菌間進(jìn)行暗培養(yǎng)35-40天，所述分離培養(yǎng)基包括下列重量份的組分:葡萄糖10，黃豆柏2及無(wú)菌水1000，發(fā)酵產(chǎn)物與分離培 養(yǎng)基的重量比為1: 15，所述分裝器皿的裝量為總?cè)莘e的16-18%。待蟲(chóng)草菌絲體與所述分離培養(yǎng)基分離后進(jìn)行采收，并在無(wú)菌環(huán)境下自然低溫晾干，得到本發(fā)明所述固體活性蟲(chóng)草菌絲體。
[0044]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于， 將含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物低溫出罐后分裝到裝有一定分離培養(yǎng)基的分裝器皿中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)至有蟲(chóng)草菌絲體長(zhǎng)出并與所述分離培養(yǎng)基分離，其中所述分離培養(yǎng)基包含下列重量份的組分:葡萄糖8-12，豆柏1-3及無(wú)菌水800-1200 ； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、蟲(chóng)草菌種的篩選，將蟲(chóng)草菌絲接種于蠶蛹，通過(guò)自然培育法進(jìn)行培育，在經(jīng)過(guò)一定條件的溫差和光照刺激后，選取優(yōu)良蟲(chóng)草菌株作為蟲(chóng)草菌種，并將蟲(chóng)草菌種繼續(xù)培養(yǎng)至孢子成熟； 步驟二、蟲(chóng)草菌種的馴化，將孢子成熟的蟲(chóng)草菌種的子囊部位組織懸于裝有一定濃度生理鹽水的組織培養(yǎng)瓶頂部，進(jìn)行一定條件的光照培養(yǎng)后將生理鹽水轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，得到性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株； 步驟三、發(fā)酵培養(yǎng)，將所得到的性狀穩(wěn)定的蟲(chóng)草菌株逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種發(fā)酵罐進(jìn)行一定時(shí)間的變溫好氧發(fā)酵，得到含有蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟三中發(fā)酵所用培養(yǎng)基包含下列重量份的組分:土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖20-30 及無(wú)菌水 800-1200 ； 所述變溫好氧發(fā)酵的發(fā)酵條件為:充氧量8.5-9.0ppm, 15-17度培養(yǎng)2_3天后，繼續(xù)于18-19度培養(yǎng)1-2天，然后于19-21度培養(yǎng)3_5天。
3.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟四中所述發(fā)酵產(chǎn)物與分離培養(yǎng)基的重量比為1: 13-18，所述分裝器皿的裝量為總?cè)莘e的16-18%，分裝完成后于20-24度進(jìn)行暗培養(yǎng)35-40天。
4.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟一中所述蟲(chóng)草菌絲通過(guò)以下方法得到: 切取蟲(chóng)草菌株子囊部位組織，將其進(jìn)行外部消毒處理后，加入到裝有少量無(wú)菌0.5-1%葡萄糖培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)瓶中，于22-24度進(jìn)行組織分離培養(yǎng)3-7天后，經(jīng)過(guò)分離得到蟲(chóng)草菌絲。
5.如權(quán)利要求4所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟一中所述自然培育法包括以下步驟: 步驟一，將蟲(chóng)草菌絲接種于蠶蛹，將接種蟲(chóng)草菌絲的蠶蛹進(jìn)行變溫培養(yǎng)，所述變溫培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度順次為:12-14度培養(yǎng)2-3天，14-16度培養(yǎng)1_2天，18-19度培養(yǎng)1_2天，19-21度培養(yǎng)至蠶蛹僵化且有菌絲長(zhǎng)出蠶蛹； 步驟二、將長(zhǎng)出菌絲的蠶蛹進(jìn)行總溫差為7-8度的梯度溫度變化刺激培養(yǎng)2-7天，設(shè)定濕度為60-70度，溫度變化率為1-2度/小時(shí)。
6.如權(quán)利要求5所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，所述自然培育法的步驟二中，在進(jìn)行溫度刺激培養(yǎng)至菌絲呈一定的團(tuán)球狀時(shí)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行不低于200勒克斯的光照刺激。
7.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟二中所述光照培養(yǎng)方法為26-30度光照培養(yǎng)30-40小時(shí)；所述液體培養(yǎng)方法為將所述生理鹽水接種于含有全麥汁的試管中，于17-19度培養(yǎng)2-5天。
8.如權(quán)利要求7所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，可將得到的性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進(jìn)行保存，所述固體斜面采用全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基制成，保存溫度為3-4度。
9.如權(quán)利要求8所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，所述性狀穩(wěn)定的菌株接種固體斜面進(jìn)行保存后，在使用前需對(duì)菌株進(jìn)行菌株活化，所述菌株活化的方法為: 將接種有性狀穩(wěn)定的菌株的固體斜面于16-18度放置1-2小時(shí)后，將菌株轉(zhuǎn)接至麥汁營(yíng)養(yǎng)液中，于16-18度培養(yǎng)2-4天。
10.如權(quán)利要求1所述的與培養(yǎng)基分離的固體活性蟲(chóng)草菌絲體的制備方法，其特征在于，步驟三中所述逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)方法為: 將性狀穩(wěn)定的菌株逐級(jí)轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行液體搖床培養(yǎng)，每級(jí)轉(zhuǎn)接擴(kuò)培比例不大于40倍，所述營(yíng)養(yǎng)液包括下列重量份的組分:土豆粉15-25，微量元素組合物，葡萄糖15-25及無(wú)菌水800-1200 ;其中所述微量元素組合物包括磷酸二氫鉀1-3、硫酸亞鐵0.5-2、硫酸鎂.0.3-1和碳酸鈣1-3中的一種或幾種。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK103897991SQ201410161231
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】楊秀芬 申請(qǐng)人:楊秀芬