核酸擴增反應(yīng)用容器、核酸擴增反應(yīng)用筒及核酸擴增反應(yīng)用筒試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸擴增反應(yīng)用容器、核酸擴增反應(yīng)用筒及核酸擴增反應(yīng)用筒試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，由于基因利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫(yī)療備受注 目。另外在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)領(lǐng)域也開發(fā)了很多使用基因鑒別品種、改良品種的方法。作為利 用基因的技術(shù)，PCR(Polymerase化ain Reaction;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）等技術(shù)已廣泛普及。 如今，PCR在生物體的信息解析中成為了必不可少的技術(shù)。PCR是通過對含有作為擴增對象 的核酸（祀核酸）和試劑的溶液（反應(yīng)液）實施熱循環(huán)W擴增祀核酸的方法。作為PCR的 熱循環(huán)，普遍的是W 2個梯度或3個梯度的溫度實施熱循環(huán)的方法。
[0003] 另一方面，現(xiàn)狀是醫(yī)療領(lǐng)域中W流行性感冒為代表的感染癥的診斷使用免疫層析 試劑盒等簡易檢查試劑盒為主流。但是該樣的簡易檢查中，有時精度不夠，希望將能夠期待 更高檢查精度的PCR用于感染癥的診斷。另外，醫(yī)療機構(gòu)的普通口診患者等由于診察的時 間受限的關(guān)系，所W將檢查所需的時間限制在短時間內(nèi)。因此，現(xiàn)狀是例如流行性感冒的檢 查中，犧牲檢查的精度，通過簡易的免疫層析試劑盒等的檢查而實現(xiàn)短時間化。
[0004] 鑒于上述情況，醫(yī)療領(lǐng)域中，為了實現(xiàn)利用能夠期待更高精度的PCR進(jìn)行檢查，必 須縮短反應(yīng)所需時間。作為用于短時間內(nèi)進(jìn)行PCR的反應(yīng)的裝置，例如專利文獻(xiàn)1中，公開 了一種生物體試樣反應(yīng)裝置，其通過使填充有反應(yīng)液和不與反應(yīng)液混和且比重小于反應(yīng)液 的液體的生物體試樣反應(yīng)用芯片（chip)在水平方向的旋轉(zhuǎn)軸的周圍旋轉(zhuǎn)，從而使反應(yīng)液 移動而實施熱循環(huán)（專利文獻(xiàn)1)。另外，作為PCR的一種方法，公開了利用磁性珠的方法 (專利文獻(xiàn)2)或使用磁性珠作為液滴的移動機構(gòu)，通過使液滴在基板上的溫度變化區(qū)域移 動而進(jìn)行PCR的熱循環(huán)的方法（專利文獻(xiàn)3)等。
[0005] 專利文獻(xiàn)1 ;日本特開2009 - 136250號公報
[0006] 專利文獻(xiàn)2 ;日本特開2009 - 207459號公報
[0007] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2008 - 012490號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供核酸擴增反應(yīng)用容器、核酸擴增反應(yīng)用筒及核酸擴增反應(yīng) 用筒試劑盒。
[0009] 本發(fā)明涉及的一個實施方式是核酸擴增反應(yīng)用容器，其包含冷凍干燥的核酸擴增 反應(yīng)試劑、油W及收容上述核酸擴增反應(yīng)試劑和上述油的容器，其中，上述核酸擴增反應(yīng)試 劑被保持在油中。上述油可W被脫水處理。上述冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑優(yōu)選為餅狀。 上述冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑優(yōu)選為具有直徑20 y m W下的孔的多孔質(zhì)。上述核酸擴 增反應(yīng)試劑可W含有DNA聚合酶和dNTP，可W含有核酸擴增反應(yīng)用引物，可W含有逆轉(zhuǎn)錄 酶。另外，上述核酸擴增反應(yīng)試劑和上述核酸擴增反應(yīng)用油可w被固體蠟隔開。
[0010] 本發(fā)明涉及的另一個實施方式是核酸擴增反應(yīng)用筒，具有長邊方向，具備管和核 酸擴增反應(yīng)用容器，所述管在內(nèi)部依次具備由油構(gòu)成的第1塞子、由與油發(fā)生相分離且清 洗結(jié)合有核酸的微粒的第1清洗液構(gòu)成的第2塞子、由油構(gòu)成的第3塞子、由與油發(fā)生相分 離且從上述結(jié)合有核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液構(gòu)成的第4塞子、W及由油構(gòu)成的第 5塞子；所述核酸擴增反應(yīng)用容器與上述管的配置上述第5塞子側(cè)連通且包含油，其中，與 油不溶的冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑被保持在上述核酸擴增反應(yīng)用容器所含的上述油 中。上述核酸擴增反應(yīng)試劑優(yōu)選配置在上述核酸擴增反應(yīng)用容器的與上述管連通側(cè)的相反 側(cè)的端部。上述核酸擴增反應(yīng)用容器的與上述管連通側(cè)的相反側(cè)的端部優(yōu)選為錐狀。上述 油的比重優(yōu)選小于上述溶出液的比重，上述核酸擴增反應(yīng)用容器所含的上述油的粘度優(yōu)選 為50CS W下。上述核酸擴增反應(yīng)用筒可W具備擠壓機構(gòu)，其安裝于上述管的配置第1塞子 側(cè)的開口部，從上述管的配置第5塞子側(cè)向上述核酸擴增反應(yīng)用容器推出液體。上述管的 配置第5塞子側(cè)的前端可W與保持在上述核酸擴增反應(yīng)用容器中的油相接。上述核酸擴增 反應(yīng)用容器中的油可W被脫水處理。上述核酸擴增反應(yīng)試劑可W含有DNA聚合酶和dNTP。 上述核酸擴增反應(yīng)試劑可W含有核酸擴增反應(yīng)用引物，或者上述溶出液可W含有核酸擴增 反應(yīng)用引物。上述核酸擴增反應(yīng)試劑可W含有逆轉(zhuǎn)錄酶。上述核酸擴增反應(yīng)試劑和油可W 被固體蠟隔開。此外，用于使上述核酸擴增反應(yīng)試劑冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑溶液的 量可W比上述溶出液的溶液量少。
[0011] 本發(fā)明涉及的另一個實施方式是核酸擴增反應(yīng)用筒試劑盒，具備上述中任一個核 酸擴增反應(yīng)用筒和用于向上述管導(dǎo)入核酸結(jié)合性固相載體的罐。上述罐可W包含用于提取 核酸的溶解液和上述核酸結(jié)合性固相載體。上述罐可W具有開口部，在上述開口部具有可 裝卸的蓋。上述罐的開口部可可安裝于上述管的第1塞子側(cè)的開口部的方式構(gòu)成。
【附圖說明】
[0012] 圖1A和圖1B是筒1的說明圖。
[0013] 圖2A~圖2C是筒1的動作說明圖。
[0014] 圖3A~圖3D是罐3的說明圖。
[0015] 圖4是固定爪25 W及導(dǎo)板26和安裝部62的說明圖。
[001引圖5A和圖5B是PCR容器30的周邊的說明圖。
[0017] 圖6A是PCR裝置50的內(nèi)部構(gòu)成的立體圖。圖她是PCR裝置50的主要構(gòu)成的側(cè) 視圖。
[001引 圖7是PCR裝置50的框圖。
[0019] 圖8A是旋轉(zhuǎn)體61的說明圖。圖8B是在旋轉(zhuǎn)體61的安裝部62安裝了筒1的狀 態(tài)的說明圖。
[0020] 圖9A~圖9D是安裝筒1時的PCR裝置50的狀態(tài)的說明圖。
[0021] 圖10是使磁鐵71向下方移動時的磁珠7的舉動的概念圖。
[0022] 圖11A~圖11C是核酸溶出處理的說明圖。
[0023] 圖12是使磁鐵71擺動時的磁珠7的舉動的概念圖。
[0024] 圖13是表示磁鐵71有無擺動的表。
[00巧]圖14A~圖14C是液滴形成處理的說明圖。
[0026] 圖15A~圖15D是熱循環(huán)處理的說明圖。
[0027] 圖16是表示一個實施例中使用的核酸提取用試劑盒及其組裝后的裝置的圖。
[0028] 圖17是表示一個實施例中的實時PCR的結(jié)果的圖。
[0029] 圖18是表示一個實施例中的核酸擴增溶液的保存穩(wěn)定性能的比較的結(jié)果的圖。
[0030] 圖19是在一個實施方式中使冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑固定于管時的示意 圖。
[0031] 圖20A~圖20C是表示使用圖19A中記載的構(gòu)成使冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑 溶解的方法的示意圖。
[0032] 圖21是表示在一個實施例中使用采用圖20A~圖20C的方法使核酸擴增試劑溶 解于溶出液而得的試劑的RT - PCR的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0033] W下，對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)予說明，本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點 W及其構(gòu)思，根據(jù)本說明書的記載，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的，根據(jù)本說明書的記 載，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地再現(xiàn)本發(fā)明。W下記載的發(fā)明的實施方式是表示本發(fā)明的 優(yōu)選的實施方式，是為了例示或說明而示出的，本發(fā)明不限定于此。在本說明書中公開的本 發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)可W基于本說明書的記載進(jìn)行各種改變和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 來說是清楚的。
[0034] ===第1實施方式===
[0035] 本發(fā)明的第1實施方式是核酸擴增反應(yīng)用容器，其包含冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng) 試劑、油W及收容核酸擴增反應(yīng)試劑和油的容器，其中，核酸擴增反應(yīng)試劑被保持在油中。 優(yōu)選冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑與油不溶。
[0036] 該核酸擴增反應(yīng)用容器所含的容器沒有特別限定，例如，優(yōu)選能夠直接用于PCR 裝置等核酸擴增設(shè)備的0. 2mL~1. 5mL的小型管。
[0037] 該容器中，冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑被保持在油中。核酸擴增反應(yīng)試劑至少 含有DNA聚合酶和dNTP，優(yōu)選含有核酸擴增反應(yīng)用引物和/或核酸擴增反應(yīng)用探針。另外， 冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑可W含有逆轉(zhuǎn)錄酶。此時，逆轉(zhuǎn)錄用引物可W與核酸擴增反 應(yīng)用引物被分開含有，也可W與核酸擴增反應(yīng)用引物共用。
[003引 DNA聚合酶沒有特別限定，優(yōu)選耐熱性的酶、PCR用酶，例如，有Taq聚合酶、訂i聚 合酶、Tth聚合酶、或者它們的改良型等非常多的市售品，優(yōu)選可執(zhí)行熱啟動的DNA聚合酶。 另外，逆轉(zhuǎn)錄酶也沒有特別限定，例如，可使用來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒（Avian Myeloblast Virus)、Ras相關(guān)病毒2型（Ras Associated Virus 2型）、莫洛尼小鼠白血病病毒（Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人類免疫缺陷病毒 1 型（Human Immunodefficien 巧 Virusl型）的逆轉(zhuǎn)錄酶等，優(yōu)選耐熱性的酶。
[0039] dNTP、鹽的濃度為適合使用的酶的濃度即可，通常，dNTP為10~1000 uM，優(yōu)選為 100 ~500 y M，Mg2+ 為 1 ~lOOmM,優(yōu)選為 5 ~lOmM，C1 -為 1 ~2000mM,優(yōu)選為 200 ~700mM 即可，總離子濃度沒有特別限定，可W為高于50mM的濃度，優(yōu)選為高于lOOmM的濃度，更優(yōu) 選為高于120mM的濃度，進(jìn)一步優(yōu)選為高于150mM的濃度，進(jìn)一步優(yōu)選為高于200mM的濃 度。上限優(yōu)選為500mMW下，更優(yōu)選為300mMW下，進(jìn)一步優(yōu)選為200mMW下。引物用寡核 巧酸分別使用0. 1~10 y M，優(yōu)選使用0. 1~1 y M。
[0040] 核酸擴增反應(yīng)試劑的冷凍干燥W通常采用的方法進(jìn)行即可，例如，在核酸擴增反 應(yīng)用容器所使用的容器中，向核酸擴增反應(yīng)用緩沖液中加入1反應(yīng)份的核酸擴增反應(yīng)試 劑，迅速冷凍，控制成低壓，放置規(guī)定時間。核酸擴增反應(yīng)用緩沖液的量沒有特別限定，可W 為5 y L，優(yōu)選為2. 5 y L，更優(yōu)選為1. 6 y L，緩沖液的量越少，核酸擴增反應(yīng)試劑越少且堅硬 地固定在容器底。迅速冷凍時的溫度沒有特別限定，優(yōu)選為一1(TC~一16(TC，最優(yōu)選為 約一8(TC。冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑優(yōu)選為海綿狀或餅狀，里面存在很多氣泡駐留的 微細(xì)孔（氣孔）的多孔質(zhì)，由此，溶解性變好。而且，迅速冷凍使微細(xì)孔更小，保存性更好。 孔的平均空隙直徑（例如，在顯微鏡下測量截面的孔的直徑一定次數(shù)，取其平均值）優(yōu)選為 20y m W下。低壓時的壓力沒有特另ij限定，優(yōu)選為lOOmmHg W下，最優(yōu)選為20mmHg W下。保 持在低壓的時間也沒有特別限定，優(yōu)選為2 - 24小時，最優(yōu)選為8小時左右。此外，用于使 核酸擴增反應(yīng)試劑冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑溶液的量優(yōu)選比使核酸擴增反應(yīng)試劑溶 解的水溶液的量少。
[0041] 該樣通過在核酸擴增反應(yīng)用容器所使用的容器中將核酸擴增反應(yīng)試劑冷凍干燥， 使核酸擴增反應(yīng)試劑固定于容器底。其后添加油，優(yōu)選W填滿容器的方式添加。由于冷凍 干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑怕水，水分存在的狀態(tài)下，無法長時間穩(wěn)定保存，所W優(yōu)選將油預(yù) 先用硅膠等脫水，優(yōu)選油的添加在手套箱內(nèi)等進(jìn)行。另外，加入油后，優(yōu)選將容器輕輕離也， 除去氣泡。
[0042] 在向冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑加入油之前，通過加入溶解的蠟，在蠟固化后 加入油，能夠防止冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑在油中擴散。在此，蠟是室溫下為固體、加 熱后變成液體的有機物，優(yōu)選本發(fā)明中可使用的蠟具有3rCW上、優(yōu)選為36CW上、更優(yōu) 選為4rc W上、進(jìn)一步優(yōu)選為46C W上的烙點、且具有10(TC W下、優(yōu)選為9(TC W下、更優(yōu) 選為8(TC W下、進(jìn)一步優(yōu)選為7〇°C W下的烙點，由中性脂肪、高級脂肪酸、姪等構(gòu)成。作為 蠟，沒有特別限定，例如，除石蠟、微晶蠟等來自石油的蠟，蜜蠟、羊毛蠟、錄蠟等來自動物 的蠟，己西蹤擱蠟、松香蠟、小燭樹蠟、木蠟等來自植物的蠟之外，還可使用Elcrysta(注 冊商標(biāo)，出光興產(chǎn)）、Nissan Elector (注冊商標(biāo)，日油株式會社）、Poem(注冊商標(biāo)，化ken Vitamin)、Rikemal (注冊商標(biāo)，Riken Vitamin)、Neo Wax (注冊商標(biāo)，Yasuhara Chemical 株式會社）、HI-WAX (注冊商標(biāo)，H井化學(xué)）、Silicon Wax (注冊商標(biāo)，Dow Corning Toray) 等。
[0043] 核酸擴增反應(yīng)用容器所含的容器能夠用于PCR裝置等的核酸擴增設(shè)備時，該具有 核酸擴增反應(yīng)試劑和油的核酸擴增反應(yīng)用容器能夠直接用于核酸擴增反應(yīng)。具體而言，將 含有進(jìn)行擴增的DNA的適量的純水或緩沖液W浸泡冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑的方式 添加，開始核酸擴增反應(yīng)即可。純水或緩沖液的量可W按鹽類等的最終濃度適合核酸擴增 反應(yīng)的方式容易地決定。此外，可W在反應(yīng)前進(jìn)行加熱處理、振蕩處理，使核酸擴增反應(yīng)試 劑充分溶解。
[0044] 冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑含有逆轉(zhuǎn)錄酶時，可W將含有RNA的適量的純水或 緩沖液W浸泡冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑的方式添加，此時，能夠進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其后 能夠進(jìn)行核酸擴增反應(yīng)。
[0045] 在核酸擴增反應(yīng)用容器中固體蠟覆蓋冷凍干燥的核酸擴增反應(yīng)試劑時，只要加熱 到蠟溶解的溫度，使蠟溶解后，如上述那樣添加含有核酸的適量的純水或緩沖液即可。
[0046] ===第2實施方式===
[0047] 首先，對安裝于PCR裝置50 (核酸擴增反應(yīng)裝置）的筒進(jìn)行說明，其后對本實施方 式的PCR裝置50的構(gòu)成?動作進(jìn)行說明。
[0048] <筒 1 >
[0049] 圖1A和圖1B是筒1的說明圖。圖2A~圖2C是筒1的動作說明圖。圖2A是筒1 的初始狀態(tài)的說明圖。圖2B是從圖2A的狀態(tài)擠壓柱塞10使密封部件12A與下注射筒22 接觸時的側(cè)視圖。圖2C是擠壓柱塞10后的筒1的說明圖。
[0050] 筒1是進(jìn)行使核酸從核酸結(jié)合的磁珠7溶出的核酸溶出處理的容器，并且是對溶 出液47進(jìn)行用于聚合酶反應(yīng)的熱循環(huán)處理的容器。
[0051] 核酸提取處理在罐3中進(jìn)行，在通過管20期間被精制。管20的材質(zhì)沒有特別限 定，例如，可W為玻璃、塑料等樹脂、金屬等。尤其是選擇透明的玻璃、樹脂作為管20的材 質(zhì)，則能夠從管20的外部觀察內(nèi)部，所W更優(yōu)選。另外，如果管20的材質(zhì)選擇透過磁力的 物質(zhì)、非磁性體，則使磁性粒子通過管20時等，通過從管20的外部賦予磁力更容易使磁性 粒子移動，所W優(yōu)選。另外，由于在附近配置加熱器（后述的溶出用加熱器65A、高溫側(cè)加熱 器65B)，所W優(yōu)選管的材質(zhì)具有至少l〇(TCW上的耐熱性。應(yīng)予說明，管20的材質(zhì)可W與 罐的材質(zhì)相同。
[0052] 管20具有清洗液塞子45、溶出液塞子47和油塞子。由于核酸結(jié)合的磁珠7被外 部的磁鐵吸引，通過使磁鐵沿管20在外部移動，能夠使磁珠7在管20內(nèi)移動，通過清洗液 塞子45,到達(dá)溶出液塞子47。與磁珠7結(jié)合的核酸在清洗液塞子45被清洗液清洗，在溶出 液塞子47溶出。在此，"塞子"是指在管20內(nèi)特定的液體占一分區(qū)時的液體。例如，在圖 2A~圖2C中將在毛細(xì)管23內(nèi)保持柱狀的液體稱為"塞子"。應(yīng)予說明，油與其它的溶液發(fā) 生相分離（與其它的溶液不混和），因此，由油構(gòu)成的塞子具有防止其兩側(cè)的水溶性的塞子 相互混合的功能。優(yōu)選在塞子中、塞子之間沒有氣泡、其它的液體，但只要磁珠7能夠通過 塞子，也可W存在氣泡、其它的液體。
[0053] 油的種類沒有特別限定，可W使用礦物油、硅油（2CS硅油等）、植物油等，通過設(shè) 為更高粘度的油，從而在與上側(cè)的塞子間的界面上，使核酸結(jié)合性固相載體移動時能夠提 高由油引起的"洗刷效果"。由此，從上側(cè)的塞子向由油構(gòu)成的塞子移動核酸結(jié)合性固相載 體時，能夠?qū)⒏街诤怂峤Y(jié)合性