檢測染色體非整倍體數(shù)目異常的擴(kuò)增組合物及快速檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，是一種DNA水平的基于定量熒光PCR(Quantitive FluoresentPCR，QF-PCR)的檢測方法，可以對常見的21、18、13三體綜合征以及乂、￥性別 染色體數(shù)目異常進(jìn)行快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)畸變是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因之一（GardnerRJ M,SutherlandGR.Chromosomeabnormalitiesandgeneticcounseling[M].New York:OxfordUniversityPress, 1996:300-320.)，染色體非整倍體疾病屬于染色體數(shù) 目異常，包括單體型、三體型、多體型和嵌合體。臨床上常見包括21三體綜合征（Down's syndrome)、18 三體綜合征（Edwardsyndrome)、13 三體綜合征（Patausyndrome)、以及一 些性染色體畸變，如Klinefelter綜合征（47,XXY)和Turner綜合征（45,X)等。研究表明 13、18、21及X/Y染色體異常占新生兒染色體數(shù)目異常的95%，這給家庭的社會(huì)造成沉重負(fù) 擔(dān)。由于至今還沒有有效預(yù)防和治療方法，因此，在產(chǎn)前及時(shí)診斷21號(hào)染色體異常并終止 妊娠對降低出生缺陷、提高人口素質(zhì)有重要意義。
[0003]目前，臨床上以染色體核型分析為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，然而該技術(shù)有很大局限性。首先要 進(jìn)行羊膜穿刺取羊水，然后培養(yǎng)羊水中胎兒細(xì)胞，再進(jìn)行核型分析。整個(gè)周期需要2-3周， 操作復(fù)雜，需要有經(jīng)驗(yàn)的檢測人員操作。另外近幾年應(yīng)用的技術(shù)為熒光原位雜交（FISH)，這 一方法較核型分析速度稍快，不需細(xì)胞培養(yǎng)，利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標(biāo) 記或以非放射性物質(zhì)標(biāo)記后與靶DNA進(jìn)行雜交。再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo) 記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號(hào)從而對標(biāo)本中待測核酸進(jìn)行定性、定位和定量分 析。這兩種方法都具有成本較高，周期長，對操作人員要求較高的特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)果為圖片，需 要人工判讀或干預(yù)，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量分析。
[0004]QF-PCR技術(shù)是，通過熒光引物對樣本DNA的不同區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增（因此熒光信 號(hào)變量與擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比），隨后采用高分辨率膠電泳（如用于測序的毛細(xì)管電泳）對 擴(kuò)增片斷進(jìn)行分離，通過熒光檢測系統(tǒng)確定擴(kuò)增片斷的長度并實(shí)現(xiàn)對多態(tài)位點(diǎn)的分型，通 過掃描軟件對預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)的峰面積定量，實(shí)現(xiàn)對原始模板量的定量。定量熒 光PCR體系（QuantitativeFluorescentPCR，QF-PCR)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè) 21、18、13、X和Y 染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemR印eats，STR)基因座，利用STR基因座的多態(tài) 性來判斷染色體數(shù)目。非整倍體數(shù)目異常是由染色體數(shù)目增多或減少一條引起的疾病，因 此對染色體上的STR位點(diǎn)經(jīng)過QF-PCR擴(kuò)增、檢測會(huì)得到1:1:1的三個(gè)峰、2:1的兩個(gè)峰或一 個(gè)峰，其中前兩種情況是三體綜合征樣本相對于正常樣本所特有的。STR位點(diǎn)多態(tài)性越高則 出現(xiàn)單一峰的幾率越小，出現(xiàn)前兩種情況比例越大。對多個(gè)特定染色體上的STR位點(diǎn)進(jìn)行 檢測，綜合考量各個(gè)位點(diǎn)峰數(shù)量和峰面積即可判定檢測樣本是否為三體綜合征。
[0005] 1993 年Mansfield首次報(bào)道應(yīng)用STR(ShortTandemRepeats，短串聯(lián)重復(fù)序 列）進(jìn)行QF-PCR，成功檢測 21 三體綜合征（Mansfield，DiagnosisofDownsyndrome andotheraneuploidiesusingquantitativePCRandsmalltandemrepeat polymorphisms.HumMolGenet. 1993 ;2:43 - 50.)。此后越來越多的研究者米用STR基因 座聯(lián)合檢測的方法來診斷。如：專利200510025466. 8,分子生物學(xué)法三體檢測試劑盒，通過 七個(gè)QF-PCR體系檢測3個(gè)21號(hào)染色體、2個(gè)18號(hào)染色體和2個(gè)13號(hào)染色體STR位點(diǎn)；專 利200410021619. 7, 一種生物非整倍體的檢測方法，每條染色體選用6-9個(gè)STR位點(diǎn)，一個(gè) 體系包含3-4個(gè)同一染色體STR位點(diǎn)；專利201310555078. 5, 一種單管復(fù)合擴(kuò)增檢測人類 五條染色體非整倍體的試劑盒，通過1個(gè)QF-PCR體系檢測23個(gè)位點(diǎn)，包括6個(gè)21號(hào)染色 體的STR位點(diǎn)，5個(gè)18號(hào)染色體的STR位點(diǎn)，4個(gè)13號(hào)染色體的STR位點(diǎn)和8個(gè)性染色體 位點(diǎn)。上述專利往往采用的STR位點(diǎn)不合理或數(shù)目較少，且每個(gè)QF-PCR擴(kuò)增體系中包含的 位點(diǎn)數(shù)量少，導(dǎo)致檢測效率和準(zhǔn)確性不夠高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供染色體非整倍體數(shù)目異常的檢測PCR擴(kuò)增組合物，在高度復(fù) 合的擴(kuò)增體系中可以擴(kuò)增檢測8個(gè)21號(hào)染色體、6個(gè)18號(hào)染色體、6個(gè)13號(hào)染色體和3個(gè) X染色體相關(guān)的STR位點(diǎn)，同時(shí)擴(kuò)增檢測4個(gè)性別位點(diǎn)。且通過定量熒光PCR(QF-PCR)技術(shù) 擴(kuò)增上述所有位點(diǎn)，對21、18、13、X和Y染色體非整倍體數(shù)目異常進(jìn)行檢測。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種非整倍體數(shù)目異常檢測試劑盒。該試劑盒利 用多重定量熒光PCR擴(kuò)增體系，通過該試劑盒可實(shí)現(xiàn)僅以一個(gè)擴(kuò)增檢測反應(yīng)完成對樣品簡 便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、精細(xì)和高效地檢測。
[0008] 檢測染色體非整倍體數(shù)目異常的擴(kuò)增組合物，其特征在于：所述擴(kuò)增組合物中 包括27對引物，可同時(shí)擴(kuò)增23個(gè)與21、18、13、X染色體非整倍體數(shù)目異常檢測相關(guān)的 STR位點(diǎn)和4個(gè)Y染色體非整倍體數(shù)目異常檢測相關(guān)位點(diǎn)：D13S256、D13S797、DXS6809、 DXS9895、D21S2052、D18S51、AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、 D13S305、TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、 D21S1246、XHPRT、D13S325 和PentaD，所述引物分別為：
[0009] 擴(kuò)增D13S256的引物：
[0010]引物 1 :AAGAGCAAAACTCCATCTCGATAG，
[0011]引物 2 : TACTTATAAGCAGAGAGACATAA;
[0012] 擴(kuò)增D13S797的引物：
[0013]引物 1 :TTTTGGTTTGCTGGCATCTG，
[0014]引物 2 :TTGTCTGGAGGCTTTTCAGTC;
[0015] 擴(kuò)增DXS6809的引物：
[0016]引物 1 :TGITTCCATCTTTCTCTGAAC，
[0017]引物 2 :GAATCCAATTTTGCTTTAGGC;
[0018] 擴(kuò)增DXS9895的引物：
[0019]引物 1 :CCATGATTCAAATTATCTCCCACC，
[0020] 引物 2 :CCATCAITTGCCTTGAGAAAA;
[0021] 擴(kuò)增D21S2052的引物：
[0022]引物1 :ACTGTACAGAGGITCTCCGGGCA，
[0023]引物2 : CATGTCTTGAGCCTTCCAGCTCTCT ;
[0024] 擴(kuò)增D18S51的引物：
[0025]引物1:ITCACTCTGAGTGACAAAITGA，
[0026]引物2 : CATTAAGCTCACTTTAGCCG ;
[0027] 擴(kuò)增AMEL的引物：
[0028]引物1 : CACCAGCCAAACCTCCCTCCGC，
[0029]引物2 :GCTGCATGGGGTGCACAGGTG ;
[0030] 擴(kuò)增D18S535的引物：
[0031]引物1 :ACAAAAGCCACACCCATAAC，
[0032]引物2 :GAAATATAGATGAGAATGCAGAGA ;
[0033] 擴(kuò)增D13S317的引物：
[0034]引物1 :TATCACAGAAGTCTGGGATG，
[0035]引物2 :AAAAAGACAGACAGAAAGAT ;
[0036] 擴(kuò)增D21S1411的引物：
[0037]引物1 :TAGAACATAGGTAGATACATAA，
[0038]引物2 : TCCAGGCTTTCTGCCCACTCCCA ;
[0039] 擴(kuò)增D18S1002的引物：
[0040]引物1 :AGGAAGCTATCTATACAAAGAGTG，
[0041]引物2 :AAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG ;
[0042] 擴(kuò)增D21S1446的引物：
[0043]引物1 : TAITGCCTAGTGATGITGTAGCC，
[0044]引物2 :AGAATATGTCCCAAAGGACCTGC ;
[0045] 擴(kuò)增D13S305的引物：
[0046]引物1 :CCTGTTTGAGGACCTGTCGTTA，
[0047]引物2 : TCGAAATCCTAGGCTTGAGTAA ;
[0048] 擴(kuò)增TAF9L的引物：
[0049]引物1 :TTTGACAGGTAGTTTTGGGTCA，
[0050]引物2 : CTACAGCATCTCTGTTAAATTTAGA ;
[0051] 擴(kuò)增D18S877的引物：
[0052]引物1 :ACAAATATGCAAAGTATAGCACAC，
[0053]引物2 : TTCTGTCTCTCTATCCATCATCTAT ;
[0054] 擴(kuò)增LFG21的引物：
[0055]引物1 : GTTATGTCCCATGAITTCCC，
[0056]引物2 :ATCTAGATACTCTTTAATAT ;
[0057] 擴(kuò)增ZFXY的引物：
[0058]引物1 : TGGACTCAGATGTAACTGAAGAAGT，
[0059]引物2 : TACCAATACTTCTTCTGAAACTACG ;
[0060] 擴(kuò)增D18S851的引物：
[0061]引物 1:TCTCTCTGTCCTCTAGGCTCATTTAGC，
[0062]引物 2 :TGAGATAGTTTAAATAGTTTGCC;
[0063] 擴(kuò)增D21S1435的引物：
[0064]引物 1:CTCAGCACAITCTCCTCTAGAITTA，
[0065]引物 2:AAAGCAAGAGATTTCAGTGCCATC;
[0066] 擴(kuò)增SRY的引物：
[0067]引物 1 :TTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA，
[0068]引物 2 :TGTCCAGTTGCACTTCGCTGC;