專利名稱：：嵌合非整倍體干細胞的選擇，增殖和使用的制作方法嵌合非整倍體干細胞的選擇，增殖和使用與相關專利申請的交叉引用本申請主張于2005年11月9日提交的美國臨時專利申請60/735,715的優(yōu)先涉又，其全文在此引用作為參考。經聯邦資助的研究和開發(fā)所形成發(fā)明的權利的聲明本發(fā)明在政府資助下產生，該資助由國家衛(wèi)生研究院授予，資助號K02MH01723。政府對本發(fā)明具有一定的權利。
背景技術：
：干細月包具有在體內發(fā)育成為多種不同細月包類型的潛力。干細胞理^侖上可無限制地分裂以補充其它細胞。當干細胞分裂時，各新細胞既可能維持為干細胞，也可能成為具有特定功能的其它細月包類型，例如月幾肉細月包，紅血細月包或腦細月包。干細月包通常被分類為全能性或多能性。全能性干細胞具有完全的分化潛力它可生成體內所有不同類型的細胞。受精卵細胞是全能性干細胞的一個范例。多能性干細胞可生成體內來自于三個主要生殖細胞層或胚胎本身的任何細胞類型。祖細胞還可分化成為特化細胞。然而，與干細力包不同，-且細力包不能自我更新，且它們只能生成一種或少lt幾種細"包類型。干細胞包括胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞來自于胚胎。為進行研究，可從體外受精(例如在體外受精診所)的卵子發(fā)育而成的胚胎獲取胚胎干細胞，并在供體的知情同意下為研究目的進行捐獻。胚胎通常在四或五天呈中空樣"求狀(成為胚嚢)時獲取。胚嚢包括三個結構滋養(yǎng)層，即圍繞胚嚢的細月包層；嚢胚腔，即胚嚢內的空腔；以及內細胞團，在嚢胚腔一端約30個細胞的群。舉例來說，可通過分離內細胞團并在體外生長獲得胚胎干細月包。內細月包團通常生長于飼養(yǎng)細月包層(例如小鼠胚胎成纖干細胞具有多能性并可成為體內的任何細胞類型。成體干細力包為未分化的細力包。該種細"包可/人組織或器官中的分化細胞中鑒定得到。成體干細胞可自我更新，并能分化成為組織或器官的特化細胞類型。人胚胎干細胞(HESCs)在基礎科學和治療策略(包括再生醫(yī)學中的移植)中具有極大的應用潛力(AmitM,等人AW227:271-278(2000))。HESCs4吏用上的一大挑戰(zhàn)是維持穩(wěn)定的細胞系，特別是在延續(xù)傳^之后(AmitM,等人5/o/227:271-278(2000》CarpenterMK,等人DevZ)，229:243-258(2004》RosierES，等人Devi^"229:259-274(2004))。事實上，最近才艮道了由非整倍體干細月包克隆擴增導致的NM-資助的HESC系(例如Hl，H7,H9)的染色體不穩(wěn)定性(DraperJS，等人NatBiotechnol22:53-54(2004);LakshmipathyU,等人5VemCe〃s22:531-543(2004);PeraMF，7VW5/o&c/wo/22:42-43(2004》。Themostfrequentlyreportedchromosomalabnormalitieswerehyperploidies,particularlytrisomiesofchromosomes12,17or20(DraperJS5等人NatBiotechnol22:53-54(2004);LakshmipathyU,等人StemCells22:531-543(2004》PeraMF,NatBiotechnol22:42-43(2004)),althoughthegeneralityofchromosomalinstabilityisuncertain(ThomsonJA,等人Science282:1145-1147(1998);AmitM，等人DevBiol227:271-278(2000);ReubinoffBE,等人NatBiotechnol18:399-404(2000);ThomsonJA，等人TrendsBiotechnol18:53-57(2000);XuC,等人.NatBiotechnol19:971-974(2001);ChengL,等人StemCells21:131-142(2003》.此前，細胞遺傳學家曾忽略了未能鑒定所有染色體的細胞遺傳學分析，因為人們認為缺失的染色體體現了細胞遺傳學分析的不準確性，而非真的存在染色體缺失。事實上，遺傳:技術人員協會的細胞遺傳實—瞼室手冊指出如果在中期[分散]存在的染色體數量少于45條，可以^暇定部分染色體在處理過程中遺失，且中期[分散]不適合進行分斗斤。參見Barch等人,(1997)TheAGTCytogeneticsLaboratoryManual.Lippincott:Philadelphia。本發(fā)明指出了非整倍體在干細胞中的作用并提供了在其它問題中干細胞使用和分析的工具。發(fā)明概述本發(fā)明提供了檢測和定義干或祖細胞的非整倍體嵌合情況的方法。在一些實施方式中，該方法包括檢測群中非整倍體嵌合體的存在，其中在群內的不同細胞中至少4企測到3種不同的核型。在一些實施方式中，其中對群內的至少30個細胞進行非整倍性篩選。在一些實施方式中，對細胞的非整倍性進行記錄。在一些實施方式中，在群內的不同細J包中至少才企測到4,5,6,7,8,9,10,15,20或更多種不同的核型。在一些實施方式中，該方法包括"險測具有凈亞4咅體嵌合核型的細月包，并乂人具有凈亞倍體嵌合核型的細月包中篩選染色體中至少部分為亞倍體的干或祖細胞系以進行分化，進一步增殖或移植。在一些實施方式中，該方法包括"險測具有凈亞4咅體嵌合核型的細胞，并從具有凈亞倍體嵌合核型的細胞中篩選染色體中至少部分為亞4咅體的干或3且細月包系以進4亍藥物篩選。在一些實施方式中，該方法包括^r測具有凈超倍體嵌合核型的細胞，并從具有凈超倍體嵌合核型的細胞中篩選染色體中至少部分為超倍體的干或細l包系以進4亍分化，進一步增殖或移植。在一些實施方式中，該方法包括4全測具有凈超倍體嵌合核型的細胞，并從具有凈超倍體嵌合核型的細胞中篩選染色體中至少部分為超倍體的干或祖細胞系以進行藥物篩選(例如，篩選可以選擇性抑制或殺死細胞的藥物)。在一些實施方式中，該方法進一步包括在4企測步驟前通過至少一個周期(例如，至少2，5,10,20，30，40,50,6070,80,100或更多)的細胞分裂對干細胞進行傳代。在一些實施方式中，對細月包群中至少10%，20%,30%，40%,50%，60%，70%,80%,90%的細1包的核型進4亍了才企測。在一些實施方式中，該才企測步駛《包括了包含多重熒光原位雜交在內的熒光原^立雜交(FISH)。在一些實施方式中，該4企測步驟包括了光譜核型分析技術(SKY)。在一些實施方式中，該4企測步驟包括了G顯帶。在一些實施方式中，該才企測步驟包括了DAPI或其它染色體可碎見化染色或才支術。在一些實施方式中，該4企測步驟包括了流式細胞術。本發(fā)明還提供了與能夠分化成為預期細胞類型的細胞相比優(yōu)先抑制不能進行分化的細胞的藥劑的篩選方法。在一些實施方式中，該方法包括將該藥劑與具有凈超4咅體嵌合核型的細月包相接觸，其中該細胞無法分化成為預期細胞類型；以及選4奪抑制該細月包增殖的藥劑。在一些實施方式中，該方法進一步包4舌以下步-驟將該藥劑與具有亞倍體核型的細胞相接觸，其中該細胞能夠分化成為預期細胞類型；并且選擇能夠抑制不能分化的超倍體細胞的增殖，但不能明顯抑制能夠分化成為預期細胞類型的亞倍體細胞增殖的藥劑。本發(fā)明還提供了干細胞或祖細胞群的維持或改善方法。在一些實施方式中，該方法包4舌^r測細胞群內的細胞中至少一個染色體或其部分的核型；并且將細胞群中在至少一個染色體或其部分上具有整倍體或亞倍體核型的細胞與在至少一個染色體或其部分上具有超倍體的細月包相4咅體或亞4吾體細力包來維*持或改善干細力包或3且細力包群。在一些實施方式中，通過熒光激活細胞分選(FACS)進4亍該^r測和分離步-驟。在一些實施方式中，在分離步-驟后4吏具有整4咅體或亞倍體核型的細胞分化。在一些實施方式中，在分離步-驟后具有整倍體或亞倍體核型的細胞被增殖。在一些實施方式中，在分離步驟后具有整倍體或亞倍體核型的細胞被移植到個體。定義"非整倍體"采用其標準含義，即，對單倍體染色體的^青確倍數的任意偏離(包括增加和/或減少)，以及染色體內變化。因此，在至少部分單倍體基因組的兩個拷貝出現偏差，即，一條或多條染色體或其部分存在超過2個拷貝，或缺失一條或多條染色體或其部分將被認為是非整倍體。有時可用術語"非正體"來描述非整倍體，該術語包含在對非整倍體的此項定義之內。此處所用的"非整倍體嵌合體，，指在細胞群中至少存在三種不同的核型，其中至少兩種為不同的非整倍體狀態(tài)。在一些實施方式中，在細胞群中存在4,5，6,7,8，9，10或更多的4t型。"藥物篩選，，指通過多(例如，庫)分子篩選以鑒定一種或多種具有預期生物作用的分子。該種分子(有時稱為"藥劑")可包括，但不限于，小有機分子或生物分子，例如抗體，核酸，肽，脂質，糖或其組合。此處所用的術語"核型"指細胞中存在的染色體的數量和/或類型。"祖細胞"指可分化成為有限數量的細胞類型，〗旦通常無法反分化成為干細胞的細胞。例如，在骨髓中發(fā)現的血液3且細胞作為其自然進展的一部分可生成終末分化紅和白血細胞。此處所用的"干細胞"指全能性或多能性的細胞。全能性干細胞可隨著支持發(fā)育胚胎的胚胎胎盤分化成為任何的體細胞類型。全能性干細胞可生成發(fā)育有機體(包括胎盤)中所發(fā)現的所有細l包。多能性干細月包可發(fā)育成為三種主要的組織類型中的多種內胚層(例如，腸道內層)，中胚層(例如，肌肉，骨，血液)，以及外胚層(例如，表皮組織和神經系統(tǒng))，^旦通常在發(fā)育;昝能上具有限制(例如，它們可形成胎盤組織或指定系的其它細l包類型)。圖1顯示了早代和晚代H7HESCs的染色體百分比數值。星號表示了整倍體細胞(46條染色體)在圖中的預計位置。請注意兩個細胞系在早代群中均顯示了明顯比例的亞倍體細胞，而晚代細胞則容易出現克隆超倍體。圖2顯示了早代和晚代H9HESCs系的染色體百分比數值。星號表示了整倍體細胞(46條染色體)在圖中的預計位置。請注意兩個細胞系在早代群中均顯示了明顯比例的亞倍體細胞，而晚代細胞則容易出現克隆超倍體。圖3-4顯示了超倍體對神經元分化的作用。在PA6細胞上培養(yǎng)哺乳動物ESCs以誘導神經元分化。然后在存在或不存在紫杉醇的情況下處理細胞6天以誘導非整倍體。測定染色體數，將平行培養(yǎng)皿固定并染色以測定神經元標記tujl。圖3顯示了紫杉醇對細胞的處理可諸導非整倍體，特別是超倍體。圖4顯示了紫杉醇誘導的超倍體明顯降低了神經元分化潛能。發(fā)明詳述I.導言本發(fā)明涉及令人驚奇的發(fā)現，即非整〗咅體嵌合體^J"常規(guī)存在和發(fā)育中的干細胞具有一定作用。如今的干細胞研究者相信3K整倍體僅是一種異常，因此未在移植或其它治療用途中進行使用。事實上，當前干細胞分離和維持的方法強調了整倍體的至關重要。參見，美國專利6,200,806。相反地，本發(fā)明提供了在干細胞或祖細胞群中4全測非整倍體嵌合核型的方法，并提供了所選的特定非整倍體嵌合核型的干細胞或祖細胞的用途和分析。非整倍體嵌合體指細胞群內核型的分布。如此處所作的進一步解釋，非整倍體嵌合體事實上并不異常，而是正常干細l包群的突出性能。然而，干細月包群確士刀的非整倍體嵌合體組成可同時影響兩種基因型并能影響細胞群的表型，包括該群保留其分化成為多種分化細胞類型能力的能力。與之前對干細胞的描述不同，本發(fā)明發(fā)現在干細胞群內不同核型的嵌合體是一種標準，且它能影響細胞群的表型，包括其生理功能以及作為干細胞產生最佳作用的能力。相應地，本發(fā)明提供了"群核型分析"，其中^r測了群內比之前描述更多數量細胞的核型。此外，與之前描述相反，通過群核型分析所得的結果可選擇具有特定非整倍體(例如，亞倍體核型)的細胞群，而在之前具有亞倍體的細月包或者-陂忽略，或者4皮主動丟棄。另外，本發(fā)明還允許選擇特定非整倍體(例如，在特定染色體上的超倍體和/或在其它染色體上的整4咅體或亞倍體)。細月包群內不同核型的范例包4舌，^f旦不限于，至少一個具有正常染色體互補的細胞(例如，在人體中，22對稱為"常染色體"的非性染色體加上兩條性染色體)與至少一個非整倍體細胞同時存在。此外，在非整倍體嵌合群中可能存在各種單獨群中的不同核型。例如，細胞群可包括一些特定染色體的部分或全部為亞在一些實施方式中，細胞群可包括一些特定染色體的部分或全部為胞。在一些實施方式中，細胞群可包括一些特定染色體的部分或全部為超倍體的細胞，以及其它不同染色體的部分或全部為超倍體的細月包。在一些實施方式中，在細l包群中至少部分細月包具有凈亞倍體嵌合核型。"凈亞倍體嵌合核型"指群內細胞的一條或多條染色體或其部分主要(例如，大于50,60,70，80,90,95或99%)為亞倍體的細胞群。在一些實施方式中，大部分細胞在一條特定染色體中為亞倍體。在其它的實施方式中，群內的亞倍體細胞在不同(例如，至少1,2,3,4,5或更多)染色體或其部分中為亞倍體。在某些情況下，對于特定染色體為亞倍體的細胞對其它染色體或其部分為整倍體和/或超倍體?？梢岳斫怆m然細胞群可具有"凈"亞倍體核型，該群可包含整倍體和超4咅體細力包，盡管該細月包為少數。在一些實施方式中，在細月包群中至少部分細月包具有超亞倍體嵌合核型。"凈超倍體嵌合核型"指群內細胞的一條或多條染色體或其部分主要(例如，大于50,60,70,80,90,95或99%)為超倍體的細胞群。在一些實施方式中，大部分細胞在一條特定染色體中為超倍體。在其它的實施方式中，群內的超倍體細胞在不同(例如，至少1,2,3,4,5或更多)染色體或其部分中為超倍體。在某些情況下，對于特定染色體為超倍體的細力包對其它染色體或其部分為整倍體和/或亞倍體?？梢岳斫怆m然細胞群可具有"凈"超倍體核型，該群可包含整倍體和亞倍體細胞，盡管該細胞為少數。在一些實施方式中，該細月包群由亞4咅體和超4咅體細月包和/或同時包含亞倍體和超倍體染色體或其部分的細胞組成。以上方面的范例為具有一種染色體至少部分的三個拷貝^f旦只有另一染色體部分一個拷貝的細胞。在另一實施方式中，細胞群中的至少部分細胞包含染色體易位。本發(fā)明可用于任何類型的干或^L細胞。干細胞的示范類型包括胚胎干細胞和成體干細胞。干細胞可來源于任何類型的動物，包括人和非人哺乳動物。因此，本發(fā)明所采用的干細胞包括人成體干細胞和人胚胎干細胞。祖細胞包括所有生物中存在的多種祖細胞類型，包括但不限于造血(血液)，神經系統(tǒng)，淋巴，胰腺，心臟，肺，肌肉，骨，軟骨，結締組織，角膜，頭發(fā)，皮膚，肝，腸，目艮，脂肪，乳腺，曱狀腺，有性生殖的系。在一些實施方式中，癌癥(或腫瘤)干細月包可通過選擇與癌癥表型相關的非整倍體進行分離。該種細胞是以鑒定特異性抑制或殺死癌癥干細^9包為目的的藥物篩選的有用^4示。另夕卜，可對干細胞群進行分選以排除與癌癥相關的核型，從而使群中的剩余細月包可在移才直等應用中采用。分離干細胞和祖細胞的技術已眾所周知并可參見，例如，Thomson等人，Sc/ewce282:1145-(1998);Bodnar,等人，5VemCe〃sA77iDeve/o/me"f13:243-(2004);Li等人，Cwrew/別o/ogy8:971誦(1998);Schwartz等人,Jowm(3/7Vewrosc/e"ceieyearc/z74:838(2003)。II.4企測非整倍體嵌合體與之前對干細胞的描述不同，本發(fā)明人發(fā)現無需克隆擴增特定的非整倍體。因此，可對更大量的細月包進4亍核型分沖斤乂人而測定核型分布。通常該分析包括對數量大于之前干細胞研究者通常采用的分析量的細胞進行核型分析。本領域的技術人員將能理解應對細胞群內的大量細胞進行單獨核型分析以確定準確的核型分布(即，"非整倍體嵌合")，該細胞群可包^"整倍體核型。因此，在一些實施方式中對細月包群中超過30,50，75,100,150,200,300,同核型的準確分布。所分析細胞的數量將決定特定核型出現的檢測限。例如，名夂才全測以1%頻率出現的核型，需要測定細胞群內至少100個細胞的核型，優(yōu)選觀'J定如200,300，500或更多單個細月包的核型。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包含了測定足夠量的單個細月包的4亥型以^r測以例3口1%，0.1%,0.001%,0.0001%,0.00001%或更小的頻率出現的單獨核型的存在。在一些實施方式中，對細月包群中所有細月包，或基本上所有細月包(例如，至少80,90，95或99%)的核型進4于了4全測。一^:而言，單個細力包的核型分沖斤將包括檢測細胞中幾乎所有的染色體，而非僅僅篩選一種特定染色體或染色體部分的存在。然而，在其它實施方式中，本發(fā)明還允許僅沖企測細胞中一些染色體的數量(例如，2,3,4,5或更多染色體)。盡管任何類型的顯示方法均可用于顯示由非整倍體嵌合檢測所得的數據，本發(fā)明人發(fā)現以柱狀圖和/或表格形式有助于顯示結果，乂人而直乂見顯示細月包群中不同染色體或其部分的凄t量變化。圖1-2顯示了該種4主^]犬圖的范例。如圖1-2所示，該分斗斤可集中關注各分析細胞中染色體的總數。然而，還可對各細胞中各不同染色體的數量進行更具體的分析。體嵌合體。可通過核型分析測定染色體凄t量，染色體同一性和/或染色體完整性。染色體完整性指染色體處于完整的狀態(tài)(處于正常狀態(tài))或顯示曾通過破損，易位事件，孩i觀事件(包括缺失，易位，插入，擴增，倒位以及染色體內或染色體間的任意變動)被破壞的證據。在一些實施方式中，可采用熒光原位雜交(FISH)法測定細胞核型。FISH法已為本領域公知并可參見，例如，美國專利申_清2005/0214842。多重FISH(M-FISH)法對多個染色體的核型分才斤特別有用。示范性的M-FISH法包括，光譜核型分析(SKY)法。SKY法的描述參見，例如SchrockE,等人Sc/e"ce273:494(1996);SpeicherMR,等人7VW2:368(1996);T,Vignon等人iV^G匿f15:406,(1997);Macville,M.，等人，倫，Ce〃，編108(4-5):299-305(1997)。SKY法涉及使用以各種焚光標記進行標記的多重染色體^笨4十，以可測標記來4吏染色體"著色"，/人而可以評估和鑒定完整的染色體互補。在一些實施方式中，如熒光激活細胞分選(FACS)等流式細i包術可用于測定細l包群中細胞的核型。例如，DNA染#十(例如，石爽化吡。定，溴化乙4t，Hoechst33342，33258,DAPI等)可用于標記細胞中的DNA，然后可基于來自染料的信號量對細胞進行分選。本方法提供了基于DNA含量對染色體總量的估計，但未提供特定染色體增加或減少的具體信息。然而，釆用非特異性DNA染泮+或其它標記的流式細月包術足以區(qū)分凈亞4咅體細月包和凈超4咅體細胞。作為非特異性DNA染并牛的替代物，還可采用對特定染色體具有特異性的標記。后一方法對未活3夭分裂因而處于間期的細月包最為有效。該探針可基于核苷酸，或仍能堿基配對的化學差異分子，例如肽核酸(具有肽骨架)等。盡管不是特別有效，假定如上討論有足量細胞可進行分析，也可采用大規(guī)才莫傳統(tǒng)核型分析。任何4企測染色體的染色或光學或生物物理:技術均可用于進^f亍核型分4斤。在一些實施方式中，可采用DAPI/其它熒光染色劑或明視野染色劑對染色體進行染色?？赏ㄟ^吉姆薩染色(G顯帶)等勞動密集型方法對淋巴細胞和羊水細胞等細胞進行傳統(tǒng)的核型分析。在一些實施方式中，該4企測步驟包括使用PCR,優(yōu)選結合DNA陣列和/或結合單核苷酸多態(tài)性數據和圖譜進行單個細月包的全基因組擴增。采用熒光標簽或其它方法的體內過程還可用于確定活干細胞的倍數性(例如，Kaushal等人，J臉w冊c/.23:5599-5606(2003))。由于基因由染色體表達，因而可能通過可測基因產物的定性或定量表達鑒定非整倍體的一些形式，從而允許使用非整倍體的替代或相關的標記。該技術可結合標準細胞分類纟支術(例如FACS),從而可通過其它方法鑒定非整倍體的不同形式。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了根據細胞核型在細月包群(例如，干和/或—且細月包)中分選和分離不同細月包的方法，該方法可從超倍體核型中選走(或分離)整倍體或亞倍體核型。在一些實施方式中，所選的亞倍體(例如，至少一個染色體l或染色體1的部分缺失)細胞也可能在另一染色體或其部分為超倍體。然而，該選擇和分類將針對特定的亞倍體(例如，在上述實施例中為染色體1)。替代性地，可從具有亞倍體核型的細胞中選走(或分離)具有整倍體或超倍體核型的細胞。括但不限于，FACS分選。這些分選方法可用于，例如，特別在需要去除潛在癌癥超倍體細胞時，對干細胞和祖細胞群的常規(guī)質量維持和質量控制。III.干細胞選4奪后的使用本發(fā)明才是供了干細胞或祖細胞培養(yǎng)，生長和/或選擇或是使用干細胞或祖細胞的方法，其中該方法包括監(jiān)測和選擇性維持特定非整倍體嵌合體的步驟。對特定非整倍體嵌合體的選擇，即，測定，步驟和方法中的4吏用。其包括，^旦不限于，用于以下用途的干細胞或祖細胞移植，生成生物制劑(抗體，siRNA等)，篩選藥物制劑(例如，干擾或加強干細胞增殖或分化的分子)，篩選毒素和/或其作用，檢測生物防御制劑從而使指定的嵌合體具有允許藥劑檢測的確定性質，通過具有能允許適當抗原提呈或促進/抑制免疫應答的功能的干或纟且細力包^H古用于癌癥治療，纟且織生成，纟且織再生，接種疫苗的新藥劑，同時為預后和診斷目的進行干或祖細胞基因分型(包括正常和病理標本)，遺傳紊亂的治療，非遺傳紊亂的治療，生物傳感器(其中干或祖細胞經選才奪可對不同的刺激進4亍應答，/人而可以在導入有機體后或作為獨立4全測器對內部或外部刺激進行應答)，損傷的治療，整形手術，和/或生長因子，抗凋亡蛋白或其它蛋白的生成。所選一奪的非整倍體嵌合體的特定類型取決于所采用的干或-且細月包類型。在一些實施方式中，選擇和/或維才寺具有凈亞佶-體嵌合體的細胞群。在一些實施方式中，選4奪和/或維持具有凈超倍體嵌合體的細月包群。在一些實施方式中，選擇和/或維持具有特定核型組合(例如，易位和/或具有不同亞倍體和/或超倍體和/或整倍體的細"包的混合物)的細力包群。目標非整倍體嵌合體的特定類型可通過對細月包群中核型分布的監(jiān)測以及確定目標表型或能力與特定核型分布之間的關聯進行簡單測定。該過程的范例可參見實施例。實施例中的步驟包括確定干細胞的核型分布，確定至少兩個不同干細胞群之間的核型差異，以及確定目標表型與該核型分布之一的關聯(例如，具有干細胞已在多種疾病，癥狀以及殘障的治療中引起了極大的興趣，因為它們才是供了細胞和組織的可再生來源。骨髓中稱為造血干細胞(HSCs)的血液形成干細胞是常用的干細胞類型。HSCs目前用于治療白血病，淋巴瘤以及多種遺傳性血液病癥。然而，HSCs和其它干細月包具有相當大的潛力可用于治療多種其它疾病。一系列報導提示特定的成體干細胞類型有能力分化成為多種細月包類型。例如，造血干細l包可分化成為腦細月包(神經元，少突細月包和星形細月包)(Hao等人，H.Hematother.5Ve淤Ce〃ie從12:23-32(2003);Zhao等人，iVw/.jc^/.Sc/,USA100:2426-2431(2003);Bonilla等人，A^/royc/.15:575-582(2002)),骨骼月幾細月包(Ferrari等人，5We"ce279:1528-1530(1998);Gussoni等人，A^&"401:390-394(1999)),心月幾細月包(Jackson等人，乂C/,"./"ve"107:1395-1402(2001》以及肝纟田月包(Lagasse等人，6:1229-1234,2000)。干細胞可用于治療任何類型的需要進行組織替換或再生的有機體問題，包括，但不限于，發(fā)育性障礙，感染，退行性疾病，物理或化學損傷(包括外傷引起的損傷)。外傷相關的癥狀的范例包括中樞神經系統(tǒng)(CNS)損傷(包括對腦部，脊髓和CNS周邊組織的損傷)，對外周神經系統(tǒng)(PNS)的損傷，或是對身體4壬意其它部分的損傷。該種外傷可能由意外引起，或是手術或血管成形術等醫(yī)療過程的正常或異常結果。該外傷可與如中風或靜脈炎中的血管石皮裂或堵塞有關。在特定的實施方式中，該細月包可用于自體或異體組織替換或再生治療或方案，包括，^旦不限于角膜上皮缺損治療，軟骨修復，面部皮膚磨削，粘膜，鼓膜，腸道內膜，神經結構(例如，一見網月莫，基底月莫中的聽覺神經元，嗅上皮的嗅覺神經元)，皮膚的燒傷和創(chuàng)傷性損傷創(chuàng)面修復，或其它損傷或患病器官或組織的再建。引起損傷的特定癥狀或紊亂包括，但不限于，心肌梗死，癲癇發(fā)作，多發(fā)性石更化，中風，低血壓，心臟停搏，缺血，炎癥，與年齡有關的i人知功能損失，輻射損傷，大腦性癱瘓，神經退4亍性疾病，阿爾茨海默病，帕金才架氏病，Leigh疾病，ADDS癡呆癥，記憶力損失，月幾萎縮側索硬化癥(ALS),缺血性腎臟疾病，腦或脊髓外傷，心肺轉流，青光眼，一見網月莫缺血，浮見網膜創(chuàng)傷，先天性代謝錯誤，腎上腺腦白質營養(yǎng)不良，嚢性纖維化，糖原貯積癥，曱習大&泉功能減退癥，鐮習犬細i包血癥，Pearson綜合;f正，Pompe疾病，苯丙酮尿癥(PKU)，吟啉病，4風糖尿癥，高胱胺酸尿癥，粘多l(xiāng)t病，'f曼性肉芽肺病和酪氨酸血癥，Tay-Sachs疾病，癌癥，腫瘤或其他病變或腫瘤癥習大。干細胞可選#^生包含其數量足以引導目標基因在患者體內表達的外源性核酸載體或生物載體。常規(guī)重組核酸載體的構建和表達已為本4頁i或7^知并包4舌在Sambrook等人，Mo/ecw/arC7o"/"gzj丄a6ora/or少Mawwa/,Vols1-3(2ded.1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress中所包含的l支術。該種4亥酉吏載體可包含在病毒和細菌等生物載體中，優(yōu)選包含在非病原性或減毒樣i生物(包4舌減毒病毒，細菌，寄生蟲以及病毒才羊顆4立)中。核酸載體或生物載體可通過體外體內基因治療方案導入細胞，該方案包括從患者體內摘耳又細胞或組織，將核酸載體或生物載體導入摘耳又的細月包或組織，并3奪該細月包或組織重新移才直進入患者體內(例如，參見K羅ll等人，為.//e禍，尸/7"環(huán).55:899-904(1998);Raymon等人，7Ve"ra/.144:82-91(1997);Culver等人，//w附.77zw.1:399-410(1990);Kasid等人，A^/.爿c^/.Sc/.U.S.A.87:473-477(1990))。該核酸載體或生物載體可通過如磷酸釣介導轉染等方法導入摘取的細胞或組織(Wigler等人,Ce//14:725(1978》Corsaro及Pearson,5b附加'cCe〃Ge"e"'c5"7:603(1981》Graham及VanderEb,Wra/，52:456(1973))。也可采用如電穿孔(Neumann等人，五MBO乂1:841-845(1982))等其它4支術一^fe酸載體導入宿主細月包。本發(fā)明的細月包還可與其它藥劑(例如其它細i包類型，生長因子和抗生素)耳關合施用。其它藥劑可由本領域普通寺支術人員所決定。特定的干細力包類型可通過采用對干細力包的目標類型具有特異性的細胞標記進行鑒定。細胞標記可以是細胞系標記，代i射才示i己，通i凡才示i己，生長因子，凈爭錄因子等。在凈爭定的實施方式中，特異性的細胞標記與具體的目標干細胞相關聯。細胞標記可通過本領域已知的方法(例如免疫組化或流式細月包術)4全測。流式細胞術可允許快速測量由適當光照的細胞或顆粒產生的光散射和熒光發(fā)射。該細力包或顆粒在單獨通過光束時生成信號。每個顆?；蚣毎粏为殰y量，該結果代表了單個細胞特征的累計。對細胞標記具有特異性的抗體可釆用熒光染料標記，乂人而可通過流式細胞儀進行4企測。熟練的技術人員將了解如何測定一種或多種適用細胞標記。在特定的實施方式中，對于人類胚胎干細月包，適用的標"i己包括Oct4,TRA-1-60,TRA-1-81,SSEA-4。4十對造血干細月包的示范性細月包標記包4舌CD34+,Sca-l+，AA4.1+和cKit+,且在特定的實施方式中這些標記表示鼠造血干細胞。在替代性的實施方式中，人造血干細月包可以是CD34+或CD34-，CD38+,CD38(-)，ckit+,Thy110,ClFR+或其組合。針對神經干細胞的示范性標記包括嵌套蛋白，CD133+，BIM1和Sox2等。心臟干細月包的示范性標i己包4舌如干細胞抗原-1，CD45(-)，CD34(-)，Scal+或其組合。腸干細胞標記包括如A33+,cFMS+，c-myb+,CD45(-)或其組合。皮月夫干細月包標i己包4舌角蛋白19。在一些實施方式中，可對干細胞篩選特定的非整倍體嵌合體(即，核型分布)以確認存在特定的非整倍體嵌合體(或選才奪性篩選特定的嵌合體)，然后移才直進入動物體內(例如，人或其它哺乳動物)。通過調節(jié)干細胞的培養(yǎng)條件，可(選才奪在移植前)將干細胞誘導分化為預期的細胞類型(例如，血細胞，神經元，肌肉細"包或其它細力包類型)。該過禾呈可確〗呆由導入的干細月包^尋到最佳分化和功能。在一些實施方式中，可在細胞增殖前，增殖后和/或增殖時測定核型分布。在這些實施方式中，該干細胞可在細胞群的非整倍體嵌合性的^r測前，檢測后或在4企測前后同時分裂。在一些實施方式中，可通過在細胞增殖期間和增殖后以及貯存后對非整倍體嵌合體的檢測來確認和/或選擇保留了與預期表型(例如，分化成為預期細胞類型的能力)相關的預期非整倍體嵌合體的細胞群。增殖可包括1,2,5,10,50或更多個細胞分裂周期。非整倍體嵌合體的水平和形式可通過定義對預期細胞類型和預期結果最佳的生長條件進行改變。如本實施例所述，細月包群內核型分布的4企測可允i午乂于保留或不保留分化能力的細胞群進行鑒別。本領域的技術人員可以利用該發(fā)現來鑒別和/或^吏用具有不同核型分布的細胞群以篩選與其它具有不同核型分布的細胞群相比優(yōu)先改變表型，抑制，殺死或i秀導某種細胞群增殖的分子。不希望受限于本發(fā)明的特定實施方式，作為一個實施例，可采用具有與分化成為預期細胞類型的能力相關的凈亞〗咅體嵌合核型的第一干細"包群和具有與分化成為預期細胞類型的能力缺失相關的凈超倍體嵌合核型的第二干細胞群在藥劑庫(小有機分子，或生物藥劑，例如抗體，siRNAs,核酸，肽等。)中進行篩選，并選擇能抑制超倍體群生長的藥劑。由于人們相信干細胞存在于腫瘤或癌癥群中，這同樣也是通過著眼癌癥干細l包的細l包增殖來鑒定抗癌藥劑的方法。這些藥劑可通過進一步選擇以鑒定不明顯抑制凈亞倍體細胞群生長的藥劑，從而鑒定可用于維持具有按照預期進行分化的能力的細胞的藥劑。替代性地，為預期細胞類型的能力。在前述部分實施方式中，鑒定了抑制凈亞倍體細胞群同時不明顯影響凈超倍體細胞群的藥劑。具體實施例方式由人胚胎干細胞(HESCs)的延續(xù)傳代產生的染色體不穩(wěn)定性4氣表了它們在安全和有效的治療應用中的潛在問題。最近，有才艮導顯示在HESC系中通過傳統(tǒng)細月包遺傳沖支術測得了核型異常。為確定在延續(xù)傳代后在當前HESCs中異常的范圍，我們對早代和晚代H7和H9HESCs以及鼠ESCs聯合采用了"光譜核型分析技術"和對染色體增加或減少的定量。除了對H7和H9夕卜，對每個HESC或鼠ESC以及包括非NIHHESCs的4企測獲得了類似的結果(數據未顯示)。與顯示了原代克隆超倍性的晚代細胞不同，早代細胞顯示了亞倍性。對嵌合非整倍體和整倍體哺乳動物ESC培養(yǎng)物分化成為神經元的能力進4于了評估，超〗咅體細月包顯示了明顯減少的分化潛能。這些^t據確定了哺乳動物ESC非整倍體的生理后果，并支持了對ESCs不同的非整倍體形式的常規(guī)監(jiān)測。導言對H7和H9HESC系(來自于WiCellResearchInstitute,Madison,WI)在36-44代(早^)和77-884義(晚4戈)之間進4亍分才斤。采用SKY,結合染色體增加和減少的廣泛定量對染色體互補和組織進行才企測。對所有可4妄受的中期分裂相的染色體減少或增加的翁:量進4亍定量并用這些值制圖，而非^f又對當前在傳統(tǒng)細月包遺傳過禾呈中所用的非整倍體細胞的代表性或保守形式進行鑒定和匯報。所觀察的非整倍體的顯著性可通過對非整倍體哺乳動物ESCs分化成為特定細胞類型(例如神經元)的能力的評估進4于測定。在此我們報導HESC系可顯示包括超倍性以及之前未有記錄的亞倍性形式在內的一系列非整倍性。結果HESCs顯示出隨才幾的染色體增加和減少以前采用傳統(tǒng)細胞遺傳學的研究曾才艮導HESCs在低代時基本上為整倍體(Thomson等人，1998;Amit等人，2000;Draper等人，2004a;Draper等人，2004b;Rosier等人，2004)。最近，Draper及其同事才艮導了在60代后，HI亞克隆H1.1A和Hl.lB出現了特別以染色體12或17的增加為特征的染色體變化(Draper等人，2004b)。為檢測該非整倍體基因型在延長傳代后的保留，參照已有的描述(Draper等人，20(Mb)培養(yǎng)H7和H9細月包系，并在不同的培養(yǎng)傳代后進行比較(圖1-2)。87代后顯示H7細月包染色體1和12的增力o,這與前述報導相一致。這些晚代H7細胞中的大部分均表征為特定染色體的超倍性，顯示非整倍體細胞的體外克隆擴增。定量后僅10%的細胞為整倍體(圖1)。78代后，H9中75%的細胞顯示了染色體12的i曾力口。通過比較，超過75%的僅擴增43代的早代細胞為數值整倍體(圖1)。群內其余均為非整倍體，^旦與晚代H7細胞不同的是，其主要由不具有明顯克隆性的亞倍體細胞組成(圖1)。這些結果顯示HESCs重復傳代后可產生不同形式的染色體不穩(wěn)定性，并對整倍體子群具有明顯不同的影響。在所有其它經斥企測的HESCs中均可觀察到類似的結果。為比較G顯帶和更具體的核型分析技術，我們同時采用了G顯帶和SKY-PK來分析兩個在早代時為100°/。整4咅體的hESC系(H7和H9)。通過標準方案(Barch,1997)收集相對低代(H743^(p43)，H9p37)和高^f義(H7p87,H9p78)的細月包。將才羊本送至細胞遺傳實驗室，通過G顯帶進行核型分析。在我們的實驗室對來自相同原始hESCs斷裂的樣本通過SKY-PK進行處理。對每個樣本，分別由兩個獨立的觀察者分析四十個中期分裂相。以表格形式記錄單個核型(表I)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>對于早代樣本，G顯帶研究才艮導了始終一致的100%整倍體率。與之截然不同的是，經SKY-PK鑒定介于72.5-80%的hESCs為整倍體。SKY-PK顯示早代嵌合非整倍體群為非克隆性且主要4旦不完全是亞倍體(具體核型參見表I)。相反地，對于晚代hESCs,G顯帶和SKY-PK產生了盡管不完全一致〗旦是類似的結果，大部分細胞顯示了克隆性染色體增加，而SKY-PK鑒定到了較少的嵌合非整倍體組成。由于多種原因，所觀察到能解釋多凄史嵌合體的染色體減少并非由技術誤差引起l)晚代hESC系中未見類似水平的隨機染色體損失；2)與現有分析(Rehen等人，2001，2005)—致，通過SKY-PK平行分析的人淋巴細胞>97%為整倍體；3)此處和已有研究中也檢測到了超倍體。此外，我們由hESCs得到的數據與鼠ESCs中觀察到的各種非整倍性程度相一致(Eggan，2002)。與神經元分化抑制相關的染色體增加HESCs的關4建貢獻在于它們分化成為普通，成熟細胞的最終能力。大量證據顯示可對ES細胞的分化進行調節(jié)以獲得神經元細胞富集群。在作為飼養(yǎng)細胞時，間質PA6細胞通過i秀導小鼠ES集落成為Tuj-l陽性促進神經分化并具有強神經突生長性(Kawasaki等人，2000)。為4企查非整〗咅體相對整4咅體細力包的分化潛力，對經過(非整倍體)或未經(整倍體)紫杉醇處理的哺乳動物ESCs;險查其在與PA6細胞共培養(yǎng)時分化成為神經元的能力。1周的分化后，55%的紫杉醇處理細月包增加了染色體(圖3)。此外，在對細胞進行固定和針對tuj1染色后，紫杉醇處理培養(yǎng)中的神經元分化集落數量明顯減少。這些結果顯示不同的非整倍體水平和形式可改變i咅養(yǎng)ESCs的神經元分化潛能。討論干細力包研究的長遠目的在于開發(fā)衰竭'1"生疾病治療的朝-療法。為實現這一目的，需要得到即使在延續(xù)傳代后依然顯示可再生能力的HESC系。HESC系中染色體不穩(wěn)定性的存在可以改變HESCs的生理功能。通過SKY結合對HESCs中非整倍體形式的定量可觀察到許多不同形式的普遍非整倍體。哺乳動物ESCs中非整倍體的功能后果未曾得到過檢查，其令人驚奇的是，至少非整倍體的兩種形式(超倍體和亞倍體)并不等同超倍體而非亞倍體與分化抑制(至少對于神經元系)相關。與過去的研究中更為傳統(tǒng)的細月包遺傳學4支術不同，采用SKY在HESCs上鑒定非整倍體形式未曾得到廣泛才艮導。SKY允許對染色體一致性和易位進行明確的鑒定，并曾廣泛用于癌癥的研究(Schrock等人，1996;Difilippantonio等人，2000)。除SKY夕卜，對中期分裂相值而非相對少量的樣本分裂相值的定量(Amit等人,2000;Buzzard等人，2004;Draper等人，2004b;Mitalipova等人，2005)可在HESCs中鑒定令人驚奇的大量和多樣的染色體增加和減少，并區(qū)分早代和晚代之間的一般區(qū)別(亞倍體相對超倍體)。這些才支術方法揭示了染色體不穩(wěn)、定性并非必然在HESCs中形成非整倍體的保守模式。87代后，90%的H7細胞為非整倍體，且大部分細胞顯示了染色體1和12的增加。在所有晚代哺乳動物ESCs中均觀察到了染色體增加的趨勢，特別是我們檢測的HESCs(包括來自非NTH來源的HESCs)。HESC非整倍體涉及何種生理意義或治療風險？非整倍體(特別是超倍體)曾與癌癥形成相關聯(Lengauer等人，1997,1998;Rajagopalan等人,2003;Lengauer和Wang,2004;Rajagopalan和Lengauer，2004)，至今仍是與"f吏用HESCs有關的一種可能的風險因子。其它的可能性包括可能干擾目標突變體的胚系傳遞核型異常(Liu等人，1997),并且是無法對成熟小鼠嵌合體所有組織獲得貢獻的主要原因(Longo等人，1997)。這些小鼠中的結果提示染色體不穩(wěn)定性(特別是超倍體和易位)可能導致HESC多能性的減少。與該觀點一致，超倍體ESCs細胞無法明顯分化為神經元系。通過比較，亞倍體與分化的常^見水平相容。這與小鼠神經祖纟田胞(Rehen等人，2001;Kaushal等人，2003;Yang等人,2003;McConnell等人，2004,Kingsbury等人，2005)和小鼠ES細月包(Eggan等人，2002)中觀察到的正常發(fā)育性非整倍體相呼應。在神經細胞中存在的亞倍體已顯示與小鼠和人神經元的正常分化相容(Kaushal等人，2003;Rehen等人，2005)。在非整倍體神經元中還可能存在其它表型或功能性差異，然而這些差異可能4艮好地代表了在正常中才區(qū)系統(tǒng)中所，見察到的情況(Kingsbmy等人，2005)。綜上所述，這些結果將超倍體區(qū)分為一種對哺乳動物ESCs的正常分化有害的基因型，盡管該種細胞可能具有其它有用的功能。通過比4交，亞倍體不干護C正常分化，且其存在似乎反映了發(fā)育階段組織中正常觀察到的情況。應當著重指出，這些區(qū)別是通過<吏用與現今多婆t臨床細胞遺傳學實-驗室釆用的有限采樣標準所不同的靈每丈:技術如SKY和染色體減少和增加定量所鑒定得到。最近據顯示當前的NIH-資助的HESC系受到了Neu5Gc的污染(許多人具有針對它的循環(huán)抗體)(Martin等人，2005)。非生理非整倍體可代表在評估HESC系的治療有用性時需考慮的另一種可變因素。同時對現有的和新型的HESC系導入常^見的、壽文感核型，通過基于HESC研究和治療中所使用的染色體嵌合體來定義理想的細胞系，從而才是高成功4吏用HESCs的可能性。方法HESC培養(yǎng)H7HESCs(WiCellResearchInstitute,Inc.,Madison，WI)在有絲分裂失活(絲裂霉素C處理)的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF,Specialtymedia,Phillipsburg，NJ)上于DMEM/F12Glutamax(Gibco，Carlsbad，CA),20%"敲除"血清替代品(Gibco),0.1mM非必需氨基酸(Gibco)，0.1mM卩-巰基乙醇(Gibco)和4ng/mLFGF-2(R&Dsystems,Minneapolis,MN)中進4亍i咅養(yǎng)。每5—6天以月交原酶/月夷蛋白酶(Gibco)對集落進行傳代。將細胞與包括Oct4，SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的未分化標記進行免疫反應。此夕卜，超過90%的集落顯示出堿性磷酸酶活性。細胞對鼠胚胎標記SSEA-1和神經標記如嵌套蛋白(神經前體標記)；不成熟神經元標^己Tuj-1和Map2(a+b);成熟一申經元標記NeuN;星形細月包標i己GFAP和slOO-卩以及少突細胞標記04,GST兀和RIP呈免疫陰性。ESC的神經元分化將小鼠ESC與PA6纟田胞在分化條件(DMEM/F12Glutamax(Gibco，Carlsbad,CA),10。/o"敲除"血清替代品(Gibco)，O.lmM非必需氨基酸(Gibco)以及0.1mMp-巰基乙醇(Gibco))下共培養(yǎng)一周(Kawasaki等人，2002)。以紫杉醇(Sigma)在2.5nM的濃度下處J里細月包。免疫熒光染色免疫熒光染色參照已有描述(Gage等人，1995)采用a-卩-樣i管蛋白-III(Tuj國1;1/1000,Covance)進4亍。二抗乂人JacksonImmunoResearch購得。HESC的光譜核型分析(SKY):HESC染色體相可通過標準方案獲取(Barch等人，1997;Rehen等人，2001)。參照生產商說明4吏用4',6-二脒基-2-苯基吲咮(DAPI)(Sigma)和SKYH-10試劑盒(AppliedSpectralImaging,Inc.,Carlsbad,CA)。數據分析對各樣本，獲取40個中期分裂相并以SKY分析，獲取70個以DAPI復染色的中期分裂相進4亍非整4咅體定量。實施例中引用的參考文獻AmitM，CarpenterMK，InokumaMS,ChiuCP，HarrisCP,WaknitzMA，Itskovitz誦EldorJ，ThomsonJA(2000)Clonallyderivedhumanembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandproliferativepotentialforprolongedperiodsofculture.DevBiol227:271-278.BarchMJ，KnutsenT，SpurbeckJL(1997)TheAGTCytogeneticsLaboratoryManual.Lippincott:Philadelphia.BuzzardJJ,GoughNM,CrookJM,ColmanA(2004)KaryotypeofhumanEScellsduringextendedculture.NatBiotechnol22:381-382;authorreply382.CarpenterMK,RosierES，FiskGJ，BrandenbergerR,AresX，MiuraT,LuceroM,RaoMS(2004)Propertiesoffourhumanembryonicstemcelllinesmaintainedinafeeder-freeculturesystem.DevDyn229:243-258.ChengL,HammondH，YeZ,ZhanX，DravidG(2003)Humanadultmarrowcellssupportprolongedexpansionofhumanembryonicstemcellsinculture.StemCells21:131-142.DifilippantonioMJ,ZhuJ，ChenHT,MeffreE,NussenzweigMC,MaxEE,RiedT，NussenzweigA(2000)DNArepairproteinKu80suppresseschromosomalaberrationsandmalignanttransformation.Nature404:510-514.DraperJS,MooreHD,RubanLN,GokhalePJ,AndrewsPW(2004a)Cultureandcharacterizationofhumanembryonicstemcells.StemCellsDev13:325-336.DraperJS,SmithK,GokhaleP,MooreHD，MaltbyE,JohnsonJ,MeisnerL,ZwakaTP,ThomsonJA，AndrewsPW(2004b)Recurrentgainofchromosomes17qand12inculturedhumanembryonicstemcells.NatBiotechnol22:53-54.EgganK,RodeA,JentschI,SamuelC,HennekT,TintmpH，ZevnikB，ErwinJ，LoringJ，Jackson-GrusbyL,SpeicherMR,KuehnR，JaenischR(2002)Maleandfemalemicederivedfromthesameembryonicstemcellclonebytetraploidembryocomplementation.NatBiotechnol20:455-459.GageFH,CoatesPW，PalmerTD,KuhnHG，FisherLJ,SuhonenJO,PetersonDA，SuhrST，RayJ(1995)Survivalanddifferentiationofadultneuronalprogenitorcellstransplantedtotheadultbrain.ProcNatlAcadSciUSA92:11879-11883.KaushalD,ContosJJ,TreunerK,YangAH，KingsburyMA，RehenSK,McCo羅llMJ，OkabeM，BarlowC，ChunJ(2003)Alterationofgeneexpressionbychromosomelossinthepostnatalmousebrain.JNeurosci23:5599-5606.KawasakiH，MizusekiK，NishikawaS,KanekoS,KuwanaY,NakanishiS,NishikawaSI,SasaiY(2000)InductionofmidbraindopaminergicneuronsfromEScellsbystromalcell-derivedinducingactivi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GK101355873SQ200680050653公開日2009年1月28日申請日期2006年11月9日優(yōu)先權日2005年11月9日發(fā)明者云春·容,史蒂文斯·卡斯楚普·雷漢,羅爾德·軍明·曾,蘇珊娜·厄爾林·彼得森,茹爾金·威廉·韋斯特拉申請人:斯克利普斯研究院