基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種寡糖非還原胺化衍生化的方法，尤其是涉及一種基于含磷苯胺衍 生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，包括以含磷苯胺衍生物為衍生化試劑，在甲醇水混合 溶劑中使寡糖衍生化的反應(yīng)。具體來(lái)講，所述方法使用還原性寡糖為寡糖原料，含磷苯胺衍 生物為衍生化試劑，在甲醇水混合溶劑中反應(yīng)生成含磷苯胺衍生物衍生化的寡糖。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)的糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾，它參與、調(diào)控生命體的眾多生物 功能，比如說(shuō)胚胎的發(fā)育、蛋白的折疊、細(xì)胞粘附、免疫響應(yīng)等等。其生物功能的多樣性源于 寡糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。因此，糖蛋白上寡糖結(jié)構(gòu)的分析及鑒定對(duì)理解其生物功能具有非常重 要的意義。在諸多技術(shù)手段中，質(zhì)譜技術(shù)因其快速、靈敏、樣品消耗量少等特點(diǎn)在寡糖結(jié)構(gòu) 的分析、鑒定中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。
[0003] 寡糖在質(zhì)譜中的離子化效率較低，一直制約著質(zhì)譜技術(shù)在糖檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，因 此一般需要對(duì)寡糖進(jìn)行衍生化。傳統(tǒng)的還原胺化衍生化方法需要用到毒性高的還原試劑， 如硼氫化鈉，而且與下游的質(zhì)譜檢測(cè)不兼容，需要繁瑣的分離純化步驟，容易造成樣品損 失。后來(lái)又發(fā)展了非還原胺化衍生化法，如利用3-氨基喹啉、2-氨基吡嗪及苯胺作為非還 原胺化衍生化試劑。
[0004] 研宄表明，磷?；贓SI質(zhì)譜分析中具有較強(qiáng)的增敏效應(yīng)。將氨基酸氮端磷酰化 修飾后進(jìn)行MALDI-MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)磷酰基可以有效抑制低分子量區(qū)域的基質(zhì)峰的干擾，增強(qiáng) 小分子氨基酸的MALDI質(zhì)譜信號(hào)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于結(jié)合苯胺與還原糖的非還原胺化反應(yīng)及磷?；贛ALDI-MS中 的增敏效應(yīng)，提供一種工藝較為簡(jiǎn)單的基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方 法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合，水浴反應(yīng) 后，利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物對(duì)麥芽五糖的衍生化效果；
[0008] 2)以NA2、核糖核酸酶B上連接的寡糖及雞卵清蛋白上連接的寡糖為寡糖來(lái)源，考 察高分子量寡糖、復(fù)雜寡糖庫(kù)的衍生化效果及質(zhì)譜增敏效應(yīng)。
[0009] 在步驟1)中，所述將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混 合以麥芽五糖為模型；所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液可采用含有l(wèi)mg/mL含磷 苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液，乙酸-甲醇溶液中乙酸與甲醇的體積比可為1:9;所述含 有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液的體積比可為1 : 1，所述麥芽五糖 水溶液的濃度可為100Ug/mL;所述水浴反應(yīng)的條件可在75°C水浴反應(yīng)3h;所述含磷苯胺 衍生物如表1所示。
[0010] 與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：
[0011] 1)可以廣泛應(yīng)用到各種還原性寡糖及復(fù)雜寡糖庫(kù)；
[0012] 2) "一步衍生化"；
[0013] 3)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需純化；
[0014] 4)反應(yīng)時(shí)間短（約3h);
[0015] 5)衍生化效率可達(dá)到95%以上；
[0016] 6)質(zhì)譜中響應(yīng)信號(hào)及信噪比提高約2?5倍。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是基于含磷苯胺衍生物作為非還原胺化衍生化試劑的寡糖衍生化方法反應(yīng) 通式。
[0018] 圖2是在最佳條件下，未衍生化的麥芽五糖（A)及應(yīng)用本方法衍生化的麥芽五糖 (B)的質(zhì)譜圖。橫軸為質(zhì)荷比（m/z)，縱軸為信號(hào)強(qiáng)度（Intensity)。
[0019] 圖3是在最佳條件下，未衍生化的NA2 (A)及應(yīng)用本方法衍生化的NA2 (B)的質(zhì)譜 圖。橫軸為質(zhì)荷比（m/z)，縱軸為信號(hào)強(qiáng)度（Intensity)。
[0020] 圖4是在最佳條件下，來(lái)源于核糖核酸酶B的未衍生化的寡糖混合物（A)及 應(yīng)用本方法衍生化的寡糖混合物（B)的質(zhì)譜圖。橫軸為質(zhì)荷比（m/z)，縱軸為信號(hào)強(qiáng)度 (Intensity)〇
[0021] 圖5是在條件下，來(lái)源于雞卵清蛋白的未衍生化的寡糖混合物（A)及應(yīng)用本方法 衍生化的寡糖混合物（B)的質(zhì)譜圖。橫軸為質(zhì)荷比（m/z)，縱軸為信號(hào)強(qiáng)度（Intensity)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明涉及一種寡糖的基于含磷苯胺衍生物的非還原胺化衍生化方法，以 4-DPPBA為例，其反應(yīng)的通式如圖1所示。
[0023] 表1是本發(fā)明中所涉及的含磷苯胺衍生物分子結(jié)構(gòu)式。圖2?5中所涉及的含磷 苯胺衍生物均以4-DPPBA為例加以說(shuō)明。
[0024]表1
[0025]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合，水浴反應(yīng)后，利 用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物對(duì)麥芽五糖的衍生化效果； 2) 以NA2、核糖核酸酶B上連接的寡糖及雞卵清蛋白上連接的寡糖為寡糖來(lái)源，考察高 分子量寡糖、復(fù)雜寡糖庫(kù)的衍生化效果及質(zhì)譜增敏效應(yīng)。
2. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合以麥芽 五糖為模型。
3. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液采用含有l(wèi)mg/mL含磷苯胺衍生 物的乙酸-甲醇溶液。
4. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，乙酸-甲醇溶液中乙酸與甲醇的體積比為1 : 9。
5. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液的體積比為 1 ： 1〇
6. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述麥芽五糖水溶液的濃度為100 μ g/mL。
7. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述水浴反應(yīng)的條件是在75°C水浴反應(yīng)3h。
8. 如權(quán)利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，其特征在于 在步驟1)中，所述含磷苯胺衍生物如表1所示。
【專(zhuān)利摘要】基于含磷苯胺衍生物的寡糖非還原胺化衍生化方法，涉及一種寡糖非還原胺化衍生化的方法。1)將含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液與麥芽五糖水溶液混合，水浴反應(yīng)后，利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物對(duì)麥芽五糖的衍生化效果；2)以NA2、核糖核酸酶B上連接的寡糖及雞卵清蛋白上連接的寡糖為寡糖來(lái)源，考察高分子量寡糖、復(fù)雜寡糖庫(kù)的衍生化效果及質(zhì)譜增敏效應(yīng)。1)可以廣泛應(yīng)用到各種還原性寡糖及復(fù)雜寡糖庫(kù)；2)“一步衍生化”；3)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需純化；4)反應(yīng)時(shí)間短(約3h)；5)衍生化效率可達(dá)到95％以上；6)質(zhì)譜中響應(yīng)信號(hào)及信噪比提高約2～5倍。
【IPC分類(lèi)】C07F9-53, C07F9-40, C07H15-02, G01N27-64, C07H1-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104610387
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510031319
【發(fā)明人】劉艷, 甘杰鵬, 袁航, 趙玉芬
【申請(qǐng)人】廈門(mén)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年1月22日