的優(yōu)良單株，取得同意后采果留種，經(jīng)多代自交提純留種而成?；謴?fù)系139D-21-3在本專利申請日前公眾可以從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院購買獲得，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院已于2014年10月起向公眾發(fā)放該生物材料,主要特征為:早熟,座果能力極強(qiáng)，葉色深綠；高抗病毒病,耐高低溫能力強(qiáng)；果實(shí)縱徑約18cm，橫徑約1.5cm，單果重約1g ;果形為細(xì)羊角型，果條筆直美觀，果表色澤鮮亮，綠熟果深綠色，老熟果火紅色；經(jīng)鑒定基因型為(N) MsMs。
[0018]辣椒不育系材料131BC5A: 2009年從浙江省杭州博邦種子有限公司引進(jìn)的三系配套雜交一代品種‘艷陽’的分離后代中獲得的不育株，經(jīng)大量測交選出優(yōu)良不育系131，經(jīng)5代回交而成。不育系材料131BC5A為自育材料在本專利申請日前公眾可以從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院購買獲得，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院已于2014年10月起向公眾發(fā)放該生物材料，主要特征為:生長勢強(qiáng)，葉色深綠，高抗病毒??；花藥萎縮不開裂或微裂，無花粉，不育性狀穩(wěn)定，經(jīng)鑒定基因型為(S) msms。
[0019]②雜交方法:
以不育系131BC5A為為母本，恢復(fù)系139D-21-3為父本，獲得？1雜交組合131BC5A x139D-21-3, Fl 自交獲得 131BC5A x 139D-21-3 F2分離群體。
[0020]本發(fā)明按以下步驟進(jìn)行:
1、SSR分子標(biāo)記的引物設(shè)計(jì):在網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫SGN (http://sgn.Cornell, edu/)和ThePepper Genome Database (http://peppersequence.genomics.cn)中找分布于辣椒 6 號染色體上的SSR標(biāo)記,并進(jìn)行篩選。SSR標(biāo)記主要是利用SSRHunter軟件及gramene網(wǎng)站上 SSRtool (http://archive.gramene.0rg/db/markers/ssrtool)尋找重復(fù)序列，并用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。
[0021]2、辣椒基因組DNA的提取:取辣椒131BC5AU39D-21-3親本和F1J2代各單株樣品苗期幼嫩葉片0.02-0.05g克，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用；
3、基因組DNA的PCR擴(kuò)增:在各PCR管中分別加入步驟(2)提取的各辣椒樣品基因組DNA IyL后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，步驟(I)設(shè)計(jì)的上下游引物各0.25 μ L，加無菌純水至10 μ L，PCR反應(yīng)程序:94°C 3 min預(yù)變性后，接著94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72°C延伸5 min，產(chǎn)物4°C保存；
4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上樣緩沖液
2.5yL，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的底端處停止電泳；最后銀染顯色，進(jìn)行觀察，用數(shù)碼相機(jī)拍照保存；共顯性標(biāo)記統(tǒng)計(jì)方法，與母本131BC5A —致的帶型記為b，與父本139D-21-3 —致的帶型記為a，雜合的帶型記為h ；
5、篩選出與辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記P印43和P印20:pep43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，P印20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示；
6、辣椒樣品恢復(fù)基因的檢測:按步驟(4)所述的標(biāo)記統(tǒng)計(jì)方法來確定辣椒樣品是否具有恢復(fù)基因(見圖1)。
[0022]實(shí)施例2、(用本發(fā)明的標(biāo)記引物對辣椒雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行檢測)
本例所述辣椒材料:辣椒不育系對照材料:131BC5A，編號為I ;恢復(fù)系對照材料:139D-21-3，編號為2 ;自選辣椒恢復(fù)材料:編號為5、6和7 ;自選辣椒不育材料:編號為3、4、8和9 ;
檢測方法按以下步驟進(jìn)行:
1、辣椒基因組DNA的提取:取待檢測辣椒樣品苗期幼嫩葉片各0.02-0.05克，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用；
2、基因組DNA的PCR擴(kuò)增:在各PCR管中分別加入步驟(I)提取的各辣椒樣品基因組DNA IyL后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，ρ印43或ρ印20上下游引物各0.25 μ L，加無菌純水至10 μ L ;擴(kuò)增條件、程序同實(shí)施例1 ;
3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上樣緩沖液2.5μ L，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，具體分析同實(shí)施例1 ;
4、辣椒樣品恢復(fù)基因的檢測:標(biāo)記統(tǒng)計(jì)方法同實(shí)施例1(見圖2)。
[0023]實(shí)施例3、(用本發(fā)明試劑盒對不同辣椒材料恢復(fù)基因的檢測)
本例所述辣椒材料:辣椒不育系對照材料:131BC5A，編號為I ;恢復(fù)系對照材料:139D-21-3，編號為2 ;自選辣椒恢復(fù)材料:編號為3、5、8、9和11 ;自選辣椒不育材料:編號為4、6和7 ;保持系N (msms) 08-131:編號為10 ;地方辣椒材料08032:編號為12 ；
檢測方法按以下步驟進(jìn)行:
1、辣椒基因組DNA的提取:取待檢測辣椒樣品苗期幼嫩葉片各0.02-0.05克，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用；
2、基因組DNA的PCR擴(kuò)增:用試劑盒提供的引物和試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體積為104 1^;加入0嫩模板14 1^，2父Taq PCR MasterMix 5.μ L，上下游引物各0.25 yL，加無菌純水至10 μ L ;擴(kuò)增條件、程序同實(shí)施例1; 3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由試劑盒提供的上樣緩沖液2.5 μ L，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，具體分析同實(shí)施例1 ;
4、辣椒樣品恢復(fù)基因的檢測:標(biāo)記統(tǒng)計(jì)方法同實(shí)施例1(見圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為pep43標(biāo)記或pep20標(biāo)記: P印43標(biāo)記:上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示； P印20標(biāo)記:上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
2.一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)SSR分子標(biāo)記的引物設(shè)計(jì):在網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫SGN和ThePepper Genome Database中找分布于辣椒6號染色體上的SSR標(biāo)記，并進(jìn)行篩選；SSR標(biāo)記主要是利用SSRHunter軟件及gramene網(wǎng)站上SSRtool尋找重復(fù)序列，并用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物； 2)辣椒基因組DNA的提取:取辣椒131BC5AU39D-21-3親本和F1、F2代各單株樣品苗期幼嫩葉片0.02~0.05g克，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用； 3)基因組DNA的PCR擴(kuò)增:在各PCR管中分別加入步驟2)提取的各辣椒樣品基因組DNA I μ L后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，步驟I)設(shè)計(jì)的上下游引物各0.25 μ L，加無菌純水至10 μ L，PCR反應(yīng)程序:94°C 3 min預(yù)變性后，接著94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72°C延伸5 min，產(chǎn)物4°C保存； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上樣緩沖液2.5 yL，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的底端處停止電泳；最后銀染顯色，進(jìn)行觀察，用數(shù)碼相機(jī)拍照保存；共顯性標(biāo)記統(tǒng)計(jì)方法，與母本131BC5A —致的帶型記為b，與父本139D-21-3 —致的帶型記為a，雜合的帶型記為h ； 5)篩選出與辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記pep43和pep20:pep43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，P印20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
3.一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 1)根據(jù)目標(biāo)基因篩選獲得兩個(gè)與辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，pep43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物如SEQ ID NO:2所示，pep20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示； 2)辣椒基因組DNA的提取:將各待檢測辣椒樣品用CTAB法提取基因組DNA后，分別保存，備用； 3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為1yL, I μ L DNA模板，2Χ Taq PCRMasterMix 5.μ L, pep43標(biāo)記或pep20標(biāo)記的上、下游引物各0.25 yL,無菌純水3.5yL;PCR反應(yīng)程序?yàn)?MV 3 min預(yù)變性后，接著94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，最后72°C延伸5 min，產(chǎn)物4°C保存； 4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上樣緩沖液2.5μ L，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，至溴酚蘭到達(dá)凝膠的底端處停止電泳；最后銀染顯色，進(jìn)行觀察、照相； 5)辣椒樣品恢復(fù)基因的檢測:按共顯性標(biāo)記統(tǒng)計(jì)方法，與母本131BC5A —致的帶型記為b，與父本139D-21-3 —致的帶型記為a，雜合的帶型記為h，以確定辣椒樣品是否具有恢復(fù)基因。
4.一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括盒體和6支PCR管，在2支PCR管中分別裝有2 X Taq PCR MasterMix和聚丙烯酰胺凝膠上樣緩沖液，在其他4支PCR管中分別裝辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記方法用引物，所述的為pep43標(biāo)記或pep20標(biāo)記:pep43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示；pep20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示,下游引物如SEQ ID NO:4所示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域，尤其涉及辣椒雄性不育恢復(fù)基因<i>Rf</i><i></i>連鎖的SSR標(biāo)記及其在辣椒雄性不育育種材料選擇中的應(yīng)用。辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為pep43標(biāo)記或pep20標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記的開發(fā)可加速辣椒雄性不育的選育進(jìn)程，提高育種效果，對辣椒CMS三系的分類和選育提供理論依據(jù)；采用自主開發(fā)的SSR引物和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的PCR？技術(shù)，通過對辣椒植株的檢測，選出具有恢復(fù)基因的植株。該方法是對遺傳物質(zhì)的檢測，方便、重復(fù)性好，且周年均可進(jìn)行；本發(fā)明所提供的試劑盒，將檢測用引物和相關(guān)試劑綜合組裝在一盒內(nèi)，方便實(shí)施操作，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104561297
【申請?zhí)枴緾N201410839753
【發(fā)明人】葉青靜, 楊悅檢, 阮美穎, 王榮青, 周國治, 姚祝平, 李志邈, 萬紅建, 程遠(yuǎn)
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月29日