一種檢測辣椒雄性不育恢復(fù)基因的ssr分子標(biāo)記方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域，尤其涉及辣椒雄性不育恢復(fù)基因沿連鎖的SSR標(biāo)記及其在辣椒雄性不育育種材料選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]辣椒{Capsicum annuum L.)是一種世界性的蔬菜,在蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位。雄性不育是作物育種的重要性狀之一。辣椒屬于雜種優(yōu)勢非常明顯的常異花授粉作物，利用雄性不育性狀可以解決雜種優(yōu)勢人工去雄這一難題，降低生產(chǎn)成本。辣椒雄性不育可分為核質(zhì)互作雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)和細胞核雄性不育(Geneticmale sterility, GMS)，其中CMS需要同時選育“三系”，包括可育型細胞質(zhì)的保持系N(msms);不育型細胞質(zhì)的雄性不育系S (msms);控制育性的恢復(fù)系S (MsMs)或N (MsMs)。辣椒CMS三系配套育種中恢復(fù)系是配制雜交種的前提(馬勇等，2008)。辣椒CMS的研究已應(yīng)用于商業(yè)化雜交制種中。在生產(chǎn)上，恢復(fù)基因是辣椒雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，而目前辣椒CMS不育系應(yīng)用的最大阻礙是育性恢復(fù)基因分布不廣泛，恢復(fù)基因主要存在于線椒、牛角椒和羊角椒類型中(鄒學(xué)校，1991 ;劉金兵，等，1999)，大部分燈籠椒中不含恢復(fù)基因。三系的選育周期長，如果能找到與恢復(fù)基因或不育基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，有助于縮短選育過程。
[0003]Peterson(1958)首次報道了辣椒雄性不育CMS，此后對辣椒CMS恢復(fù)基因的標(biāo)記、定位、基因的遺傳及其相互之間的關(guān)系等研究受到廣泛重視。Peterson (1958),Yu (1990)和Gulyas等(2006)研究表明辣椒育性恢復(fù)主要被一個顯性核基因控制。Wang等(2004)利用QTL方法研究認(rèn)為辣椒CMS育性恢復(fù)受I個主效基因和4個微效基因控制。魏兵強等(2013)研究認(rèn)為辣椒CMS恢復(fù)性可能由2對加性一顯性上位性主基因和加性一顯性多基因控制。
[0004]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)已在辣椒恢復(fù)系選育種得到應(yīng)用。辣椒雄性不育的恢復(fù)主要由一個核恢復(fù)基因Rf控制，核恢復(fù)基因Rf的存在能抑制不育基因的表達，從而使育性得到恢復(fù)。至今，辣椒的核恢復(fù)基因尚未被克隆，的分子標(biāo)記與定位已取得了較好的進展，多個與Rf基因連鎖的標(biāo)記被開發(fā)出來，如0PP13-CAPS(1.1 cM)、AFRF8CAPS (1.8 cM)、PR-CAPS (1.8 cM)及 CRF-SCAR (5.3 cM)等(Kim 2005;Kim et al.2006 ; Lee et al.2008 ; Gulyas et al.2006 )。
[0005]Zhang 等(2000)篩選出 2 個與沿連鎖的 RAPD 標(biāo)記 0P13 1400 (0.37 cM)和 0W18.(8.12 CM);唐冬英(2002)利用不育系9704A和恢復(fù)系8001構(gòu)建F2群體，獲得I個與Rf&鎖的 RAPD 分子標(biāo)記 QPL09-763 (4.18cM)；Lee 等(2004)和 Gulyas 等(2006)利用一個與
連鎖的 RAI3D 標(biāo)記 0PT-02/570 (5 cM)開發(fā)出一個 STS 標(biāo)記 CRF-SCAR ;Kim 等(2006)運用AFLP技術(shù)獲得了與沿連鎖的標(biāo)記AFRF8CAPS (1.8cM)，并利用2個RAPD標(biāo)記0P130W18.和I個CAPS標(biāo)記AFRF8CAPS對沿基因進行了定位；Lee等(2008)研究發(fā)現(xiàn)辣椒雄性部分恢復(fù)現(xiàn)象的Pr/Pr基因型的花粉表現(xiàn)為全可育，而pr/pr基因型的花粉表現(xiàn)為部分可育，并開發(fā)出I個與Pr緊密連鎖的CAPS標(biāo)記PR-CAPS (1.8 cM)，pr基因與連鎖；楊娟等(2010)利用SSR標(biāo)記將Rf基因定位于辣椒第6號染色體上，AF208834與Rf基因的遺傳距離為20.8 CM，相距較遠，不能直接應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種。
[0006]SSR分子標(biāo)記的開發(fā)可加速辣椒雄性不育的選育進程，提高育種效果，對辣椒CMS三系的分類和選育提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的第一個目的是提供一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記，本發(fā)明的二個目的是提供一種上述的分子標(biāo)記的篩選方法，本發(fā)明的第三個目的是提供一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記方法，該方法可以快速、準(zhǔn)確檢測辣椒雄性不育恢復(fù)基因。本發(fā)明的第三個目的是提供采用上述方法的一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記的試劑盒。
[0008]為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為pep43標(biāo)記或P印20標(biāo)記:
P印43標(biāo)記:上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示；
P印20標(biāo)記:上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
[0009]為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記的篩選方法，該方法包括以下的步驟:
1)SSR分子標(biāo)記的引物設(shè)計:在網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫SGN和ThePepper Genome Database中找分布于辣椒6號染色體上的SSR標(biāo)記，并進行篩選；SSR標(biāo)記主要是利用SSRHunter軟件及gramene網(wǎng)站上SSRtool尋找重復(fù)序列，并用Primer5軟件設(shè)計引物；
2)辣椒基因組DNA的提取:取辣椒131BC5AU39D-21-3親本和F1、F2代各單株樣品苗期幼嫩葉片0.02-0.05g克，按常規(guī)CTAB法提取DNA后，分別保存，備用；
3)基因組DNA的PCR擴增:在各PCR管中分別加入步驟2)提取的各辣椒樣品基因組DNA I μ L后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，步驟I)設(shè)計的上下游引物各0.25 μ L，加無菌純水至10 μ L，PCR反應(yīng)程序:94°C 3 min預(yù)變性后，接著94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35個擴增循環(huán)，最后72°C延伸5 min，產(chǎn)物4°C保存；
4)PCR擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上樣緩沖液
2.5yL，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，至溴酚蘭到達凝膠的底端處停止電泳；最后銀染顯色，進行觀察，用數(shù)碼相機拍照保存；共顯性標(biāo)記統(tǒng)計方法，與母本131BC5A —致的帶型記為b，與父本139D-21-3 —致的帶型記為a，雜合的帶型記為h ；
5)篩選出與辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖分子標(biāo)記pep43和pep20:pep43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，P印20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
[0010]為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記方法，該方法包括以下步驟: 1)根據(jù)目標(biāo)基因篩選獲得兩個與辣椒雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，ΡΘΡ43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物如SEQ ID NO:2所示，pep20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示；
2)辣椒基因組DNA的提取:將各待檢測辣椒樣品用CTAB法提取基因組DNA后，分別保存，備用；
3)PCR擴增反應(yīng)體系:擴增反應(yīng)的總體積為1yL, I μ L DNA模板，2Χ Taq PCRMasterMix 5.μ L, pep43標(biāo)記或pep20標(biāo)記的上、下游引物各0.25 yL,無菌純水3.5yL;PCR反應(yīng)程序為-MV 3 min預(yù)變性后，接著94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，35個擴增循環(huán)，最后72°C延伸5 min，產(chǎn)物4°C保存；
4)PCR擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析:各樣品分別取擴增產(chǎn)物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚蘭、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上樣緩沖液2.5μ L，混勻；將混合物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，至溴酚蘭到達凝膠的底端處停止電泳；最后銀染顯色，進行觀察、照相；
5)辣椒樣品恢復(fù)基因的檢測:按共顯性標(biāo)記統(tǒng)計方法，與母本131BC5A—致的帶型記為b，與父本139D-21-3 —致的帶型記為a，雜合的帶型記為h，以確定辣椒樣品是否具有恢復(fù)基因。
[0011]為了實現(xiàn)上述的第四個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記的試劑盒，該試劑盒包括盒體和6支PCR管，在2支PCR管中分別裝有2 X Taq PCR MasterMix和聚丙烯酰胺凝膠上樣緩沖液，在其他4支PCR管中分別裝辣椒雄性不育恢復(fù)基因的SSR分子標(biāo)記方法用引物，所述的為pep43標(biāo)記或pep20標(biāo)記:pep43標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示；P印20標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ IDNO -A所示。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
USSR分子標(biāo)記的開發(fā)可加速辣椒雄性不育的選育進程，提高育種效果，對辣椒CMS三系的分類和選育提供理論依據(jù)；
2、采用自主開發(fā)的SSR引物和實驗室常規(guī)的PCR技術(shù)，通過對辣椒植株的檢測，選出具有恢復(fù)基因的植株。該方法是對遺傳物質(zhì)的檢測，方便、重復(fù)性好，且周年均可進行；
3、本發(fā)明所提供的試劑盒，將檢測用引物和相關(guān)試劑綜合組裝在一盒內(nèi)，方便實施操作，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。
【附圖說明】
[0013]圖1辣椒雄性不育恢復(fù)系選育各親本、雜交世代單株苗期恢復(fù)基因檢測圖；
注:a為pep20引物擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，b為pep43引物擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；M為DL2000 Marker ;1為不育系親本134BC5A，2為134BC5Axl39D-21-3 F1 代單株，3 為恢復(fù)系親本 139D-21-3，4-24 為 134BC5A xl39D_21_3 F2 代單株。
[0014]圖2對不同辣椒雄性不育材料恢復(fù)基因的檢測圖；
注:c為pep20引物擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，d為pep43引物擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；M為DL2000 Marker ；1為不育系對照，2為恢復(fù)系對照，3、4、8和9為自選辣椒不育材料，5、6和7為自選辣椒恢復(fù)材料。
[0015]圖3用試劑盒檢測不同辣椒雄性不育材料恢復(fù)基因；
注:e為pep20引物擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，f為pep43引物擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；MSDL2000 Marker ; I為不育系對照，2為恢復(fù)系對照，3、5、8、9和11為自選辣椒恢復(fù)材料，4、6和7為自選辣椒不育材料，10為保持系N(Hisms) 08-131，12為地方辣椒材料08032。
【具體實施方式】
[0016]通過以下實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0017]實施例1、(辣椒雄性不育恢復(fù)基因沿共分離分子標(biāo)記的開發(fā))
本例所述辣椒材料:辣椒不育系131BC5A ;恢復(fù)系139D-21-3 ;131BC5A x 139D-21-3 F1代單株；131BC5A X 139D-21-3 F2分離群體;
親本材料與雜交方法:
①親本材料:
恢復(fù)系139D-21-3:2009年春季，從浙江省海寧市許村鎮(zhèn)楊渡村的農(nóng)家田頭發(fā)現(xiàn)