一種通過引入聚-β-羥基丁酸酯代謝途徑提高鈍齒棒桿菌L-精氨酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 通過聚-輕基丁酸酯（PHB)代謝途徑引入提高鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum)L-精氨酸產(chǎn)量，本發(fā)明屬于基因工程和生物工程領(lǐng)域。具體地說涉及一種PHB 操縱子在鈍齒棒桿菌中表達的基因工程菌株的構(gòu)建及其利用該菌株進行5-L發(fā)酵罐高產(chǎn) L-精氨酸的方法。 技術(shù)背景
[0002] L-精氨酸（L-arginine)是一種含有胍基的堿性氨基酸，在醫(yī)藥和食品工業(yè)有較 廣泛的用途，是人體代謝的一種重要氨基酸，具有獨特的生理和藥理作用，在制藥、保健品 及化妝品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價值，目前國內(nèi)外對其合成和生產(chǎn)都有著比較深入的研究。 近年來微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸受到越來越多的關(guān)注，各國科學(xué)家相繼開展這方面的 工作。
[0003] 聚羥基丁酸酯（PHB)是原核微生物在碳、氮營養(yǎng)失衡的情況下，作為碳源和 能源貯存而合成的一類熱塑性聚酯。PHB具有良好的生物降解性，可替代傳統(tǒng)的塑料制品 制成綠色包裝材料與容器，減少白色污染。再加之PHB的生物相容性以及缺乏免疫反應(yīng)， 使PHB成為一種理想的醫(yī)藥材料，可用作手術(shù)縫合線、補牙填料、外科的棉繃帶。將PHB代 謝途徑引入菌體，調(diào)節(jié)全細胞代謝網(wǎng)絡(luò)，影響C流和能量水平，從而促進相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn) 量，相關(guān)文獻已有報道。
[0004] 本實驗室保藏有一株鈍齒狀、無芽孢、革蘭式陽性的鈍齒棒桿菌C. crenatum SYPA，是本實驗室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株，相關(guān)文獻已經(jīng)報道。本發(fā)明所用載體質(zhì) 粒pDXW-10為江南大學(xué)王小元教授研究室惠贈，具有tac-M啟動子，在棒桿菌中可中等水平 表達外源基因，更利于代謝水平的進行。
[0005] 本發(fā)明通過表達載體pDXW-10,首次實現(xiàn)了在C. crenatum SYPA中PHB合成關(guān)鍵 酶酮基硫解酶（PhbA)、乙酰乙酰CoA還原酶（PhbB)和PHB合成酶（PhbC)的高效表達。 通過5-L發(fā)酵罐發(fā)酵實驗，實現(xiàn)同一批菌株胞外產(chǎn)L-精氨酸胞內(nèi)積累PHB的聯(lián)產(chǎn)效果，最 終實現(xiàn)高效生產(chǎn)L-精氨酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所使用的原始菌種為C.crenatumSYPA，該菌株以葡萄糖為碳源，在5-L發(fā) 酵罐發(fā)酵至96h，L-精氨酸產(chǎn)量可達35g/l左右。
[0007] 本發(fā)明的主要研究內(nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)將來源于RalstoniaeutrophaH16 的聚-0 -羥基丁酸（PHB)合成操縱子基因phbCAB從pBHR68質(zhì)粒上酶切下來，連接到到穿 梭表達載體PDXW-10,構(gòu)建成為重組表達質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB并轉(zhuǎn)化至文獻已報道的鈍齒 棒桿菌C.crenatumSYPA中，成功構(gòu)建了基因工程菌株C.crenatumSYPA/pDXW-10-phbCAB。 對構(gòu)建的基因工程菌株進行酶活力測定及胞內(nèi)PHB含量測定研究證明C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB中phbCAB得到了表達，實現(xiàn)了同一批菌株胞外產(chǎn)L-精氨酸胞內(nèi)積累PJB的聯(lián)產(chǎn)效果。最終在PH7. 0，溫度30°C，轉(zhuǎn)速600rpm的條件下，C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB以葡萄糖為碳源，5-L發(fā)酵罐發(fā)酵至96h，L-精氨酸產(chǎn)量可達43. 21g/l，提 高了L-精氨酸的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：
[0009] (1)本發(fā)明首次通過在鈍齒棒桿菌中表達PHB合成關(guān)鍵酶4 -酮基硫解酶、乙酰 乙酰CoA還原酶和PHB合成酶，實現(xiàn)胞內(nèi)積累PHB和胞外生產(chǎn)L-精氨酸，達到了L-精氨酸 和PHB聯(lián)產(chǎn)的效果，提高了底物利用效率。
[0010] (2)本發(fā)明采用5-L發(fā)酵罐分批發(fā)酵策略，優(yōu)化發(fā)酵條件，最終C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB發(fā)酵至96h，L-精氨酸產(chǎn)量達到43. 21g/l，PHB在胞內(nèi)的積累對L-精氨酸 產(chǎn)量具有促進效果。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1 :重組鈍齒棒桿菌的構(gòu)建
[0012] 質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB構(gòu)建示意圖如圖1所示，具體過程如下：
[0013] 文獻報道過的質(zhì)粒pBHR68含有來自于RalstoniaeutrophaH16的聚-P-輕基 丁酸（PHB)合成操縱子基因phbCAB，通過限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI處理pBHR68,得到 PHB合成操縱子基因phbCAB，與經(jīng)過Bglll和EcoRI處理的表達載體pDXW-10在T4DNA連 接酶的作用下16°C過夜連接，將連接液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)E.coliJM109中，挑取陽性 轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證并確認(rèn)重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB構(gòu)建成功。
[0014] 將重組質(zhì)粒pDXW-10-phbCAB以電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化至原始菌鈍齒棒桿菌C.crenatum SYPA中，于karf抗性平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)顯微鏡檢測和提取重組質(zhì)粒驗證，即得到重 組鈍齒棒桿菌C.crenatumSYPA/pDXW-10-phbCAB。
[0015] 實施例2 :重組菌株酶活力測定
[0016] (1)酶活測定緩沖體系
[0017] @ -酮基硫解酶：0? 106M Tris-HCl (pH7. 3)，0? 67mM DIT，0. 806mM乙酰CoA， 1. 88Mm P -NADH，2. 5U P-羥酰CoA脫氫酶；
[0018] 乙酰乙酰CoA還原酶：25mMTris-HCl (pH7.5)，0?25mMMgCl2*6H20,12. 5mMDTT， 6.OmMNADPH，1. 25mM乙酰乙酰CoA ;
[0019]PHB合成酶：50iiM3HB-CoA，25mMTris-HCl (pH7.5)，ImMDTNB;
[0020] (2)酶活測定
[0021] 將實施例1構(gòu)建的重組菌C.crenatumSYPA/pDXW-10-phbCAB與出發(fā)菌株 C.crenatumSYPA分別接種于10mL含卡那霉素的LBG培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24h，按4% 的接種量轉(zhuǎn)接于LBG培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液于4°C，10000r/min離心10min， pH7. 0的磷酸鈉緩沖液清洗3次，懸浮在pH7. 0的磷酸鈉緩沖液中，超聲波破碎處理制備粗 酶液。將30yl粗酶液加入到酶活力測定緩沖體系中立即檢測相應(yīng)波長下吸光值的變化。 經(jīng)計算比較比酶活，結(jié)果表明，相比于出發(fā)菌C.crenatumSYPA，重組菌C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB中0 -酮基硫解酶的比酶活提高了 26倍，乙酰乙酰CoA還原酶和PHB合成 酶分別提高了 30和13倍。
[0022]實施例3:重組菌株C. crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB發(fā)酵罐實驗 [0023] (1)種子培養(yǎng)
[0024] 從活化平板上挑取單菌落接種于10mL含卡那霉素的LBG培養(yǎng)基中，30°C振蕩培 養(yǎng)24h，然后全部轉(zhuǎn)接于150ml種子培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h，種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖50g/ L，硫酸銨20g/L，酵母提取物12g/l，七水合硫酸鎂0. 5g/l，磷酸二氫鉀1. 5g/l，去離子水配 置，pH7.0。
[0025] (2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0026] 初始發(fā)酵培養(yǎng)體積為2. 5L，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下：
[0027] 發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖200g/l，硫酸銨20g/l，酵母提取物12g/l，七水合硫酸鎂 〇? 5g/l，氯化鉀lg/1，磷酸二氫鉀1. 5g/l，七水合硫酸亞鐵0? 02g/l，一水合硫酸猛0? 02g/ 1，去離子水配置，pH7.0。將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用50%的氨水調(diào)節(jié)其pH至7.0,在121°C下 高溫滅菌30min。
[0028] 發(fā)酵條件：將上述培養(yǎng)好的種子液按6%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培 養(yǎng)，發(fā)酵溫度為30°C，pH為7. 0,攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min。培養(yǎng)96h。
[0029] 實施例4 :發(fā)酵產(chǎn)物及相關(guān)參數(shù)測定
[0030] 發(fā)酵過程中，溫度與攪拌轉(zhuǎn)速由發(fā)酵罐自動控制，pH通過補加50%氨水維持穩(wěn) 定。從第24h起，每12h取樣一次，采用分光光度儀在A562下測定細胞0D值，葡萄糖用生物 傳感分析儀測定（SBA-50,山東省科學(xué)院生物研究所）。
[0031] L-精氨酸和其他各種氨基酸采用HPLC測定（安捷倫1100,美國）。PHB含量用氣 相色譜測定（GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司）。色譜條件如下：毛細管柱， 30mX0. 32mm色譜柱中固定液為AT.SE-30,，檢測器為FID，柱溫160°C，汽化室與檢測器的 溫度均為250°C，載氣為N2，流速0.IMpa，進樣量2iiL，采用外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，相比于 出發(fā)菌，重組菌生長的更好，糖耗更快，胞內(nèi)PHB積累量提高了 3倍左右，發(fā)酵至96h，重組菌 的L-精氨酸產(chǎn)量達到43.21g/l，較出發(fā)菌株C.crenatumSYPA提高了 17. 8%，實現(xiàn)了胞內(nèi) 積累PHB胞外產(chǎn)生L-精氨酸的效果。
【主權(quán)項】
1. 一種高產(chǎn)L-精氨酸的重組鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum)，其特征在于： 將SEQ ID N0:1所示的Ralstonia eutropha H16的聚-0-輕基丁酸（PHB)合成操縱子 基因phbCAB從pBHR68上酶切下來，連接到穿梭表達載體pDXW-10,構(gòu)建成為重組表達質(zhì)粒 pDXW-10-phbCAB并轉(zhuǎn)化至鈍齒棒桿菌C. crenatum SYPA中，經(jīng)發(fā)酵罐實驗驗證，重組鈍齒 棒桿菌提高了生產(chǎn)L-精氨酸的能力。
2.利用權(quán)利要求1構(gòu)建的重組鈍齒棒桿菌C. crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB，優(yōu)化 其5-L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的條件，其發(fā)酵條件為：pH為7. 0,溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為 600rpm ;培養(yǎng)基配方為：葡萄糖200g/l，硫酸銨20g/l，酵母提取物12g/l，七水合硫酸鎂 〇? 5g/l，氯化鉀lg/1，磷酸二氫鉀1. 5g/l，七水合硫酸亞鐵0? 02g/l，一水合硫酸猛0? 02g/ 1〇
3. 利用權(quán)利要求1構(gòu)建的重組枯鈍齒棒桿菌C. crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB， 在權(quán)利要求2發(fā)酵條件下進行發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，其特征是：菌株C. crenatum SYPA/ pDXW-10-phbCAB接種于含卡那霉素10mL LBG培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)24h后，全部轉(zhuǎn)接于 總體積為150ml的種子培養(yǎng)基中（該種子培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖50g/L，硫酸銨20g/L，酵 母提取物12g/l，七水合硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀1.5g/l，去離子水配置，pH 7.0)，30°C 振蕩培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接于5-L反應(yīng)器中，培養(yǎng)至96h，L-精氨酸的產(chǎn)量達到43. 21g/L，相比 于對照菌株 C. crenatum SYPA(36. 68g/l)，產(chǎn)量提高了 17.8%。
【專利摘要】通過引入PHB代謝途徑到Corynebacterium crenatum SYPA中，從而高產(chǎn)L-精氨酸，屬于基因工程和生物工程領(lǐng)域。該發(fā)明酶切質(zhì)粒pBHR68獲得合成PHB的操縱子，與棒桿菌表達載體pDXW-10連接，并將其在C.crenatum SYPA中表達，為國內(nèi)外首次通過引入PHB代謝途徑在野生型鈍齒棒桿菌中高產(chǎn)L-精氨酸。對構(gòu)建的基因工程菌株進行酶活力測定及胞內(nèi)輔酶水平研究證明C.crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB合成L-精氨酸的能力得到加強。最終在30℃，pH 7.0及600rpm條件下，C.crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB在5-L發(fā)酵罐發(fā)酵96h可產(chǎn)得43.21 g/L的L-精氨酸，為國內(nèi)外首次通過引入PHB代謝途徑到菌體內(nèi)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)，最終實現(xiàn)高產(chǎn)L-精氨酸的目的，為微生物工業(yè)化生產(chǎn)L-精氨酸提供了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12R1-15, C12N1-21, C12N15-66, C12N15-77, C12P13-10
【公開號】CN104531747
【申請?zhí)枴緾N201410748914
【發(fā)明人】饒志明, 秦敬儒, 徐美娟, 張顯, 楊套偉
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月9日