專利名稱:吸附法固定化細(xì)胞直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇的方法
本發(fā)明屬于發(fā)酵或生物合成法生產(chǎn)丙酮丁醇的方法，更具體地說(shuō)本發(fā)明關(guān)系到利用吸附形式的固定化細(xì)胞直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇的方法及其反應(yīng)器。
傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇是由淀粉質(zhì)原料直接入一種丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌，在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。一般，淀粉質(zhì)原料有玉米或薯干等，其經(jīng)過(guò)粉碎、配醪、蒸煮和冷卻等處理而獲得的，發(fā)酵在一定溫度和時(shí)間下完成，然后經(jīng)蒸餾得到丙酮丁醇。
這種生產(chǎn)丙酮丁醇的方法主要缺陷是菌體不能充分利用，其次，在發(fā)酵的過(guò)程中，菌體的活細(xì)胞受到代謝產(chǎn)物丁醇的毒害，所以發(fā)酵液的濃度不能太高，因此發(fā)酵需用龐大的設(shè)備，以致傳統(tǒng)方法生產(chǎn)丙酮丁醇效率低，成本高。
為了改進(jìn)上述狀況，從80年代初起已有許多國(guó)家的科研人員正在從事固定細(xì)胞生產(chǎn)丙酮丁醇的研究和使用。該些研究的方向是將微生物細(xì)胞固定在一種載體上，作為一種生物催化劑，可放置在生物反應(yīng)器中不斷地將原料基質(zhì)轉(zhuǎn)化為丙酮丁醇溶液。從所揭示的材料可以看出，其總的固定化形式為包埋法。用作包埋法的載體材料是海藻酸納等物質(zhì)，通過(guò)海藻酸納溶液和丙酮丁醇梭狀芽狀孢桿菌均勻混合，成粒，硬化等步驟，制備成包埋有細(xì)胞的凝膠顆粒。
使用固定化細(xì)胞生產(chǎn)丙酮丁醇的優(yōu)點(diǎn)是基質(zhì)與細(xì)胞容易分離，固定化細(xì)胞可以反復(fù)使用，從而省去頻繁的接種工藝;可以在反應(yīng)器內(nèi)高稀釋速率下連續(xù)進(jìn)行;固定化形式中，細(xì)胞密度增加能提高反應(yīng)速率，而不致于“沖出”;增加反應(yīng)器的生產(chǎn)效率;減少細(xì)胞增殖所需的原料消耗，相對(duì)增加原料對(duì)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率，省去龐大發(fā)酵罐，使投資小，便于自動(dòng)化。
但是，包埋法生產(chǎn)丙酮丁醇中因其胞內(nèi)酶不能與大分子淀粉原料作用，故限止了以淀粉質(zhì)糧食為原料的溶劑生產(chǎn)上應(yīng)用。其只能應(yīng)用基質(zhì)是葡萄糖或其它水解糖原料，造成成本提高，原料供應(yīng)困難。此外，包埋的固定化細(xì)胞制備麻煩，強(qiáng)度低，半衰期短。這種方法在實(shí)驗(yàn)室中試驗(yàn)的最好結(jié)果是69g/l反應(yīng)器·天。盡管那樣，但由于缺少生物反應(yīng)器的動(dòng)力學(xué)研究，不能在工程方面得到實(shí)際應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于對(duì)包埋法固定化細(xì)胞生產(chǎn)丙酮丁醇的不足之處加以改進(jìn)，從而提出一種能在生產(chǎn)實(shí)踐中可應(yīng)用的，強(qiáng)度高、半衰期長(zhǎng)，效率高的瓷環(huán)吸附法固定化細(xì)胞。這種固定化細(xì)胞還可直接發(fā)醇淀酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁酵使生產(chǎn)成本降低，以及提供能達(dá)到連續(xù)生產(chǎn)丙酮丁醇的反應(yīng)器。
吸附法固定化細(xì)胞生產(chǎn)丙酮丁醇所用的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌為clostridium acetobutylicum。這種菌為工廠生產(chǎn)用菌種，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基等培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可供吸附法固定化細(xì)胞應(yīng)用。一般，培養(yǎng)是把丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌接種于容有5%的玉米醪培養(yǎng)基的試管中，沸水中處理一分鐘，于干燥器內(nèi)抽真空600～760mm Hg、38℃保溫箱培養(yǎng)24～28小時(shí)，擴(kuò)至250ml三角瓶繼續(xù)培養(yǎng)14小時(shí)左右而得到的。
作為吸附法固定化細(xì)胞的載體主要是瓷環(huán)，其可選用φ3-φ10mm的多孔陶瓷環(huán)。在使用前，把這種瓷環(huán)先進(jìn)行酸堿處理，自來(lái)水沖洗，蒸氣消毒，供備用。
圖1表示用去吸附法固定化細(xì)胞生產(chǎn)丙酮丁醇的反應(yīng)器示意圖。
吸附法固定化細(xì)胞的細(xì)胞固定通過(guò)把經(jīng)上述處理的瓷環(huán)放入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液中浸泡讓靜止吸附以使該菌液中的梭狀芽孢桿菌的一部份進(jìn)入瓷環(huán)的孔隙中，四小時(shí)后濾去發(fā)酵液，然后將吸附瓷環(huán)浸入0～2%海藻酸鈉的PH7.0 0.1M的磷酸緩沖液中，0.5～1小時(shí)后濾出，再浸于無(wú)菌的氯化鈣溶液中，在冰箱過(guò)夜后用0.5%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)處理使孔隙內(nèi)的細(xì)菌得到相對(duì)固定。這種吸附固定的細(xì)胞，可以象游離細(xì)胞一樣可直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料如玉米或薯干等。
用上述方法制得到吸附法固定化細(xì)胞分別與包埋法和游離細(xì)胞法分批發(fā)酵玉米醪試驗(yàn)比較;在試驗(yàn)中，包埋法采用海藻酸鈣包埋凝膠，吸附法固定化細(xì)是用φ6×6×1.5瓷環(huán)吸附。試驗(yàn)是在5%濃度的三角瓶玉米醪中，溫度39+2℃保溫培養(yǎng)，其結(jié)果如表1所示
由表1可看出，采用吸附法固定化細(xì)胞可以達(dá)到傳統(tǒng)方法游離細(xì)胞相仿的結(jié)果，而一般文獻(xiàn)采用的海藻酸鈣包埋凝膠則發(fā)酵不徹底。其原因是由于玉米醪顆粒及淀粉大分子不易與被包埋的細(xì)胞接觸。
為了觀察吸附法固定化細(xì)胞的連續(xù)使用性能、使用壽命，進(jìn)行了反復(fù)分批式發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)按下列方式;將固定化細(xì)胞接種于5%濃度的玉米醪，保溫發(fā)酵65-72小時(shí)，濾出發(fā)酵液，以無(wú)菌水洗滌，再?zèng)_洗，共洗4～6次，濾出水份，將濾干瓷環(huán)接入新鮮玉米醪繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。每次發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定總?cè)軇?，殘余還原糖，共進(jìn)行十次(32天)。結(jié)果如表2所示表2
由表2可見，固定化細(xì)胞反復(fù)使用十次以后仍具有正常發(fā)酵性能，其發(fā)酵結(jié)果與游離細(xì)胞相仿。也完全適合于裝入反應(yīng)器中實(shí)行連續(xù)生產(chǎn)。
吸附法固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)溶劑的反應(yīng)器見圖1。反應(yīng)器包括一個(gè)培養(yǎng)基槽[1]二個(gè)反應(yīng)器[2]、[2′]，在反應(yīng)器[2]和[2′]中放置經(jīng)吸附的固定化細(xì)胞瓷環(huán)[5]，在培養(yǎng)基槽[1]內(nèi)容有5%-8%玉米醪[4]，一個(gè)進(jìn)料泵[6]，其通過(guò)連接管分別與槽[1]和反應(yīng)器[2]的底部連通，一個(gè)設(shè)在進(jìn)料泵[6]和反應(yīng)器[2]之間的閥門[12]提供輸送料控制，一個(gè)回流泵[7]，它通過(guò)管子接通反應(yīng)器[2]的上部與反應(yīng)器[2′]的下部，一個(gè)裝在其管子上的閥[13]提供回流控制，反應(yīng)器[2]的上部和反應(yīng)器[2′]的底部用管子連接，一個(gè)裝在管子上的閥[14]提供流量控制，在反應(yīng)器[2]和[2′]的頂部設(shè)有與可供進(jìn)水或進(jìn)液控制的管子和閥門[8]，槽[1]和反應(yīng)器[2][2′]的底部還都設(shè)有一個(gè)供換料或沖洗的臨時(shí)出口閥門[9]、[10]、[11]。連續(xù)生產(chǎn)時(shí)，作用進(jìn)料的培養(yǎng)基從槽[1]的頂部加入，由進(jìn)料泵[6]控速進(jìn)入反應(yīng)器[2]，在反應(yīng)器[2]內(nèi)培養(yǎng)基將通過(guò)經(jīng)吸附的瓷環(huán)[5]發(fā)酵，發(fā)酵可靜止或流動(dòng)，在流動(dòng)時(shí)通過(guò)回流泵[7]從反應(yīng)器[2]內(nèi)的瓷環(huán)以上出口輸回底部，不斷循環(huán)，然后再送到反應(yīng)器[2′]，通過(guò)其內(nèi)經(jīng)吸附的瓷環(huán)[5]從上部出料口排出已發(fā)酵的丙酮丁醇溶劑等。
在一般室內(nèi)進(jìn)行丙酮丁醇的吸附法生產(chǎn)中，如果受到雜菌污染對(duì)污染的處理以及處理后發(fā)酵情況的試驗(yàn)。通常吸附法固定化細(xì)胞直接發(fā)酵丙酮丁醇均在超凈臺(tái)或無(wú)菌條件下進(jìn)行操作，可避免污染?，F(xiàn)在把第二批移到一般空內(nèi)進(jìn)行操作，固定化細(xì)胞洗滌和接種時(shí)缺乏無(wú)菌條件，造成該批發(fā)酵污染乳酸菌，其中樣品號(hào)2特別嚴(yán)重，發(fā)酵液和載體均有雜菌污染。但是用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚?，即轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵。雜菌污染及處理后的發(fā)酵結(jié)果見表3。
表3
表3結(jié)果表明固定化細(xì)胞發(fā)酵染菌后得率降低，會(huì)造成酸敗。但經(jīng)過(guò)處理后，發(fā)酵仍可正常進(jìn)行，恢右原有水平。
固定化細(xì)胞反復(fù)分批發(fā)酵過(guò)程的觀察與分析根據(jù)發(fā)酵三角瓶外觀與鏡檢情況如下1.三角瓶接種后6-12小時(shí)不斷有氣泡從載體處冒出。12-24小時(shí)開始形成醪蓋。24-36小時(shí)時(shí)醪蓋密實(shí)下層變清。發(fā)酵結(jié)束時(shí)(65-72小時(shí))醪蓋下沉，但載體外仍有氣泡產(chǎn)生。
2.固定化細(xì)胞制備后第一批發(fā)酵起發(fā)稍晚，30小時(shí)后方形成醪蓋。第二批分別從衰老期，如尸體、有孢子、醪蓋下沉與旺盛期，如菌體排列整齊、粗壯、有醪蓋的固定化細(xì)胞接種，發(fā)酵旺盛菌種接種比衰老菌種形成醪蓋時(shí)間提前12小時(shí)，即分別為16和28小時(shí)。
如上所述吸附法固定化細(xì)胞直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇采用了瓷環(huán)作為載體固定化細(xì)胞活性高，發(fā)酵效果好，壽命長(zhǎng);性能可靠還可再生。這種固定化細(xì)仍可利用傳統(tǒng)的玉米，薯干等淀粉質(zhì)原料發(fā)酵，并可放置在反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵大大減少生產(chǎn)投資和生產(chǎn)裝備，所以本發(fā)明法工藝簡(jiǎn)單合理、生產(chǎn)成本低并適宜于生產(chǎn)中應(yīng)用。
實(shí)施例1反復(fù)分批發(fā)酵生產(chǎn)溶劑。將φ3×7×0.8瓷環(huán)用5%NaOH溶液煮沸30分鐘，自來(lái)水沖洗干凈，再用1N HCl浸泡30分鐘，再用自來(lái)水沖洗至中性，裝入500ml三角瓶，121℃蒸汽消毒1小時(shí)，冷后備用。
菌種培養(yǎng)是用液體孢子試管1支，無(wú)菌條件下接10%比例接種于5%玉米醪試管中，沸水中熱處理1分鐘，置于真空干燥器中，抽真空為640mm Hg，38℃保溫培養(yǎng)。28小時(shí)后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，擴(kuò)大至250ml三角瓶，5%濃度的玉米醪中，繼續(xù)38℃保溫培養(yǎng)14-20小時(shí)，達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于制備固定化細(xì)胞。
吸附法固定化細(xì)胞是將已處理過(guò)的瓷環(huán)按1∶1的比例浸泡在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)菌液中，靜止吸附0.5-4小時(shí)，瀝干。浸入原已配制好的2%海藻酸鈉的PH、0.1M磷酸緩沖液的無(wú)菌溶液中，約30分鐘，瀝干。倒入2%氯化鈣溶液中浸泡。濾出，置于生理鹽水中保存。
發(fā)酵生產(chǎn)用250ml三角瓶，裝150ml5%玉米醪，接種上述方法制備的固定化細(xì)胞5-30%，38-40℃保溫培養(yǎng)65-72小時(shí)。發(fā)酵成熟醪濾出，分析總?cè)軇┝?，殘余淀粉和醪液酸度。固定化?xì)胞濾出后用無(wú)菌水沖洗4-6次(證明已無(wú)游離細(xì)胞)，將濾干的固定化細(xì)胞重新接入5%新鮮玉米醪，再次進(jìn)行發(fā)酵。每次都進(jìn)行分析測(cè)定，反復(fù)進(jìn)行十次以上，結(jié)果穩(wěn)定為含總?cè)軇┝?0.57-13.38g/l，殘淀粉0.22～0.48，酸度1.5-1.9。與傳統(tǒng)生產(chǎn)方法，即游離細(xì)胞法對(duì)照，結(jié)果相仿。
實(shí)施例2直接在圖1的反應(yīng)器中制備固定化細(xì)胞，連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)溶劑。用φ6×6×1.5瓷環(huán)按實(shí)施例1方法處理，在反應(yīng)器(培養(yǎng)瓶，500ml)中按1∶1比例接入實(shí)例1方法培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，浸泡吸附后濾去菌液，再按實(shí)例1方法用保護(hù)劑處理后濾去殘液，通入5%-8%的玉米醪進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵的第一步為靜止培養(yǎng)，達(dá)到生成溶劑階段后以0.2～0.6h-1的稀釋速率進(jìn)行連續(xù)，根據(jù)排出液的溶劑含量和殘余淀粉調(diào)節(jié)回流比。連續(xù)生產(chǎn)的生產(chǎn)率達(dá)60-100g/l天。
權(quán)利要求
1.一種固定化細(xì)細(xì)胞生產(chǎn)丙酮丁醇的方法，包括用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌作為菌體，其特征在于該菌種經(jīng)5%玉米醪培養(yǎng)基中培養(yǎng)和篩選得到對(duì)數(shù)生產(chǎn)期的丙酮丁醇菌液，制備吸附法固定化細(xì)胞然后采用吸附法固定化細(xì)胞直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其特征在于所說(shuō)的吸附法固定化細(xì)胞中的載體主要是瓷環(huán)，經(jīng)酸堿、水洗、消毒后侵入所說(shuō)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，再浸入0～2%海藻酸鈉PH7.0，0.1M的磷酸緩沖液中，還浸入2%無(wú)菌氯化鈉溶液中，最后用0.5%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，冰箱硬化。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其特征在于所說(shuō)的瓷環(huán)是多孔陶瓷，直徑在φ3～10mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2或3所述的法，其特征在于所說(shuō)的淀粉質(zhì)原料是玉米、薯干等糧食淀粉，其中玉米淀粉發(fā)酵液濃度為5～8%玉米醪。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其特征在于所說(shuō)的反復(fù)分批發(fā)酵的時(shí)間為48～72小時(shí)，而采用反應(yīng)器連續(xù)發(fā)酵，其第一步為靜止培養(yǎng)，達(dá)到生成溶液階段后以0.2～0.6h的稀釋速率進(jìn)行連續(xù)，生產(chǎn)率達(dá)到60～100g/L·天。
專利摘要
一種利用吸附形式的固定化細(xì)胞直接和(或)連續(xù)發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)丙酮丁醇的方法。其過(guò)程是用丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌在5％玉米醪中培養(yǎng)和篩選得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，其由瓷環(huán)吸附制成固定化細(xì)胞，即可直接發(fā)醇玉米淀粉料生產(chǎn)丙酮丁醇。本發(fā)明的固定化細(xì)胞活性高、半衰期長(zhǎng)，性能可靠，還可再生，尤其可在反應(yīng)器中連續(xù)生產(chǎn)，大大減少生產(chǎn)投資和生產(chǎn)裝備，故本法工藝簡(jiǎn)單合理，生產(chǎn)成本低，效率高，并易于在工業(yè)上推廣和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P7/24GK87103534SQ87103534
公開日1988年11月30日 申請(qǐng)日期1987年5月13日
發(fā)明者孫志浩 申請(qǐng)人:江蘇省微生物研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan