專利名稱:分枝桿菌菌種鑒定基因芯片檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)探針的基因芯片；本發(fā)明還涉及用于樣本中分枝桿菌菌種鑒定的檢測試劑。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(tuberculosis)俗稱″癆病″，是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)引起的傳染性疾病，是全世界由單一致病菌引致死亡最多的疾病，也是危害人類健康的主要傳染病之一。目前全世界有結(jié)核病人約2000萬，每年新增結(jié)核病人800-1000萬，每年死亡人數(shù)約300萬。我國的結(jié)核病情況相當(dāng)嚴(yán)重，是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二，僅次于印度。2000年第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查初步結(jié)果表明，我國有5.5億人感染了結(jié)核病；現(xiàn)有肺結(jié)核病人451萬，其中傳染性肺結(jié)核病人196萬；每年死亡人數(shù)約13萬，結(jié)核病死亡在我國各種死亡原因中居第9位，在傳染病中居第一位。
分枝桿菌屬(Mycobacterium)是一類細(xì)長略帶彎曲的桿菌，有分枝生長的趨勢，因而得名。本菌屬種類頗多，可分為三組結(jié)核桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌。在中國分離出的分枝桿菌中，結(jié)核分枝桿菌占86.4％，牛分枝桿菌占2.5％，非結(jié)核分枝桿菌占11.1％，非結(jié)核分枝桿菌的比率較前明顯增加。
非結(jié)核分枝桿菌病人對大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物具有天然抗藥性，采用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案治療無效。目前，非結(jié)核分枝桿菌病通常依據(jù)傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定來確診，然而，傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定煩瑣、費(fèi)時、需1-2月時間，不能滿足臨床開展早期有效化療的需要，使非結(jié)核分枝桿菌病人通常被作為結(jié)核病按常規(guī)治療，病人需要經(jīng)長期的規(guī)范化療而療效不佳，療程延長，成為難治、復(fù)治病人，細(xì)菌在局部播散。因此，分枝桿菌菌種的快速鑒定對結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病的早期診斷、鑒別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。
公開號為CN1353753A的專利申請，公開了數(shù)種非結(jié)核分枝桿菌菌種檢測和鑒定的寡聚核苷酸，但是對某些菌種不具有特異性，如不能區(qū)分鑒定出鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌。公開號為CN16535158A的專利申請，公開了分枝桿菌分子菌種鑒定試劑盒的制備方法和應(yīng)用，也在對某些菌種的鑒定上也不能鑒定到種，如不能區(qū)分鑒定出堪薩斯、瘰疬、胃、猿分枝桿菌。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒定分枝桿菌到種的水平的基因芯片；本發(fā)明的另一目的在于提供一種可快速地鑒定樣本中分枝桿菌到種的水平的檢測試劑。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的基因芯片包括基底和固定于該基底上的探針，所述基底可以是例如玻片、各種纖維膜、尼龍膜等各種類型，優(yōu)選為尼龍膜，所述固定于基底上的探針為可與分枝桿菌不同菌種的16SrRNA和23SrRNA之間的插入序列(ITS)基因的核酸雜交的特異型探針。優(yōu)選的探針序列為針對不同分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因而設(shè)計的，可與含有這些間隔序列的不同分枝桿菌核酸雜交。
本發(fā)明根據(jù)不同分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)基因設(shè)計了下面一系列探針GEN5’-CTTGGTGGTGGGGTGTGGACTTT-3’(SEQ ID NO.1)5’-AAAGTCCACACCCCACCACCAAG-3’(SEQ ID NO.2)5’-TGGATAGTGGTTGCGAGCATC-3’(SEQ ID NO.3)5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’(SEQ ID NO.4)MTC5’-CGGGTGCATGACAACAAAGTTG-3’(SEQ ID NO.5)5’-CAACTTTGTTGTCATGCACCCG-3’(SEQ ID NO.6)5’-CCCCAACTGGTGGGGCGTAGG-3’(SEQ ID NO.7)5’-CCTACGCCCCACCAGTTGGGG-3’(SEQ ID NO.8)MIN5’-ACGAAAAGCACTCCAATTGGTG-3’(SEQ ID NO.9)5’-CACCAATTGGAGTGCTTTTCGT-3’(SEQ ID NO.10)5’-TTCCCGTCTGTAGTGGACGGG-3’(SEQ ID NO.11)5’-CCCGTCCACTACAGACGGGAA-3’(SEQ ID NO.12)5’-CTCGGTCGATCCGTGTGGAGT-3’(SEQ ID NO.13)5’-ACTCCACACGGATCGACCGAG-3’(SEQ ID NO.14)MAV5’-ACGAAAAGCACTCCAATTGGT-3’(SEQ ID NO.15)5’-ACCAATTGGAGTGCTTTTCGT-3’(SEQ ID NO.16)5’-TTCTCGTCTGTAGTGGACGAAA-3’(SEQ ID NO.17)5’-TTTCGTCCACTACAGACGAGAA-3’(SEQ ID NO.18)MSC5’-ACGAAAAGCACCCCAACTGGT-3’(SEQ ID NO.19)5’-ACCAGTTGGGGTGCTTTTCGT-3’(SEQ ID NO.20)5’-TTCTCGCCTGTAGTGGGCGGGAG-3’(SEQ ID NO.21)5’-CTCCCGCCCACTACAGGCGAGAA-3’(SEQ ID NO.22)
5’-TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGT-3’(SEQ ID NO.23)5’-ACACCACTCAGAACGAGCCGA-3’(SEQ ID NO.24)MKA5’-AAGCATCCCAACAAGTGGGGT-3’(SEQ ID NO.25)5’-ACCCCACTTGTTGGGATGCTT-3’(SEQ ID NO.26)5’-CACGACAACAAGCAAAGCCA-3’(SEQ ID NO.27)5’-TGGCTTTGCTTGTTGTCGTG-3’(SEQ ID NO.28)MAB5’-AGTAGGTATCTGTAGTGGATATC-3’(SEQ ID NO.29)5’-GATATCCACTACAGATACCTACT-3’(SEQ ID NO.30)5’-TCGGACTGTCATAAGAATTGAA-3’(SEQ ID NO.31)5’-TTCAATTCTTATGACAGTCCGA-3’(SEQ ID NO.32)MCH5’-AGCCGAATGAGCTTGGGAACA-3’(SEQ ID NO.33)5’-TGTTCCCAAGCTCATTCGGCT-3’(SEQ ID NO.34)5’-AGTTTCTGTAGTGGTTACTCGC-3’(SEQ ID NO.35)5’-GCGAGTAACCACTACAGAAACT-3’(SEQ ID NO.36)MMA5’-CCGGGTGCACAACAACAAGC-3’(SEQ ID NO.37)5’-GCTTGTTGTTGTGCACCCGG-3’(SEQ ID NO.38)5’-TTGGATGCGCTGCCTTTTGGT-3’(SEQ ID NO.39)5’-ACCAAAAGGCAGCGCATCCAA-3’(SEQ ID NO.40)MXE5’-GTGGGTTCGGCGTGTTGTGGC-3’(SEQ ID NO.41)5’-GCCACAACACGCCGAACCCAC-3’(SEQ ID NO.42)5’-GGTGTTGGGCAGCAGGCAGTAA-3’(SEQ ID NO.43)5’-TTACTGCCTGCTGCCCAACACC-3’(SEQ ID NO.44)5’-CCCGTGGTGGTGTTGTGCTCCG-3’(SEQ ID NO.45)5’-CGGAGCACAACACCACCACGGG-3’(SEQ ID NO.46)MFO5’-TGGCATCCGGTTGCGGGTGTC-3’(SEQ ID NO.47)5’-GACACCCGCAACCGGATGCCA-3’(SEQ ID NO.48)5’-CTTTTGGGGGGTGGCATCC-3’(SEQ ID NO.49)5’-GGATGCCACCCCCCAAAAG-3’(SEQ ID NO.50)
在上述序列中，針對每一種分枝桿菌設(shè)計了正、反兩條序列，在使用時可選擇任一個(正或反)序列作為檢測探針固定于尼龍膜上。
在上述設(shè)計的各種分枝桿菌序列的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行探針合成，并對其5’端或3’端進(jìn)行氨基標(biāo)記。優(yōu)選對探針進(jìn)行3’端氨基標(biāo)記，其相較5’端氨基標(biāo)記的探針，具有更好的雜交效果。
在本發(fā)明的一個實施方案中，制備芯片的方法為將尼龍膜經(jīng)EDAC(N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)預(yù)處理30分鐘后，激活表面負(fù)電荷基團(tuán)；同時，將在3’端帶有氨基標(biāo)記的探針用緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群螅搓嚵许樞螯c(diǎn)加于尼龍膜相應(yīng)位置上，此時，氨基與活化的負(fù)電荷基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價鍵，從而將探針固定在尼龍膜表面，最后，用0.1～0.5mol/L的NaOH處理尼龍膜，封閉未結(jié)合探針的表面負(fù)電荷基團(tuán)，膜芯片制作完成。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于樣本中分枝桿菌菌種鑒定的檢測試劑至少包括用于擴(kuò)增樣本中分枝桿菌的16SrRNA和23SrRNA之間的間隔序列(ITS)的PCR引物以及上述本發(fā)明的基因芯片。本發(fā)明的PCR引物根據(jù)分枝桿菌基因組的特點(diǎn)設(shè)計，通過PCR反應(yīng)可擴(kuò)增一種或幾種突變基因。在本發(fā)明中，設(shè)計了如下引物序列M1-F5’-GGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGAT-3’(SEQ ID NO.51)M1-R5’-GGCATCCACCATGCGCCCTTAGA-3’(SEQ ID NO.52)M2-F5’-CGATCCCACCTTCGACAGCTCC-3’(SEQ ID NO.53)M2-R5’-TGTCTAAGGGCGCATGGTGGA-3’(SEQ ID NO.54)在使用時，可以選擇上述給出序列作為合成的引物序列。上述本發(fā)明的引物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行合成，可以使用混合引物。同時為便于結(jié)果檢測，可以在上述引物合成時進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，在本發(fā)明的一個實施方案中，對引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，使得合成的PCR產(chǎn)物的5’端帶有生物素標(biāo)記，以在后續(xù)的顯色反應(yīng)方便讀取結(jié)果。
本發(fā)明的探針和引物可以針對一種分枝桿菌進(jìn)行檢測，也可以組合使用鑒定多種分枝桿菌。例如，以SEQ ID NO.1～4所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對分枝桿菌屬診斷試劑；以SEQ ID NO.5～8所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對結(jié)核分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.9～14所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對胞內(nèi)分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.15～18所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對鳥分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.19～24所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對瘰疬分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.25～28所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對堪薩斯分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.29～32所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對膿腫分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.33～36所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對龜分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.37～40所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對海分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.41～46所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對蟾蜍分枝桿菌的診斷試劑；以SEQ ID NO.47～50所示的序列作為探針序列制備基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于針對偶發(fā)分枝桿菌的診斷試劑；較為優(yōu)選的實施方案為，以GEN、MTC、MIN、MAV、MSC、MKA、MAB、MCH、MMA、MXE、MFO所示的序列中各任選一條作為探針序列制備基因芯片，以SEQ IDNO.51～54所示的序列作為擴(kuò)增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用于鑒定十種分枝桿菌。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于樣本中分枝桿菌菌種鑒定的試劑盒，其至少包括本發(fā)明的上述檢測試劑，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包含下述試劑中的一種或幾種樣本處理試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑和顯色試劑。
上述樣本處理試劑、PCR擴(kuò)增試劑、雜交試劑以及顯色試劑均可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種試劑，這些試劑必要時可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的指示自行配制。
本發(fā)明的試劑盒中還可以包括相應(yīng)的陰性對照和/或陽性對照樣本。
在本發(fā)明試劑盒的操作方法中，將標(biāo)記后的待測產(chǎn)物與固定在芯片上的探針進(jìn)行雜交，其雜交原理與普通核酸雜交相同。雜交溫度與探針和標(biāo)記后的待測樣品的長度、GC含量、鹽濃度、甲酰胺等有關(guān)。優(yōu)選的是在本發(fā)明的試劑盒體系中57℃孵育2-4小時后可獲得滿意的雜交結(jié)果。
在本發(fā)明試劑盒的操作中，利用不同的洗脫條件，如溫度、鹽濃度等最大限度的去除非特異性雜交。標(biāo)記有過氧化物酶(POD)的鏈霉親和素(鏈霉抗生物素蛋白)與PCR產(chǎn)物5’端帶有的生物素特異結(jié)合，并與過氧化氫和棕色底物TMB(四甲基聯(lián)苯胺)的存在下發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng)，膜條相應(yīng)探針位置顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。經(jīng)閱讀儀閱讀后對信號與背景進(jìn)行計算機(jī)分析，有相應(yīng)的軟件系統(tǒng)分析獲得最終的雜交結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供一種鑒定分枝桿菌菌種的方法。將來自待檢測個體的樣本使用本發(fā)明的檢測試劑檢測，通過樣本中分枝桿菌各相關(guān)基因的表達(dá)情況評估該樣本中是否含有該分枝桿菌。
本發(fā)明構(gòu)建了針對分枝桿菌菌種鑒定的基因芯片檢測系統(tǒng)，可快速、準(zhǔn)確檢測臨床樣本中的分枝桿菌的菌種類型，具有檢測周期短(整個過程只需1天)、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對于指導(dǎo)臨床用藥和治療有重要的意義，可廣泛用于臨床分枝桿菌菌種鑒定試驗。
圖1為本發(fā)明的分枝桿菌菌種鑒定芯片檢測試劑盒樣本檢測的顯色圖，圖中共有11張膜條。
圖2-圖26為用25種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株測試本發(fā)明檢測膜條特異性的顯色圖。
具體實施方式下面，結(jié)合附圖，通過對本發(fā)明較佳實施方式的描述，詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明。
實施例1
分支桿菌菌種檢測芯片的制備1.生產(chǎn)原材料的廠商、規(guī)格
探針序列設(shè)計如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.47所示，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成3’端氨基標(biāo)記探針。
2.生產(chǎn)膜條按照以下的步驟及原料生產(chǎn)膜條
將膜條按要求裁剪↓新鮮配制EDAC溶液泡膜30分鐘↓用蒸餾水洗膜4次，2分鐘/次，濾紙上晾干，將膜片固定在濾紙上↓用探針稀釋液將探針母液稀釋各探針的終濃度為10μM↓按照膜上的格子按順序每格點(diǎn)入1ul探針↓點(diǎn)好的膜室溫放置20分鐘晾干↓用0.1mol/L NaOH浸泡膜條5分鐘↓棄去NaOH，用蒸餾水洗4次↓充分晾干后，裁成條狀，干燥瓶內(nèi)保存?zhèn)溆?br>實施例2
分枝桿菌菌種鑒定芯片檢測試劑盒樣本檢測2005年7月～11月，分別在深圳東湖醫(yī)院和廣州胸科醫(yī)院進(jìn)行了臨床驗證，結(jié)果證明，本發(fā)明的檢測系統(tǒng)通量大、靈敏度高，基因芯片技術(shù)的引入使得該方法具有比培養(yǎng)法更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。具體試劑、檢測方法如下試劑盒組成
本實施例中PCR引物上游序列為SEQ.ID 51，下游序列為SEQ.ID 51。
其他儀器及試劑PCR儀、DNA電泳儀、分子雜交箱、搖床、生理鹽水、3％H2O2配制或市場購買下述溶液
●操作步驟1.臨床痰樣的處理方法1)收集病人痰樣，加入等量的化痰試劑(痰樣化解液+約0.5％NALC，現(xiàn)配當(dāng)天用)，化痰處理15～30分鐘。
2)痰樣消化液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。倒凈上清液，再用移液器吸去殘余在離心管底附近的液體。
3)加入1mLPBS，混合懸浮樣品并轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管里，13000rpm離心5min，棄上清。
4)沉淀物加入10mMTris，混合懸浮樣品，13000rpm離心5min，棄上清。
5)加入50μL裂解液，打散沉淀塊，于沸水浴中煮沸10分鐘(注意離心管蓋可能會爆開，小心污染)。
6)短暫離心，上清液即可作為PCR模板。
2.PCR擴(kuò)增每個樣品各取一管20μL的PCR Mix，分別加入5μL樣品上清液作為PCR擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增程序為
3.雜交打開雜交箱，預(yù)熱至57℃。
取15mL塑料離心管，放入標(biāo)有樣本編號的膜條(應(yīng)在膜條的一角用鉛筆標(biāo)記)，加入A液4-6mL及相應(yīng)的兩管PCR產(chǎn)物，置于沸水浴中加熱10分鐘(確保雜交液面完全位于水浴液面之下)。
擰緊離心管蓋子，放入雜交箱于57℃雜交1.5小時至過夜。同時取50mL塑料管，加入40mLB液于雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至57℃。
4.洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL管中，于56℃輕搖洗滌15分鐘(每管40mL溶液，最多可同時洗滌6張膜)5.顯色用A液配制1∶2000的POD溶液(單做兩張膜只需3μLPOD母液，配制成6mL使用液，做四張膜可用5μLPOD母液，配制成10mL使用液)，室溫輕搖浸泡30分鐘，棄去POD溶液。用A液室溫輕搖洗兩次，每次5分鐘。用C液室溫洗膜1-2分鐘，同時配制顯色液(顯色液需新鮮配制，配法按順序加入以下成份19mL 0.1M檸檬酸鈉；1mL TMB 10μL3％H2O2)。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色(每隔5-10分鐘觀察一次，直至肺結(jié)核陽性樣品顯現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，此過程約需30分鐘至數(shù)小時)。
6.結(jié)果判定膜條上的探針排列順序
注1.GEN代表分枝桿菌屬特異性探針，其它探針簡稱代表的意義是MTC→結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、MAV→鳥分枝桿菌、MIN→胞內(nèi)分枝桿菌、MKA→堪薩斯分枝桿菌、MSC→瘰癘分枝桿菌、MAB→膿腫分枝桿菌、MCH→龜分枝桿菌、MMA→海分枝桿菌、MXE→蟾蜍分枝桿菌、MFO→偶發(fā)分枝桿菌；2.PC代表質(zhì)控對照。
參見圖1，為膜條顯色結(jié)果示例。編號為1的膜條顯示所測樣品中有結(jié)核分枝桿菌；編號為2的膜條顯示所測樣品中有堪薩斯分枝桿菌；編號為3的膜條顯示所測樣品中有胞內(nèi)分枝桿菌；編號為4的膜條顯示所測樣品中有膿腫分枝桿菌；編號為5的膜條顯示所測樣品中有偶發(fā)分枝桿菌；編號為9的膜條顯示所測樣品中有分枝桿菌；編號為18的膜條顯示所測樣品中有鳥分枝桿菌；編號為20的膜條顯示所測樣品中有瘰癘分枝桿菌；編號為23的膜條顯示所測樣品中有蟾蜍分枝桿菌；編號為24的膜條顯示所測樣品中有膿腫分枝桿菌；編號為“空”的膜條檢測的是陰性對照樣品。
為判定檢測結(jié)果的可靠性，每次檢測務(wù)必設(shè)置陰性對照。
實施例3
不同分枝桿菌擴(kuò)增后雜交效果比較的特異性試驗。
在本發(fā)明中，對于其它的分枝桿菌的雜交有很好的特異性。以下實驗旨在證明本產(chǎn)品的特異性針對下列不同的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)、堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)、胞內(nèi)分枝桿菌(ATCC13950)、偶發(fā)分枝桿菌(ATCC6481)、戈登分枝桿菌(ATCC14470)、金色分枝桿菌(ATCC23366)、新金色分枝桿菌(ATCC25795)、淺黃分枝桿菌(ATCC43909)、愛知分枝桿菌(ATCC27280)、田鼠分枝桿菌(ATCC19422)、恥垢分枝桿菌(ATCC19420)、副偶發(fā)分枝桿菌(ATCC19686)、土分枝桿菌(ATCC19619)、不產(chǎn)色分枝桿菌(ATCC19530)、母牛分枝桿菌(ATCC15483)、鳥分枝桿菌(ATCC25291)、草分枝桿菌(ATCC11758)、瘰疬分枝桿菌(ATCC19981)、胃分枝桿菌(ATCC15754)、次要分枝桿菌(ATCC23292)、蟾蜍分枝桿菌(ATCC19250)、膿腫分枝桿菌(ATCC19977)、非洲分枝桿菌(ATCC25420)、牛分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌(ATCC19423)。
按照實施例2的方法以上述25種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株為樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與膜條雜交，水為陰性對照，結(jié)果見圖2-26，圖2-26依次為H37Rv、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、金色分枝桿菌、戈登分枝桿菌、新金色分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、愛知分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、副偶發(fā)分枝桿菌、土分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、母牛分枝桿菌、草分枝桿菌、胃分枝桿菌、次要分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌的顯色結(jié)果。
由圖2-26結(jié)果可見，不同分枝桿菌均獲得了很好的雜交結(jié)果，并且不存在交叉雜交的情況，因此證明本發(fā)明的特異性極高。
以上對本發(fā)明的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變化，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求
的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司<120>分枝桿菌菌種鑒定基因芯片檢測系統(tǒng)<130>
<160>54<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1cttggtggtg gggtgtggac ttt 23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2aaagtccaca ccccaccacc aag 23<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列
<400>3tggatagtgg ttgcgagcat c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gatgctcgca accactatcc a 21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5cgggtgcatg acaacaaagt tg 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6caactttgtt gtcatgcacc cg 22<210>7<211>21
<212>DNA<213>人工序列<400>7ccccaactgg tggggcgtag g 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8cctacgcccc accagttggg g 21<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9acgaaaagca ctccaattgg tg 22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10caccaattgg agtgcttttc gt 22
<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11ttcccgtctg tagtggacgg g 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12cccgtccact acagacggga a 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13ctcggtcgat ccgtgtggag t 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14actccacacg gatcgaccga g 21
<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15acgaaaagca ctccaattgg t 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16accaattgga gtgcttttcg t 21<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>17ttctcgtctg tagtggacga aa 22<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列
<400>18tttcgtccac tacagacgag aa 22<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19acgaaaagca ccccaactgg t 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>20accagttggg gtgcttttcg t 21<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>21ttctcgcctg tagtgggcgg gag 23<210>22<211>23<212>DNA
<213>人工序列<400>22ctcccgccca ctacaggcga gaa 23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>23tcggctcgtt ctgagtggtg t 21<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>24acaccactca gaacgagccg a 21<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>25aagcatccca acaagtgggg t 21<210>26
<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>26accccacttg ttgggatgct t 21<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>27cacgacaaca agcaaagcca 20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28tggctttgct tgttgtcgtg 20<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>29agtaggtatc tgtagtggat atc 23
<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>30gatatccact acagatacct act 23<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>31tcggactgtc ataagaattg aa 22<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>32ttcaattctt atgacagtcc ga 22<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>33
agccgaatga gcttgggaac a 21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>34tgttcccaag ctcattcggc t 21<210>35<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>35agtttctgta gtggttactc gc 22<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>36gcgagtaacc actacagaaa ct 22<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列
<400>37ccgggtgcac aacaacaagc 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>38gcttgttgtt gtgcacccgg 20<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>39ttggatgcgc tgccttttgg t 21<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40accaaaaggc agcgcatcca a 21<210>41<211>21
<212>DNA<213>人工序列<400>41gtgggttcgg cgtgttgtgg c 21<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>42gccacaacac gccgaaccca c 21<210>43<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>43ggtgttgggc agcaggcagt aa 22<210>44<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>44ttactgcctg ctgcccaaca cc 22
<210>45<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>45cccgtggtgg tgttgtgctc cg 22<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>46cggagcacaa caccaccacg gg 22<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>47tggcatccgg ttgcgggtgt c 21<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>48gacacccgca accggatgcc a 21
<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>49cttttggggg gtggcatcc 19<210>50<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>50ggatgccacc ccccaaaag 19<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>51ggagggagct gtcgaaggtg ggat 24<210>52<211>23<212>DNA<213>人工序列
<400>52ggcatccacc atgcgccctt aga 23<210>53<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>53cgatcccacc ttcgacagct cc 22<210>54<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>54tgtctaaggg cgcatggtgg a 21
權(quán)利要求
1.一種用于分枝桿菌菌種鑒定的基因芯片，包括基底及固定于該基底上的探針，其特征在于所述探針為可分別與分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌的16S rRNA和23S rRNA之間的間隔序列(ITS)基因雜交的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的基因芯片，其特征在于所述基底為尼龍膜，所述探針的3’端進(jìn)行氨基標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的基因芯片，其特征在于所述探針包括選自下述核苷酸序列的至少一種SEQ ID NO.1～4中任意一條、SEQ ID NO.5～8中任意一條、SEQ ID NO.9～14中任意一條、SEQ ID NO.15～18中任意一條、SEQ IDNO.19～24中任意一條、SEQ ID NO.25～28中任意一條、SEQ ID NO.19～24中任意一條、SEQ ID NO.25～28中任意一條、SEQ ID NO.29～32中任意一條、SEQ ID NO.33～36中任意一條、SEQ ID NO.37～40中任意一條、SEQ ID NO.41～46中任意一條、SEQ ID NO.47～50中任意一條。
4.一種用于樣本中分枝桿菌菌種鑒定的檢測試劑，其特征在于它至少包括權(quán)利要求
1所述的基因芯片；以及從待測樣本中擴(kuò)增分枝桿菌不同菌種的16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列(ITS)基因的PCR引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測試劑，其特征在于所述基因芯片包括基底以及固定于所該基底上的探針，所述探針為可分別與分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌的16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列(ITS)基因雜交的核酸；所述探針包括選自下述核苷酸序列的至少一種SEQ ID NO.1～4中任意一條、SEQ ID NO.5～8中任意一條、SEQ ID NO.9～14中任意一條、SEQ ID NO.15～18中任意一條、SEQ ID NO.19～24中任意一條、SEQ ID NO.25～28中任意一條、SEQ ID NO.19～24中任意一條、SEQ ID NO.25～28中任意一條、SEQID NO.29～32中任意一條、SEQ ID NO.33～36中任意一條、SEQ ID NO.37～40中任意一條、SEQ ID NO.41～46中任意一條、SEQ ID NO.47～50中任意一條。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測試劑，其特征在于所述PCR引物為上游引物SEQID NO.51與下游引物SEQ ID NO.52或上游引物SEQ ID NO.53與下游引物SEQ ID NO.54。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的檢測試劑，其特征在于所述引物的末端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
8.一種用于分枝桿菌菌種鑒定的試劑盒，其特征在于它包括權(quán)利要4所述的檢測試劑；以及下述試劑的一種或幾種樣本處理試劑；PCR擴(kuò)增試劑；雜交試劑；和顯色試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步包含陰性對照和/或陽性對照樣本。
10.一種鑒定待測樣本分枝桿菌菌種的方法，其特征在于將待檢測樣本使用權(quán)利要求
4所述檢測試劑檢測，通過樣本中16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列(ITS)基因表達(dá)情況確定菌種。
專利摘要
本發(fā)明涉及用于分枝桿菌菌種鑒定的基因芯片檢測系統(tǒng)，包括用于檢測分枝桿菌屬、結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌的基因芯片和待測樣品中以上菌種的16S rRNA和23S rRNA之間的插入序列(ITS)基因的PCR引物。本發(fā)明構(gòu)建了針對分枝桿菌菌種鑒定的基因芯片檢測系統(tǒng)，可快速、準(zhǔn)確檢測臨床樣本中的分枝桿菌的菌種類型，具有檢測周期短(整個過程只需1天)、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，對于指導(dǎo)臨床用藥和治療有重要的意義，可廣泛用于臨床分枝桿菌菌種鑒定試驗。
文檔編號C12Q1/04GK1995387SQ200610063554
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月7日
發(fā)明者鄒耀東, 任維, 向筑, 廖生赟, 田潔 申請人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan