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一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法和應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):77802閱讀:740來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法,屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域
。本發(fā)明還涉及上述方法在發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的應(yīng)用,屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)
丙酮酸又稱(chēng)2-氧代丙酸O-Oxopropanic acid)、α -酮基丙酸 (a -Ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(Acetylformic acid),為無(wú)色至淡黃色液體,呈醋酸香氣和愉快的酸味,是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用,而且是合成多巴胺、L-酪氨酸等多種有用化合物的前體。因此,它在制藥、日用化工、農(nóng)用化學(xué)品等工業(yè)及科學(xué)研究中有著廣泛的用途。
自從20世紀(jì)50年代開(kāi)始發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸以來(lái),國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)丙酮酸生物合成的研究越來(lái)越深入,涉及菌種選育、營(yíng)養(yǎng)條件、維生素、溶氧水平、溫度控制、耐高滲和耐酸性等各個(gè)方面。為了達(dá)到丙酮酸高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的相對(duì)統(tǒng)一,研究者又通過(guò)分子手段引入外源代謝途徑,從輔因子工程方面入手研究了丙酮酸生物合成中的能量代謝,并對(duì)糖酵解作用作了一些有益的研究,研究者還在菌株耐高滲和耐酸方面也作了一些探索。但是在不同氮源的利用水平尤其是尿素對(duì)丙酮酸生產(chǎn)的影響方面鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法和本方法在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。利用本發(fā)明能夠提高丙酮酸發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法和應(yīng)用,以多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019為生產(chǎn)菌株,利用尿素代替氯化銨作為唯一氮源,初始添加量為7g/L,在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模7L發(fā)酵罐分批發(fā)酵培養(yǎng),且在30L發(fā)酵罐上進(jìn)行了中試。
菌種光滑球擬酵母(T. glabrata)CCTCC M202019,硫胺素、煙酸、生物素和吡哆醇四重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型,且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低,為本研究室選育,主要用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸,該菌種已申請(qǐng)中國(guó)專(zhuān)利,申請(qǐng)?zhí)枮?2113142. 2,公開(kāi)號(hào)為CN1392M6A。
本發(fā)明的有益效果利用本發(fā)明能夠有效提高丙酮酸的產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度,大幅縮短發(fā)酵周期丙酮酸產(chǎn)量由79. 7g/L提高至88. 7g/L,提高幅度為11.3%,發(fā)酵周期由8 縮短至72h,幅度為15. 3%,從而發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度由0. 94g/(L-h)提高至1. 23g/(L *h),幅度為30.9%。優(yōu)化后的結(jié)果在30L規(guī)模發(fā)酵罐得到驗(yàn)證。
本發(fā)明通過(guò)提供一種利用尿素作為氮源的策略,提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。這對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)其他產(chǎn)品具有一定的指導(dǎo)意義。
具體實(shí)施方式
[0009]對(duì)照實(shí)施例本發(fā)明所用菌種為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019。
先轉(zhuǎn)接斜面在培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)Mh,每只搖瓶(50/500mL)接一環(huán)斜面菌種,在溫度30°C,轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)Mh ;最后在7L發(fā)酵罐中發(fā)酵,發(fā)酵條件為pH 5. 5,攪拌轉(zhuǎn)速400rpm,通氣2. Ovvm。
斜面種子固體培養(yǎng)基(g/L)
葡萄糖30,大豆蛋白胨 10,KH2PO4 1,MgSO4 · 7H20 0. 5,瓊脂粉 20g,用 6mol/L HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始PH為5. 5。自來(lái)水定容。于121°C滅菌15min。
種子培養(yǎng)基(g/L)
葡萄糖30,大豆蛋白胨 10,KH2PO4 1,MgSO4 · 7H20 0. 5,用 6mol/L HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始PH為5. 5。自來(lái)水定容。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)
葡萄糖120,尿素 7,CH3COONa 3,KH2PO4 3,MgSO4 · 7H20 0. 8,L-谷氨酸 0. 8,微量元素液10mL,維生素液10mL,pH5. 5。自來(lái)水定容。
微量元素液MnCl2· 4H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 2g, CaCl2 · 2H20 2g, CuSO4 · 5H20 0. 05g,ZnCl2 0. 5g,溶解后定容至 IL0
維生素液鹽酸硫胺素1. 5mg, D-生物素0. 004g,鹽酸吡哆醇0. 04g,煙酸0. 8g, 6mol/LHCl溶解后定容至1L。
實(shí)施例1 發(fā)酵條件同對(duì)照例,將發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源改為氯化銨和尿素兩種復(fù)合氮源,氯化銨尿素(1 1)為6.2 3.5g/L,復(fù)合氮源中含氮量與7g/L尿素含氮量相當(dāng)。
發(fā)現(xiàn)①菌體生長(zhǎng)加快,發(fā)酵7 時(shí)菌體干重為16. 5g/L ;提高了(15. 9g/L) 2. 5%; ②發(fā)酵進(jìn)行到72h時(shí),菌體耗糖速度提高了 13. 1 % ;③發(fā)酵周期從8 縮短至79h,幅度為 7. 1%;④發(fā)酵結(jié)束時(shí),最高丙酮酸濃度為82. lg/L,提高3. 0%;⑤丙酮酸發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度提高 10. 6%。
實(shí)施例2 發(fā)酵條件同對(duì)照例,將發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源改為尿素,尿素添加量為7g/ L0
發(fā)現(xiàn)①菌體生長(zhǎng)加快,發(fā)酵72h時(shí)菌體干重為17.8g/L;提高了(15. 9g/ L)11.9% ;②發(fā)酵進(jìn)行到72h時(shí),菌體耗糖速度提高了 20.2% ;③發(fā)酵周期從8 縮短至 72h,幅度為15. 3% ;④發(fā)酵結(jié)束時(shí),最高丙酮酸濃度為88. 7g/L,提高11. 3% ;⑤發(fā)酵結(jié)束時(shí)丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提高30. 9 %。
權(quán)利要求
1.一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法,其特征是以多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019為生產(chǎn)菌株,利用尿素代替氯化銨作為唯一氮源,在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模7L發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)60h,并在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行中試;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 120,尿素 7,CH3COONa 3,KH2PO4 3,MgSO4 · 7H20 0. 8,L-谷氨酸 0. 8,微量元素液10mL,維生素液IOmL, pH 5. 5,自來(lái)水定容;微量元素液=MnCl2 · 4H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 2g, CaCl2 · 2H20 2g, CuSO4 · 5H20 0. 05g, ZnCl2O. 5g,溶解后定容至IL ;維生素液鹽酸硫胺素1. 5mg, D-生物素0. 004g,鹽酸吡哆醇0. 04g,煙酸0. 8g,6mol/ LHCl溶解后定容至1L。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法,其特征在于控制尿素初始添加量為7g/L,通氣量為 2vvm,硫胺素添加量為15 μ g/L,最大菌體濃度OD66tl達(dá)到61。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公布了一種利用尿素作為氮源提高發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)量的方法,屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域
。本發(fā)明通過(guò)以多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCCM202019為生產(chǎn)菌株,利用尿素代替氯化銨作為唯一氮源,初始添加量為7g/L,在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模7L發(fā)酵罐分批發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明有效提高丙酮酸的產(chǎn)量(11.9%)及生產(chǎn)強(qiáng)度(30.9%),大幅縮短發(fā)酵周期(20.6%),上述成果在30L規(guī)模發(fā)酵罐中成功進(jìn)行了中試,具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/40GKCN102286550SQ201110166742
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月21日
發(fā)明者劉立明, 楊松鑫, 汪軍, 陳修來(lái), 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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