專利名稱:抗乙型肝炎病毒尼古丁藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物，尤其是涉及一種用尼古丁處理樹突狀細胞的方法，以及用HBV抗原HBe、HBx負載尼古丁處理后樹突狀細胞的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(Hepatisis B virus,HBV)引起的病毒性肝炎是嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，目前，全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者約3.5億，中國占1/3以上，約為1.2億，其中有1/4約3000萬為慢性乙型肝炎患者。因此，研究慢性乙型肝炎預防和治療的措施已成為生命科學與醫(yī)學研究領(lǐng)域的重點和熱點。
RongQ等人以分子生物學手段對HBV在肝外組織的存在狀態(tài)進行研究發(fā)現(xiàn)，HBV不僅可在肝細胞中增殖，而且可在包括淋巴細胞、心肌細胞、腎實質(zhì)細胞等多種細胞中增殖和潛伏。肝外組織中HBV的潛伏可逃避以肝細胞特異性受體為特異靶點的免疫治療的打擊，成為HBV慢性化的根源之一。Agostini C等的研究發(fā)現(xiàn)，HBV在淋巴細胞中的存在可影響淋巴細胞的增殖分化與功能，肝臟內(nèi)HBV特異性CTL (殺傷性T細胞)的失能以及機體對HBV抗原的免疫耐受是HBV感染慢性化的關(guān)鍵。
病毒感染細胞的清除主要依靠適應性免疫應答產(chǎn)生的病毒抗原特異性CTL，以及適應性免疫應答和固有免疫應答過程中分泌的IFN-Y等細胞因子。樹突狀細胞作為適應性免疫應答的啟動者，是目前所知抗原提呈功能最強的抗原提呈細胞(antigenpresenting cell，APC)，而且是連接適應性免疫和固有免疫的橋梁。對樹突狀細胞的研究有助于深入了解機體免疫應答的產(chǎn)生和調(diào)控機制。通過人為干預樹突狀細胞的功能來調(diào)控機體的免疫應答，以達到對HBV病毒感染的治療作用，對乙型肝炎的防治具有重要的實際意義。[0005]隨著對HBV慢性化進程中免疫細胞失能和免疫逃逸機制的深入研究，以HBV抗原特異性CTL過繼免疫和固有分子TRM22抗HBV研究也逐步開展。蔡大川等以人HBsAg負載的人臍血來源的樹突狀細胞與同源靶細胞進行進行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞可在體外特異性殺傷HBsAg負載的靶細胞。HBV抗原負載的樹突狀細胞雖然可在HBV轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)成功打破已有的免疫耐受，誘導產(chǎn)生針對抗原的特異性免疫應答，但此類樹突狀細胞在體內(nèi)產(chǎn)生免疫應答的效率有待于進一步提高。經(jīng)細胞因子IL-15、IL-4、IL-18、IFN-Y刺激或其基因轉(zhuǎn)染，聯(lián)合抗原負載以增強樹突狀細胞誘導效率的研究方興未艾，但上述方法有操作復雜、價格昂貴、活性不穩(wěn)定的缺點而限制其在臨床的廣泛應用。
乙酰膽堿煙堿樣受體(nicotineacetylcholine receptor, nAchR)在神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)細胞(如免疫細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞)中有廣泛的表達。nAchR配體——尼古丁，是由芳族六元環(huán)(吡啶)和脂族五元環(huán)(吡咯烷)通過單鍵連接而形成的天然化合物。提純后的尼古丁是一種味苦、無色透明的油質(zhì)液體，揮發(fā)性強，在空氣中極易氧化成暗灰色，能迅速溶于水及酒精中，通過口鼻支氣管粘膜很容易被機體吸收，粘在皮膚表面的尼古丁亦可被吸收滲入體內(nèi)。它具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于獲得和價廉的優(yōu)點。[0007]尼古丁的英文通用名稱為nicotine，中文化學名稱為(S)_3_(1-甲基_2_吡咯燒基)卩比唳，英文化學名稱為(S)-3-(l-Methyl-2-pyrrolidinyl)pyridine,國際編號為61868，CAS編碼為54-11-5，其結(jié)構(gòu)式為:
權(quán)利要求
1.一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于，所述抗乙型肝炎樹突狀細胞為抗乙型肝炎樹突狀細胞表面⑶80、⑶86、⑶40、CCR7表面分子的表達量顯著增加，表明細胞處于活化狀態(tài)，激活乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒X抗原特異性T細胞的能力顯著增強；MHC I類分子表達增加，表明此細胞具有更強的提呈乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒X抗原的能力； 所述制備方法包括以下步驟: 1)將未成熟的樹突狀細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液為RPMIMedium 1640培養(yǎng)液，在RPMI Medium 1640培養(yǎng)液中含有摩爾濃度為I X 1(Γ8 I X l(T6mol/L的尼古丁 ； 2)使乙型肝炎病毒e抗原，或/和 乙型肝炎病毒X抗原，與 步驟I)中經(jīng)尼古丁處理的樹突狀細胞接觸； 3)收集樹突狀細胞，即得到抗乙型肝炎樹突狀細胞。
2.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述未成熟的樹突狀細胞為獲自哺乳動物的未成熟樹突狀細胞。
3.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述尼古丁的摩爾濃度為I X l(T7mol/L。
4.按權(quán)利要求
1或3所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述尼古丁的來源為化學合成或提取自天然植物，所述天然植物選自煙草、番茄或枸杞子 。
5.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述尼古丁為尼古丁水溶液。
6.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養(yǎng)的時間為12 16h。
7.按權(quán)利要求
6所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時間為12 14h。
8.按權(quán)利要求
7所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時間為12h。
9.按權(quán)利要求
1所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所用HBe、HBx抗原濃度為I 10 μ g/ml,所述HBV的抗原HBeAg、HbxAg來自重組工程菌所表達的蛋白；所述接觸的時間為4 6h。
10.按權(quán)利要求
9所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原濃度為I 5 μ g/ml，所述接觸的時間為6h。
11.按權(quán)利要求
10所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原濃度為I 2 μ g/ml。
12.按權(quán)利要求
11所述的一種抗乙型肝炎樹突狀細胞的制備方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原濃度為I μ g/ml。
專利摘要
抗乙型肝炎病毒尼古丁藥物組合物，涉及一種組合物。提供一種抗乙型肝炎樹突狀細胞及其制備方法，以及抗乙型肝炎樹突狀細胞在制備用于預防和/或治療乙型肝炎藥物中的應用。將未成熟的樹突狀細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液為RPMI Medium 1640培養(yǎng)液，在RPMI Medium 1640培養(yǎng)液中含有尼古?。皇挂倚透窝撞《緀抗原，或/和乙型肝炎病毒x抗原，與經(jīng)尼古丁處理的樹突狀細胞接觸；收集樹突狀細胞，即得到抗乙型肝炎樹突狀細胞。所述抗乙型肝炎樹突狀細胞可應用于制備用于預防和/或治療乙型肝炎藥物。用于預防和/或治療乙型肝炎藥物包括抗乙型肝炎樹突狀細胞和藥學上可接受的載體。
文檔編號C12N5/0784GKCN101693885 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200910112670
公開日2013年5月8日 申請日期2009年10月16日
發(fā)明者李海濤, 高豐光, 倪曉妍 申請人:廈門大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),