專利名稱:2,3-丁二醇生產(chǎn)過程與微生物生物質(zhì)循環(huán)利用的集成化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用回收的粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2， 3-丁二醇的方法。
背景技術(shù)：
2，3-丁二醇0，3-butanediol，簡(jiǎn)稱BD，下同)廣泛應(yīng)用于化工、食品以及航空航天等各個(gè)領(lǐng)域，其熱值27200kJ/kg，同乙醇的熱值Q9100kJ/kg)接近，可用作燃料，還可用來(lái)制備聚合物、油墨、香水、防凍劑、香熏劑、增濕劑、炸藥以及藥物的手性載體等。它脫水成甲乙酮，可用作樹脂、油漆的溶劑；脫水成丁二烯，可用于合成橡膠；它還可以代替1，4_ 丁二醇，用于聚酯和聚亞安酯的合成；同甲乙酮縮合并進(jìn)行加氫形成辛烷，可用來(lái)生產(chǎn)高級(jí)航空用油。2，3-丁二醇與乙酸反應(yīng)生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯類可加到奶油中改善風(fēng)味；2，3- 丁二醇還可被添到白酒中，以改善白酒的風(fēng)味。
目前的生物技術(shù)領(lǐng)域：
相關(guān)工業(yè)的發(fā)酵體積已位居世界前3位，每年產(chǎn)生的廢菌體已達(dá)500萬(wàn)噸，生產(chǎn)如此巨量的廢菌體需消耗大量能源(電、熱、水等)和資源(糧食資源、 有機(jī)和無(wú)機(jī)氮等)，而限于我國(guó)當(dāng)前的行業(yè)整體水平，這些廢菌體的回收利用和環(huán)保處理水平低下，其結(jié)果是造成能源和資源的極大浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染。
我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的目標(biāo)是促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，因此，資源的回收利用極為重要。 資源短缺、環(huán)境惡化和人口增加，三因素迭加已經(jīng)成為制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)穩(wěn)定、快速發(fā)展的最大制約力。因而國(guó)家提出，“十一五”期間節(jié)能減排目標(biāo)是單位國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值能耗降低 20%左右、主要污染物排放總量減少10%，這是建設(shè)資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)的必然選擇；是推進(jìn)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整，轉(zhuǎn)變?cè)鲩L(zhǎng)方式的必由之路。
回收發(fā)酵液中的粘質(zhì)沙雷氏菌的菌體，不僅可以顯著提高發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的生產(chǎn)率、主要生物質(zhì)碳源的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以大大減少菌體排放對(duì)環(huán)境的污染問題。
大量微生物菌體在失活后被用來(lái)當(dāng)作肥料，可以通過液體直接形成肥料，也可以是固體底物的堆積肥料；還有些菌體常被作為廢物處理，在污水處理廠中分解，或是被燃
；Bs
JyCi。
目前回收利用菌體的方法主要有破壁提取菌體可溶性成分，作為微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分，其中包括機(jī)械破碎法和菌體自溶法；利用活菌體，即生產(chǎn)過程直接回收利用活菌體。
前者研究的比較多，主要有⑴德國(guó)比勒費(fèi)爾德大學(xué)研究了克雷伯氏菌的發(fā)酵、 大腸桿菌B-3996的重組株發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸和地衣芽孢桿菌DSM 13發(fā)酵生產(chǎn)枯草桿菌蛋白酶和堿性蛋白酶過程中的菌體回收利用，用高壓勻漿法和蛋白酶處理法來(lái)降解和溶解細(xì)菌菌體細(xì)胞，處理后的菌體以培養(yǎng)基的形式被放回原過程中進(jìn)行再利用；( 美國(guó) Martek Corporation的R. Radmer等研究了水解藻類菌體作為藻類生長(zhǎng)的碳源和能源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以提高閉合系統(tǒng)中藻類培養(yǎng)的能量利用率；C3)啤酒生產(chǎn)中酵母的部分回收利用啤酒發(fā)酵后，大量的泥狀酵母可制成干燥酵母，既可壓成片狀供藥用，也可做為飼料的添加劑，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)成份。
活菌體的利用實(shí)例主要有(1)啤酒生產(chǎn)中的酵母，除了破壁利用，還可以回收利用其活菌體，繼續(xù)釀造啤酒；(2)環(huán)境保護(hù)中，處理污水時(shí)，常用活細(xì)菌、原生動(dòng)物和其它微生物的凝絮團(tuán)吸附、分解有機(jī)物或毒素，這種活性污泥常被回收再利用；C3)Minier Michel 等研究了生產(chǎn)丁醇和丙酮的丙酮丁醇梭菌菌體的回收利用此發(fā)酵過程可為連續(xù)培養(yǎng)和分批培養(yǎng)，將發(fā)酵液放入超濾區(qū)，則包含菌體的殘留物部分循環(huán)進(jìn)入發(fā)酵區(qū)，從而進(jìn)行循環(huán)利用。
本申請(qǐng)人以往公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法，中國(guó)公開號(hào)0附884560， 將粘質(zhì)沙雷氏菌種子液接種于培養(yǎng)基中，通入空氣，攪拌，RQ控制在0.9 1.2之間；然后補(bǔ)入產(chǎn)物促進(jìn)因子，補(bǔ)充蔗糖水溶液和氨基酸水溶液，RQ控制在1. 5 1. 8之間；最后補(bǔ)入蔗糖水溶液將RQ控制在1. 9 2. 2之間，發(fā)酵培養(yǎng)，即獲得含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵培養(yǎng)液。利用粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3_丁二醇已有很大進(jìn)展，但是發(fā)酵生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量廢菌體的排放不僅是一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問題，而且還導(dǎo)致大量碳源氮源等生物質(zhì)資源的流失，對(duì)節(jié)能減排帶來(lái)巨大壓力。
現(xiàn)存的回收利用菌體可溶性成分的方法均為資源回收利用的有效方法，但是，這個(gè)過程常包含破壁溶解、過濾、分離甚至干燥等不可缺少的階段，因此也會(huì)造成資源能源的浪費(fèi)，不能實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排的最終目的；而回收利用活菌體的實(shí)例目前研究的比較少，因此， 回收利用活菌體來(lái)提高產(chǎn)物產(chǎn)量、提高生物質(zhì)資源利用率和減少能源消耗是本領(lǐng)域迫切需要研究發(fā)展的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供循環(huán)利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的方法，所述方法包括
(1)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-15% (優(yōu)選4-10%)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)30-50小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲2， 3- 丁二醇產(chǎn)物；
(2)從發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌；
(3)將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在培養(yǎng)基中的OD值為 20-80，發(fā)酵培養(yǎng)30-50小時(shí)，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，使粘質(zhì)沙雷氏菌在培養(yǎng)基中的OD值為30-70。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，所述的回收粘質(zhì)沙雷氏菌是通過離心的方法從發(fā)酵液中分離獲得。
在另一優(yōu)選例中，離心的條件如下4士2°C，10000士3000rpm，15-20min。
在另一優(yōu)選例中，在步驟C3)后面還包括 重復(fù)步驟⑵-(3) 1-5次(優(yōu)選1-3次)。 在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有[0023]蔗糖90 士 20g/L，蛋白胨 20 士 5g/L，酵母粉 5 士 2g/L，檸檬酸 10 士 3g/L， MnSO4O. 1 士0. 05g/L, KH2PO4 0. 5 士0. 2g/L, FeSO4 0. 02 士0. 005g/L, MgSO4 0. 5 士0. 2g/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還含有KAc6士2g/L ；NaN032士0. 5g/L。
在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始PH值是7士0. 5。
在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵過程中，還流加蔗糖溶液(優(yōu)選45-55 %的蔗糖溶液)，提供充足的碳源。
在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵至6-12小時(shí)后，將PH維持在6 士 0. 5。
在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵溫度為。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的方法，所述方法包括
(a)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-15% (優(yōu)選4_10% )的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)30-50小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲2， 3- 丁二醇產(chǎn)物；
(b)從發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌；
(c)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-10% (優(yōu)選4-6% )的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)至1516小時(shí)，將(b)回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在培養(yǎng)基中的OD值為20-80 (優(yōu)選20-40 ；更優(yōu)選20-30)，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4_25小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，在發(fā)酵培養(yǎng)20-25小時(shí)后，將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(C)后面還包括
重復(fù)步驟(b)_(C) 1-5 次。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了在搖瓶中接入回收活菌體(1組、2組或3組)或5%的種子液(0組) 后，各組在發(fā)酵過程中的OD值變化情況。
圖2顯示了在搖瓶中接入回收活菌體(1組、2組或3組)或5%的種子液(0組) 后，各組在發(fā)酵過程中的BD產(chǎn)量變化情況。
圖3顯示了在搖瓶中接入回收活菌體(1組、2組或3組)或5%的種子液(0組) 后，各組在發(fā)酵過程中的BD產(chǎn)物的產(chǎn)率變化情況。
圖4顯示了在搖瓶中接入回收活菌體(1組、2組或3組)或5%的種子液(0組) 后，各組在發(fā)酵過程中的蔗糖利用率比較情況。
圖5顯示了分別在發(fā)酵Oh時(shí)(1組)、他時(shí)0組)、1211時(shí)(3組)和24h時(shí)0組) 接入回收菌體，各組的在發(fā)酵過程中的OD值變化情況。
圖6顯示了分別在發(fā)酵Oh時(shí)(1組)Ah時(shí)O組)、12h時(shí)(3組)和24h時(shí)G組) 接入回收菌體，各組的在發(fā)酵過程中的含糖量比較情況。
圖7顯示了分別在發(fā)酵Oh時(shí)(1組)Ah時(shí)O組)、12h時(shí)(3組)和24h時(shí)G組)接入回收菌體，各組的在發(fā)酵過程中的BD產(chǎn)量變化情況。
圖8顯示了分別在發(fā)酵Oh時(shí)(1組)Ah時(shí)O組)、12h時(shí)(3組)和24h時(shí)G組) 接入回收菌體，各組的在發(fā)酵過程中的BD產(chǎn)物的產(chǎn)率變化情況。
圖9顯示了分別在發(fā)酵Oh時(shí)(1組)Ah時(shí)O組)、12h時(shí)(3組)和24h時(shí)G組) 接入回收菌體，各組的在發(fā)酵過程中的蔗糖利用率比較情況。
具體實(shí)施方式
為了達(dá)到生物質(zhì)資源有效利用的目的，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次開發(fā)和優(yōu)化了一種循環(huán)利用粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的方法。所述的方法與接種種子菌發(fā)酵相比2，3-丁二醇產(chǎn)率有明顯的提高，而且糖轉(zhuǎn)化率高。因此，本發(fā)明的方法有效地提高了生物質(zhì)資源利用率，減少了能源消耗，實(shí)現(xiàn)了清潔生產(chǎn)。
本發(fā)明中，利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的具體反應(yīng)機(jī)理如下粘質(zhì)沙雷氏菌把蔗糖(SUC)分解成葡萄糖，葡萄糖作為唯一的碳源和能源物質(zhì)，通過糖酵解作用，葡萄糖代謝產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸是一種重要的中間代謝產(chǎn)物，一分子丙酮酸和焦磷酸硫胺素 (TPP)脫羧產(chǎn)生乙酰TPP，這個(gè)化合物與另一分子丙酮酸縮合形成乙酰乳酸，乙酰乳酸在乙酰乳酸羧化酶的作用下形成乙偶姻，最后在還原型輔酶(NADH)及2，3_ 丁二醇脫氫酶的作用下得到了 2，3_ 丁二醇，最后一步是可逆的。
本發(fā)明提供了一種循環(huán)利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的方法，包括(1)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-15% (優(yōu)選4-10%)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)30-50小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇產(chǎn)物； (2)從發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌；(3)將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在培養(yǎng)基中的OD值為20-80，發(fā)酵培養(yǎng)30-50小時(shí)，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇。 發(fā)酵液中的粘質(zhì)沙雷氏菌還可重復(fù)利用。
所述的回收的粘質(zhì)沙雷氏菌是指所述的粘質(zhì)沙雷氏菌已經(jīng)經(jīng)歷過至少一次(一個(gè)生產(chǎn)周期)的發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的反應(yīng)，其不同于種子菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式， 所述的回收的粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)歷過1-5次的發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的反應(yīng)；更佳的，所述的的回收的粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)歷過1-3次的發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的反應(yīng)。
從發(fā)酵終止后的發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌的方法是本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)，優(yōu)選通過離心并收集下層沉淀的方法從發(fā)酵液中分離回收粘質(zhì)沙雷氏菌。離心回收菌體的方法是本領(lǐng)域人員已知的，優(yōu)選的離心件如下4士2°C，10000士3000rpm，15_20min。離心獲得的菌體可直接用于下一次的發(fā)酵反應(yīng)，或者可在干燥后通過常規(guī)的菌體保存方法保存?zhèn)溆谩?br>本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，回收菌體在發(fā)酵時(shí)的用量不同于種子菌，在合適于發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的培養(yǎng)條件下，回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵系統(tǒng)中的加入量是一個(gè)較為關(guān)鍵的因素，直接關(guān)系到后續(xù)發(fā)酵過程中2，3-丁二醇的產(chǎn)量以及糖的轉(zhuǎn)化率。加入量過少可導(dǎo)致2，3-丁二醇的產(chǎn)量不高，而加入量過多不僅不能起到提高產(chǎn)量的目的、浪費(fèi)生物質(zhì)，而且還影響到反應(yīng)過程中的糖轉(zhuǎn)化率。因此，在向發(fā)酵液(或稱為培養(yǎng)基)加入回收菌體的時(shí)候，本發(fā)明中較佳地是使回收菌體在發(fā)酵液中的OD值為20-80 ；更佳地是使菌體在培養(yǎng)基中的OD值為20-70 ；進(jìn)一步更佳的是使OD值為20-50。加入的菌體量在本所述的OD值范圍內(nèi)，可獲得較好的2，3- 丁二醇產(chǎn)量，以及較高的糖轉(zhuǎn)化率，從而達(dá)到節(jié)能、高效生產(chǎn)的目的。
回收的粘質(zhì)沙雷氏菌可在發(fā)酵的初始階段加入，也可以在發(fā)酵進(jìn)行過程中補(bǔ)充加入。也即，可以先采用的常規(guī)的2，3_ 丁二醇生產(chǎn)方法進(jìn)行發(fā)酵(例如采用種子菌接種入發(fā)酵液中發(fā)酵)，在發(fā)酵過程中再將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵液中，以提高2，3- 丁二
醇的產(chǎn)量或糖轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了 1546小時(shí)后，將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵液中，可提高2，3_ 丁二醇的產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率。優(yōu)選地在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了 2016 小時(shí)后，將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵液中。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的2， 3-丁二醇的生產(chǎn)方法如下(a)將粘質(zhì)沙雷氏菌的種子菌以按照體積比3-10% (較佳的是按照體積比4-6% )的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(b)在發(fā)酵培養(yǎng)1516 小時(shí)后，將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在培養(yǎng)基中的OD值為20-80， 繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基的原料(如碳源、磷源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽、微量元素)及其使用量可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)利用粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇時(shí)所用的原料及使用量而定，只要所述的發(fā)酵培養(yǎng)基能夠?yàn)檎迟|(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)、代謝和生產(chǎn)提高足夠的營(yíng)養(yǎng)成分，且不帶來(lái)不良影響(如阻遏作用)或副作用(或產(chǎn)生副產(chǎn)物)。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，培養(yǎng)粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇所用的初始培養(yǎng)基含有蔗糖90士20g/L，蛋白胨20士5g/L，酵母粉5士2g/L，檸檬酸10士3g/L，MnSO4 0. 1 士0. 05g/L, KH2PO4 0. 5 士0. 2g/L, FeSO4 0. 02 士0. 005g/L, MgSO4 0. 5 士0. 2g/L。更佳地， 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還含有KAc6士2g/L ；NaN032士0. 5g/L。較佳地，述的發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 PH值是7 士 0.5。在發(fā)酵至6-12小時(shí)后，將PH維持在6 士 0.5?？刂婆囵B(yǎng)基中PH值的方法是本領(lǐng)域人員已知的，優(yōu)選地可采用溶液和NaOH溶液來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中PH值。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在發(fā)酵過程中，還向發(fā)酵系統(tǒng)中流加或批加蔗糖溶液，使發(fā)酵液中蔗糖量可足夠滿足發(fā)酵所需的碳源。蔗糖溶液的配制可以根據(jù)本領(lǐng)域人員已知的技術(shù)，優(yōu)選地使用45-55%的蔗糖溶液。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵溫度為28-32°C。
利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的其它條件，可采用本領(lǐng)域已知的條件。對(duì)于通氣量、攪拌速度等條件，本領(lǐng)域人員也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)以及發(fā)酵的規(guī)模來(lái)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兺ā?br>本發(fā)明中，發(fā)酵采用的菌體可以是本領(lǐng)域已知的多種粘質(zhì)沙雷氏菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)是編號(hào)為CICC10187的粘質(zhì)沙雷氏菌。
在發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后，還可包括步驟從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離或純化2，3- 丁二醇。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化2，3- 丁二醇可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分離純化技術(shù)。
本發(fā)明的方法的積極效果是
(1)本發(fā)明通過在發(fā)酵過程中重復(fù)利用粘質(zhì)沙雷氏菌，并且優(yōu)化了回收菌體的加入量以及加入時(shí)機(jī)，從而有效地提高了 2，3- 丁二醇的產(chǎn)量，轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)能力。
(2)本發(fā)明的循環(huán)利用方法是向發(fā)酵液中添加適量的回收的粘質(zhì)沙雷氏菌活菌體，這種方法與傳統(tǒng)的回收利用菌體的方法相比，減少了浪費(fèi)資源能源的破壁溶解、過濾、分離以及干燥等階段。
(3)本發(fā)明合理地利用了粘質(zhì)沙雷氏菌回收菌體，有效地解決了菌體污染和資源的回收利用問題，還減少了能源消耗，達(dá)到了節(jié)能減排的目的，從而實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1.粘質(zhì)沙雷氏菌的培養(yǎng)
所述的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)是由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的，編號(hào)為粘質(zhì)沙雷氏菌CICC10187。
(1)種子培養(yǎng)
將甘油管保藏的種子搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為M小時(shí)，12小時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)溫度為 30°C，190r/min。
培養(yǎng)基的組分和含量為(每升中含量)葡萄糖IOg;酵母粉Ig;蛋白胨2g; (NH4)2SO4 6g ；K2HPO4 IOg ；NaCl 0. 5g ；MgSO4 0. 5g ；滅菌后接種前以 NaOH 溶液調(diào) ρΗ6· 6。余量為水。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)
3. 7L生物反應(yīng)器培養(yǎng)將種子液以5% (體積比)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為(每升中含量)
蔗糖90g ；蛋白胨 20g ；酵母粉 5g ；檸檬酸 IOg ；MnSO4 0. Ig ；KH2PO4 0. 5g ；MgSO4 0. 5g ；FeSO4 0. 02g ；KAc6g ；NaNO3 2g ；以及余量的水；滅菌前以NaOH溶液調(diào)pH為7. 2。
發(fā)酵溫度30°C，通氣流量lvvm，氣壓0. 1-0. 2 ；轉(zhuǎn)速前Mi控制在450rpm，后每小時(shí)增加50轉(zhuǎn)，至IOh達(dá)到650rpm,維持到18h, 18h后每5h降低50rpm,降低到400rpm時(shí)維持至發(fā)酵結(jié)束。蔗糖濃度通過流加維持在足夠滿足菌株所需碳源；1 時(shí)補(bǔ)入適量的搖瓶菌體，pH在9h時(shí)調(diào)至6. 0-6. 5，通過H3PO4溶液和NaOH溶液維持pH在6. 0-6. 5 ；發(fā)酵罐起始裝液量為3. 7L發(fā)酵罐裝發(fā)酵液1. 8L。發(fā)酵40小時(shí)結(jié)束。
(3)回收菌體
在發(fā)酵結(jié)束后，在從發(fā)酵液中分離2，3_ 丁二醇產(chǎn)物后，通過離心的方法從發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌。離心條件如下4°C，10000rpm，15-20min。
實(shí)施例2.菌體回收利用的可行性分析及加入發(fā)酵回收菌體的量的優(yōu)化
通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，空白發(fā)酵液中接入3. 7L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的發(fā)酵末期的活菌體(即回收菌體)，研究發(fā)酵過程中接入不同量的回收菌體之間，以及與對(duì)照組(不加入回收菌體)之間發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量(g/Ι)、蔗糖的利用率(g/g)以及產(chǎn)物的產(chǎn)率(g/l*h)是否有明顯差異，并且考查加入不同菌體量對(duì)各指標(biāo)的影響。
實(shí)驗(yàn)材料[0081](1)種子培養(yǎng)基(每升中含量)葡萄糖10g，酵母粉lg，蛋白胨2g，(NH4)2SO4 6g， KH2PO4 10g, NaClO. 5g, MgSO4 0. 5g。余量為水。
(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(每升中含量)蔗糖90g，蛋白胨20g，酵母粉5g，檸檬酸10g， MnSO4 0. lg, KH2PO4 0. 5g, FeSO4 0. 02g, MgSO4O. 5g。余量為水。
實(shí)驗(yàn)方法
搖瓶中接入40h3. 7L生物反應(yīng)器發(fā)酵末期通過離心獲取的回收活菌體，對(duì)照組為正常接入5%的活化兩次的種子液，初始OD值具體如下表1 :
表 1
0組(對(duì)照組)1組2組3組OD1. 2835. 575. 2165. 1
發(fā)酵條件如下
發(fā)酵溫度30°C，190r/min，發(fā)酵過程中后期以50%的蔗糖水溶液補(bǔ)料，使發(fā)酵液中蔗糖的濃度控制在足夠滿足菌株所需，在發(fā)酵初始按照上表所述加入回收活菌體或種子菌，pH在9h時(shí)調(diào)至6. 0-6. 5，通過H2SO4溶液和NaOH溶液維持pH在6. 0-6. 5 ；搖瓶的裝液量為500ml三角瓶裝50ml發(fā)酵液。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析
1. OD 分析
對(duì)照組0組的OD值符合微生物生長(zhǎng)的規(guī)律，1組、2組加入的菌體后OD值分別為 35. 5和75. 2，其OD下降緩慢，3組加入菌體后的OD值為165. 1，其OD下降比較明顯，如圖 1。
2. BD產(chǎn)量比較
加了菌體的1組、2組和3組的BD產(chǎn)量比對(duì)照組0組有明顯提高，但是1組、2組和3組在發(fā)酵末期36h時(shí)，BD產(chǎn)量分別為108. lg/l、118. 3g/l和115. lg/1，其差異不明顯； 而此三組加入活菌體后的OD值梯度很大，分別為35. 5、75. 2和165. 1，這說明并不是加入的菌體越多，BD的產(chǎn)量越好，如圖2所示。
3.產(chǎn)物的產(chǎn)率(g/l*h)比較
BD/T (g/l*h) = BD 產(chǎn)量(g/1) / 時(shí)間(h)。
加入離心活菌體的三組比對(duì)照組的產(chǎn)物產(chǎn)率有明顯提高，但是發(fā)酵末期時(shí)三組產(chǎn)物產(chǎn)率差異不大，如圖3所示。
4.蔗糖的利用率比較
耗糖量(g/1)=原發(fā)酵液含糖量(g/1) +補(bǔ)糖量(g/1)-殘?zhí)橇?g/1)；
BD/ 糖耗(g/g) = BD 產(chǎn)量(g/1) / 糖耗量(g/1)；
加入離心活菌體的三組比對(duì)照組的蔗糖的利用率有明顯提高，1組和2組在發(fā)酵末期的蔗糖的利用率最高，如圖4所示。
5.綜合分析
綜合上述分析，1組、2組和3組加入離心活菌體后的OD值分別為35. 5,75. 2和 165. 1，比對(duì)照組0組的最大OD值(15. 4)有明顯提高；在發(fā)酵末期3 時(shí)，1組、2組和3組的BD產(chǎn)量(g/Ι)、產(chǎn)物產(chǎn)率(g/l*h)差異不明顯，而1組、2組的蔗糖的利用率(g/g)比3 組高，由此說明，并不是加入的回收菌體越多越好，加入OD值在20-80較佳。[0103]實(shí)施例3.回收菌體加入時(shí)機(jī)的比較
通過搖床實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液在不同發(fā)酵時(shí)期接入活菌體，比較各組之間發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量(g/υ、蔗糖的利用率(g/g)、產(chǎn)物的產(chǎn)率(g/i*h)是否有明顯差異，并在幾組之中確定接入活菌體的最佳時(shí)期。
實(shí)驗(yàn)材料
(1)種子培養(yǎng)基(每升中含量)葡萄糖10g，酵母粉lg，蛋白胨2g，(NH4)2SO4Bg, KH2PO4 10g, NaCl 0. 5g, MgSO4 0. 5g。余量為水。
(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(每升中含量)蔗糖90g，蛋白胨20g，酵母粉5g，檸檬酸10g， MnSO4 0. lg, KH2PO4 0. 5g, FeSO4 0. 02g, MgSO4 0. 5g。余量為水。
實(shí)驗(yàn)方法
1組、2組、3組、4組分別為發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵Oh時(shí)、6h時(shí)、1 時(shí)和24h時(shí)接入回收菌體，檢測(cè)各組的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量(g/Ι)、蔗糖的利用率(g/g)以及產(chǎn)物的產(chǎn)率(g/i*h)。
實(shí)驗(yàn)步驟
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入菌體，具體如下表2
表2
權(quán)利要求
1.一種利用粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)生產(chǎn)2，3_丁二醇的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng) 30-50小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇產(chǎn)物；(2)從發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌；(3)將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在培養(yǎng)基中的OD值為20-80， 發(fā)酵培養(yǎng)30-50小時(shí)，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，使粘質(zhì)沙雷氏菌在培養(yǎng)基中的OD值為30-70。
3.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述的回收粘質(zhì)沙雷氏菌是通過離心的方法從發(fā)酵液中分離獲得。
4.如權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于，離心的條件如下4士2°C，10000士3000rpm， 15_20min。
5.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)后面還包括重復(fù)步驟(2)-(3) 1-5次。
6.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有蔗糖 90 士 20g/L，蛋白胨 20 士 5g/L，酵母粉 5 士 2g/L，檸檬酸 10 士 3g/L，MnSO4 0. 1 士0. 05g/L, KH2PO4 0. 5 士0. 2g/L, FeSO4 0. 02 士0. 005g/L, MgSO4 0. 5 士0. 2g/L。
7.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還含有KAc6士2g/L; NaNO3 2 士 0.5g/L。
8.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵溫度為^_32°C。
9.一種利用粘質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng) 30-50小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲2，3- 丁二醇產(chǎn)物；(b)從發(fā)酵液中回收粘質(zhì)沙雷氏菌；(c)將粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌按照體積比3-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)至15-26小時(shí)，將(b)回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在培養(yǎng)基中的OD 值為20-80，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4-25小時(shí)，得到含有2，3- 丁二醇的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離收獲 2，3-丁二醇產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，在發(fā)酵培養(yǎng)20-25小時(shí)后， 將(b)回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
11.如權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，在步驟(C)后面還包括重復(fù)步驟(b)_(c) 1-5次。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種2，3-丁二醇生產(chǎn)過程與微生物生物質(zhì)循環(huán)利用的集成化方法，包括用粘質(zhì)沙雷氏菌種子菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇；將回收的粘質(zhì)沙雷氏菌加入到第二次發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中再次進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵產(chǎn)物中的粘質(zhì)沙雷氏菌還可被重復(fù)利用。采用本發(fā)明的方法，不僅提高了2，3-丁二醇的產(chǎn)量，轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)能力，還有效解決了菌體污染和資源的回收利用問題，可以節(jié)能減排。
文檔編號(hào)C12P7/18GKCN101402973 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810202808
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2008年11月17日
發(fā)明者周文瑜, 孫建安, 孫金杰, 張燎原, 楊云龍, 沈亞領(lǐng), 胡媛, 魏東芝, 鮑杰 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),