專利名稱:以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術領域：
的細胞擴增方法，特別的是一種以rhDSL重組 蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法。
背景技術：
iS^jft,l&ik^MM^M (Haematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 已成為治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤、實體瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病及某些基因缺陷疾病的重要手 段之一。造血干細胞主要來源于骨髓、臍帶血及動員后的外周血。盡管與其他來源的干細 胞相比，臍血干細胞具有來源豐富、抗原性弱、移植后并發(fā)癥少等優(yōu)點，但又存在數(shù)量不足 的缺陷，造成了成人移植的限制。為得到治療所需的細胞數(shù)量，研究人員試圖通過不同手 段對HS/PCs進行規(guī)模化擴增。但是目前常用的方法擴增HS/PCs (Haematopoietic Stem/ ProgenitorCells)的效率十分有限，而且HS/PCs在體外擴增的過程中自我更新能力下降 并顯示出分化的特征，導致其歸巢和長期造血重建能力的降低，所以從根本上解決HSCT面 臨的供體嚴重短缺已成為亟待解決的問題。
Notch信號傳導通路廣泛存在于脊椎和非脊椎動物中，是影響細胞決定的重要通 路之一，在進化上具有高度的保守性。Notch信號傳導通路由Notch受體、配體及其下游的 信號傳導共同組成。相鄰細胞間通過Notch受體傳遞信號可以調(diào)節(jié)包括干細胞在內(nèi)的多種 細胞的分化、增殖和凋亡，影響器官形成和形態(tài)發(fā)生。
干細胞是一類具有自我更新(self-renewing)和多向分化潛能的細胞，能夠產(chǎn)生 高度分化的功能細胞。Notch信號對多潛能干細胞的定向分化和自身復制具有決定性的調(diào) 控作用。以干細胞為中心的再生醫(yī)學是用功能正常的細胞或組織替代功能減退或受損的 細胞組織，將定向分化后的細胞用于治療阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病、白血病等疾病， Notch信號傳導通路通過調(diào)節(jié)干細胞的分化增殖將在這一領域中發(fā)揮重要作用。在少數(shù)情 況下，例如神經(jīng)干細胞向星形膠質細胞分化的過程中，Notch信號傳導通路具有促進分化作 用。對于其它多種干細胞而言，當Notch受體與其配體結合時，干細胞進行非分化性增殖； 而當Notch信號活性被抑制時，干細胞進入分化程序，發(fā)育為功能細胞，Notch信號傳導通 路目前被認為是解決干細胞擴增的最有前途的研究方向之一。目前，Notch信號傳導通路在 干細胞再生醫(yī)學中的應用主要集中在通過活化Notch信號通路進行干細胞的體外擴增培 養(yǎng)。在干細胞培養(yǎng)過程中，活化Notch信號傳導途徑可以調(diào)控其增殖分化從而服務于以干 細胞生物治療和組織工程，其策略主要是在含有可溶性配體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干/祖細胞、 或者將配體結合于固相表面以模擬體內(nèi)配體的跨膜結構來培養(yǎng)干/祖細胞。由于每一種 類型的細胞需要與其相適應的含有適量細胞因子和生長因子的獨特培養(yǎng)條件，所以通過激 活Notch通路來維持干細胞的培養(yǎng)和進行組織工程的研究還存在一些困難，盡管如此，在 造血干細胞的培養(yǎng)中，通過激活Notch通路來維持干細胞的自我更新已經(jīng)取得了一定的進 展。魯茁壯等(中國實驗血液學雜志，2003，11 (3) :222 226)克隆表達了人Notch配體 Delta-likel(hDlll)的胞外區(qū)(hDlI-Iext)，并經(jīng)集落培養(yǎng)檢測證實其對原始的造血祖細胞
4具有擴增作用。Han等(Blood，2000，95 (5) :1616 1625)構建了來自于人hDlll的可溶 性重組蛋白hDlll·、由DSL結構域及N-端序列構成)，經(jīng)小鼠細胞體外實驗證實，在聯(lián)合 其它細胞因子的情況下，可以抑制造血干細胞的分化并促進其增殖。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人的 Notch 配體有 Jaggedl、Jagged2、DeltaU Delta3、Delta4。 Notch配體的胞外區(qū)含有數(shù)量不等的EGF樣重復序列以及N端保守的DSL (Delta/Serrate/ Lag2)結構域，該DSL結構域在結合與活化Notch受體的過程中起關鍵作用。來自于野 生Notch配體的重組蛋白或者多肽被認為是有效的Notch激活劑。體外實驗已經(jīng)證明，從 JaggedUDeltal中衍生而來的重組蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K, et al. J Biol Chem,1999,274(46) :32961 32969)。
經(jīng)對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利公開號為CN101096654A，發(fā)明名稱為 “以GST-hDSL重組蛋白增殖人造血干細胞及祖細胞的方法”，該專利提及的方法步驟為 "(1)從髓、外周血或臍帶血中取樣，用密度梯度離心分離出單核細胞，然后用CD34分離試 劑盒對CD34細胞進行標記，采用免疫磁珠技術對CD34細胞進行純化，得到CD34+細胞；(2) 采用含10% -20%胎?；蛉搜宓募毎囵B(yǎng)基對上述CD34+細胞進行培養(yǎng)，加入細胞因子， 加入蛋白，培養(yǎng)1周，換入細胞培養(yǎng)基，并重新加入蛋白再繼續(xù)培養(yǎng)擴增1周，得到增殖了的 造血干細胞、祖細胞。，，該發(fā)明中使用的GST-hDSL相對本發(fā)明中的rhDSL重組蛋白，分子量 大、結構復雜，不利于相關實驗操作中的使。且該發(fā)明中對造血干/祖細胞的擴增時間為一 周，擴增時間過長，可能影響了造血干/祖細胞的分化潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種以rhDSL重組蛋白擴增造血干 細胞及祖細胞的方法，首次將rhDSL運用于人臍血干細胞及祖細胞的擴增，并提供優(yōu)化了 的擴增條件，為Notch信號傳導通路在造血干細胞體外擴增中的應用和發(fā)展提供了實驗基 石出。
本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟
第一步，rhDSL重組蛋白的制備首先構建rhDSL的重組表達質粒pQE30_hDSL，然 后以大腸桿菌DH5ci為宿主表達rhDSL，并采用Q S印harose陰離子交換層析與金屬離子 Ni2+親和層析相結合的純化方法進行rhDSL重組蛋白的純化，得到rhDSL重組蛋白。
所述rhDSL重組蛋白，為含有6 XHis (組氨酸)標簽的Notch配體Delta-Iike-I 的衍生多肽。
所述的衍生多肽，由含有進化中的保守結構區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個氨 基酸構成，共99個氨基酸，其氨基酸序列為LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHS SGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。
所述構建rhDSL的重組表達質粒pQE30_hDSL，是指以重組質粒pGEX_2T/ hDSL (林小娟等，現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8 (4) 612)為模板，PCR的方法擴增hDSL基因片 段，包括進化中的保守結構區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸，共99個氨基酸，共 298bp。割膠回收后的PCR目的產(chǎn)物和原核表達質粒pQE30(含6XHis標簽)經(jīng)限制性內(nèi) 切酶HindIILBamH I雙酶切。連接割膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物轉化到預先制備 的DH5ci感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆，經(jīng)測序證實無突變且讀框正確。(以上為常規(guī)技術和條件，可以重復實施)
所述以大腸桿菌DH5 α為宿主表達rhDSL重組蛋白，是指挑取轉化有 pQE30-hDSL質粒的DH5a的單菌落，25 30mL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp)，37°C振蕩培 養(yǎng)過夜；次日將過夜菌液按2%的接種量轉接到IL 2L的LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL Amp) 內(nèi)，轉接后37°C培養(yǎng)2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的時候停止培養(yǎng)，加入IPTG 至終濃度為ImM，誘導表達4h，收集菌體。
所述rhDSL重組蛋白的純化，是指收集的菌體經(jīng)超聲裂解和溶菌酶裂解細菌后， 高速離心，收集沉淀包涵體(表達產(chǎn)物以包涵體形式存在)。包涵體經(jīng)8M尿素變性后，用稀 釋法緩慢復性。取復性后的上清液經(jīng)Q Sepharose陰離子交換層析，得到初步純化的rhDSL 重組蛋白。將陰離子交換層析后所得蛋白溶液進一步通過金屬離子(Ni2+)親和層析并透 析，得到高純度(純度>99%)低內(nèi)毒素含量(鱟試劑測定內(nèi)毒素含量為0. 117EU/yg)的 rhDSL重組蛋白。
第二步，在HS/PCs體外培養(yǎng)體系中加入rhDSL重組蛋白及早期造血因子，采用這 兩者結合擴增造血干細胞和祖細胞。
所述rhDSL重組蛋白通過Notch信號傳導通路促進造血干細胞和祖細胞的擴增。
所述rhDSL重組蛋白擴增濃度為0. 5 μ g/ml 4. 5 μ g/mL·
所述rhDSL重組蛋白最佳擴增濃度為1. 5 μ g/mL·
所述早期造血因子為干細胞因子，濃度為20ng/ml。
所述rhDSL重組蛋白及早期造血因子的結合擴增造血干細胞和祖細胞的時間為 0 7天。
所述rhDSL重組蛋白及早期造血因子的結合擴增造血干細胞和祖細胞的最佳時 間為2. 5天。
本發(fā)明所述rhDSL重組蛋白衍生于Notch配體Delta-like-1，包括進化中的保守 結構區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸。通過與早期造血因子相結合，所述rhDSL 重組蛋白，經(jīng)體外檢測細胞計數(shù)、⑶34及⑶38表面抗原的檢測、集落形成實驗包括總CFU、 HPP-CFU、GM-CFU 計數(shù)以及進一步的連續(xù)稀釋擴增(sequential dilution expansion)檢 測證明，具有造血干/祖細胞的擴增特性。
在HS/PCs體外培養(yǎng)體系(DMEM/F-12，15% FBS)中加入rhDSL和/或KL，在分別 培養(yǎng)了 2. 5天、4. 5天、6. 5天后，對細胞進行顯微鏡計數(shù)、集落培養(yǎng)、⑶34+檢測，比較不同組 之間的結果差異。結果表明，與單加KL相比，rhDSL與KL聯(lián)合作用明顯使HS/PCs數(shù)量得到 了擴增，該擴增作用具有時間及劑量依賴性，1. 5 μ g/ml的rhDSL的擴增效果較好，培養(yǎng)2. 5 天的擴增效果為最佳(見表1)。選擇最佳的培養(yǎng)時間，對擴增后的細胞進行連續(xù)稀釋擴增 (sequential dilutionexpansion)，進一步檢測造血干/祖細胞經(jīng)藥物作用后分化潛能的 維持狀況。結果表明，rhDSL實驗組細胞在除去藥物后細胞的分化潛能較高。
本發(fā)明中rhDSL的運用可有效擴增HS/PCs數(shù)量并維持其分化增殖的潛能。相對其 他文獻報道的Notch配體固定化擴增HS/PCs的方法，rhDSL可以可溶形式直接進行HS/PCs 的擴增培養(yǎng)，具有方法簡便易行，成本較低的特點。同時，rhDSL的分子量遠低于另一可溶 形式的重組蛋白GST-hDSL，大大降低了擴增中使用的藥物劑量，節(jié)約成本。對于通過Notch 信號傳導通路解決臨床HSCT所面臨的細胞數(shù)量不足，rhDSL提供了一種新的選擇。


圖1為本發(fā)明實施例中rhDSL重組蛋白的純化示意圖；
其中
(A)Q Sepharose FF陰離子交換純化rhDSL。M 蛋白標志物；1 洗脫液；
(B)離子交換層析后rhDSL的親和純化M 蛋白標志物；1 洗脫液；
(C)陰離子交換層析與親和層析純化后蛋白的銀染檢測M 蛋白標志物；1 純化 后的rhDSL。
圖2為連續(xù)稀釋擴增法測定擴增后細胞的分化潛能示意圖；
其中臍血來源的⑶34+細胞分四組經(jīng)不同濃度rhDSL進行擴增培養(yǎng)，分組 為(l)KL(20ng/ml)(對照組)，(2) KL (20ng/ml) +rhDSL (0. 5 μ g/ml), (3)KL(20ng/ ml)+rhDSL(l. 5μ g/ml)，(4) KL (20ng/ml) +rhDSL (4. 5 μ g/ml)。2. 5 天后，以連續(xù)稀釋擴增 法測定擴增后細胞的分化潛能，即將藥物洗去，繼續(xù)以KL，ΤΡ0, FL, IL-3(濃度均為IOng/ mL)進行長期液體培養(yǎng)，其間每隔7天進行細胞計數(shù)、集落形成細胞包括總CFU、HPP-CFU、 GM-CFU計數(shù)，計算相應細胞對于0天未擴增前的擴增倍數(shù)。A 細胞數(shù)；B :總CFU ；C HPP-CFU ；D :GM-CFU。
具體實施方式
下面結合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前 提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下 述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，所用的試劑均 可以在市場上購買。
設備和試劑[0034]1FACSCalibur (流式細胞儀)美國 Becton Dickinson(BD)公司[0035]2MiniMACSTM細胞分選器/MACS分選架德國美天旎生物技術有限公司[0036]3蛋白純化分析儀(AKTA PURIFIER-10)，pharmacia公司產(chǎn)品[0037]4超聲波細胞粉碎儀(Sonipr印150)，三洋公司產(chǎn)品[0038]5核酸蛋白電泳儀(Power pac Basic)，Bio-Rad公司產(chǎn)品[0039]6凝膠圖像處理系統(tǒng)(TanonGIS-2008)，上海天能科技有限公司[0040]7原核表達載體PQE30，Qiagene[0041]8限制性內(nèi)切酶 BamH I、HindIII，IOXBuffer (酶切)，T4DNA 連接酶，10XT4DNA
Ligase Buffer, Ferments 公司產(chǎn)品
9. 10 X PCR Buffer,Mg2+ (25mM)，dNTP (2mM)，Tag DNA 聚合酶，上海生工生物工程技 術服務有限公司產(chǎn)品
10.試劑盒華舜小量PCR產(chǎn)物純化試劑盒；天為時代瓊脂糖凝膠DNA回收試劑 盒；V-gene日常型質粒DNA小量快速制備試劑盒；
11.Q Sepharose Fast Flow, Amersham 產(chǎn)品
12. HIS-Select Nickel Affinity Gel，Sigma 產(chǎn)品
13.臍血樣品上海市國際和平婦幼保健院，自愿者捐贈的健康足月分娩兒臍血，枸櫞酸鈉抗凝
14. Ficoll分離液分離臍血，密度1. 077士0. 002g/mL，上海華精生物高科技有限 公司
15. DMEM/F-12(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium/Nutrient F-12Ham' s, 1: IMixture)，SIGMA 公司產(chǎn)品
16.甲基纖維素(Methyl Cellulose, MC)美國 SIGMA 公司產(chǎn)品
17. IMDM(Iscove' s Modified Dulbcco' s Medium)美國 GIBCO 公司產(chǎn)
18.胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)美國 HyClone 公司
19.細胞因子 FL、TPO、IL-3、FcR-blocking Reagent、CDlIb-PE, CD14-PE 美國 eBioscience 公司
20. EPO 益比奧重組人紅細胞生成素注射液，10000U/瓶，沈陽三生制藥股份有限 公司
21. GM-CSF 特爾立注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，1 X 150 μ g，廈門 特寶生物工程股份有限公司
22.抗體 IgG-PE/FITC (陰性對照)、CDIM-FITC、CD38-PE =Caltag
23. PI (Propidium Iodicle，碘化丙錠)=Sino-American Biotec
24. Bufferl :PBS/2% FBS orO. 5% BSA(CD marker 緩沖液 / 溶解細胞因子)
i. Buffer2 :PBS/2% FBS/2 μ g/mL PI (CD marker 染液)
ii. Buffer3 :PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA(磁性分選緩沖液)
25.雙抗(加于培養(yǎng)基)100U/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素 實施例IrhDSL重組蛋白的制備
以克隆質粒pGEX_2T/hDSL為模板，通過PCR方法擴增目的片段hDSL。割膠回收后 的PCR目的產(chǎn)物和原核表達質粒PQE30經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII、BamH I雙酶切。連接割 膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物轉化到預先制備的DH5 α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克 隆，經(jīng)測序證實無突變且讀框正確。(以上為常規(guī)技術和條件)
挑取轉化有pQE30_hDSL質粒的DH5a的單菌落，25 30mL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/ mL Amp)，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；次日將過夜菌液按2%的接種量轉接到IL 2L的LB培養(yǎng)基 (含100 μ g/mL Amp)內(nèi)，轉接后37°C培養(yǎng)2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的時候 停止培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為ImM，誘導表達4h，收集菌體。用30mL預冷1 XPBS洗滌菌 體。收集的菌體用 30mL 預冷 Sonicatebuffer (PBS，ImM EDTA, 5mM DTT, 0. ImM PMSF，pH7. 3) 重懸，經(jīng)超聲裂解(中等程度超聲，每次超聲30sec、停30sec，共20次)和溶菌酶(100 μ g/ mL)裂解細菌后，高速離心，收集沉淀包涵體。每g包涵體用18mL Pellet Wash Buffer (PBS, 1% Triton X-100，IOmM EDTA, 50mM NaCl，100 μ M PMSF，pH7. 3)洗滌 3 次。
洗滌后的包涵體用Buffer/Urea (8M urea, 50mM Tri s_HCl，lmM EDTA, 50mM NaCl， 0. ImM PMSF，pH8. 5)變性，離心取上清。將上清緩慢滴加到10倍體積的復性液Alkaline Buffer A(50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF,pH10. 7)內(nèi)，Alkaline Buffer A(50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF, pHlO. 7)內(nèi)，再將復性液同體積的稀釋液(20mM Tris_HCl，0. ImM PMSF, ρΗ8. 0)緩慢 加入復性蛋白液中。
用Wash Buffe (20mM Tris_HCl，pH9. 1)平衡后的Q S印harose 陰離子柱后，將復性后的上清過柱純化，用elution buffer (20mM Tris_HCl，lM NaCl，pH9. 1)梯度洗脫，得到初 步純化的 rhDSL 重組蛋白。用 IXHis-Tag BindingBuffer(0. 05M imidazole，0. 5M NaCl, 20mM Tris, pH8. 5)平衡金屬離子(Ni2+)，將陰離子交換層析后所得蛋白溶液過柱純化，用 IXHis-Tag ElutionBuffer (0. 2M imidazole，0. 5M NaCl, 20mM Tris, ρΗ8· 5)洗脫目的蛋 白，得到高純度(純度>99 % )的rhDSL重組蛋白。
如圖1所示。(A)為Q Sepharose FF陰離子交換純化后的結果，可見純化后的蛋白 液中含有雜蛋白。(B)為離子交換層析后再經(jīng)親和純化的結果，可見rhDSL純度較高，未見 雜蛋白。(C)為陰離子交換層析與親和層析純化后蛋白的銀染檢測，蛋白上樣量為lOOng， 未見雜帶。因銀染檢測蛋白的靈敏度為0. 3ng,因此純化后rhDSL重組蛋白的純度>99%。
實施例2臍血單個核細胞(mono-nuclear cells, MNC)的獲取和⑶34+細胞的分 離純化
臍血樣品，用枸櫞酸鈉抗凝，采取Ficoll分離液分離臍血，獲得臍血單個核細胞 (許文榮，胡嘉波，顧可梁，等.臍血造血干/祖細胞的密度分離實驗研究[J].臨床檢驗 雜志· 2001，19(2) :73-76)。按300 μ L/108細胞的量加入Buffer3，重新懸浮細胞后待用。 Buffer3 :PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA(磁性分選緩沖液)
⑶34+細胞的分選步驟
(1)免疫磁珠標記
加入FcR-blocking Reagent (100 μ L/108 細胞)，輕柔混勻，再加入抗 CD34+ 磁珠 (100μ L/108細胞)，輕柔充分混勻，4°C冰箱孵育30min，期間每隔IOmin取出，手動輕柔振 蕩使磁珠與細胞充分接觸；
(2) MS+分離柱的準備
將MiniMACS磁鐵用酒精消毒，連接到MiniMACS架子上，將MS+分離柱放入 MiniMACS磁鐵中，柱下接一 15mL無菌離心管。分離細胞前在柱頂上加入500 μ L buffer3 潤洗柱子；
(3) MS+分離柱陽性分選
將標記好的細胞懸液加到柱上，收集的流出物為陰性成分，用bufferf洗滌分離 柱3次，每次500 μ L。加ImL buffer3于分離柱中，將其取下，置于一新的15mL無菌離心管 上，用活塞將⑶34+細胞洗脫；
(4)第二次過柱分選
為了提高CD34+細胞的純度，可進行第二次過柱，重復實驗步驟(3)；
(5)收集到的細胞用DMEM/F-12培養(yǎng)基(含15% FBS,雙抗)，懸浮混勻，計數(shù)并離 心(2000rpm,IOmin)；
(6)去除上清，加入一定量DMEM/F_12(含15% FBS，雙抗)培養(yǎng)基重懸，取出部分 細胞用于純度測定，其余按實驗需要加入藥物或細胞因子進行分組培養(yǎng)。
實施例3流式測定表面標志的表達(⑶34/⑶38)——樣品處理
(1)按彡2X IO4的量吸取細胞懸液于1. 5mL離心管，室溫離心(2000rpm, IOmin)；
(2)吸去上清，100 μ L bufferl 重懸，加入 2 μ L FcR-blocking Reagent,輕柔混 勻；
(3)分別加入 2 μ L IgG-FITC Isotype Control、CD34-FITC 或 IgG-PE
9[0084]Isotype Control、CD34-PE ；
(4) 4°C避光孵育 3Omin ；
(5)取出，加入 ImL bufferl 洗滌一遍(2000rpm，IOmin)；
(6)加入300 μ L bufferl重懸細胞，移入流式管；
(7)4°C保存，當天進行檢測。
實施例4rhDSL對臍血干/祖細胞擴增作用的條件優(yōu)化
此次實驗分為四組，對實施例2得到的⑶34+細胞進行短期擴增培養(yǎng)。四組分 別是(l)KL(20ng/ml)(對照組)，(2) KL (20ng/ml) +rhDSL (0. 5 μ g/ml), (3)KL(20ng/ ml)+rhDSL(l. 5μ g/ml), (4) KL (20ng/ml) +rhDSL (4. 5 μ g/ml).采用 24 孔培養(yǎng)板，每孔添 加培養(yǎng)基15% FBS的DMEM/F-12，另外附加各種細胞因子或藥物溶液，終體積為lmL，細胞 密度為8. 5X 104/mL。置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱，全濕條件下培養(yǎng)。第一輪分別培養(yǎng)2. 5天、 4. 5天、6. 5天后，收集各孔細胞進行顯微鏡計數(shù)、集落培養(yǎng)及流式細胞儀檢測⑶34、⑶38 抗原表達等各項指標，計算相應細胞對于0天未擴增前的擴增倍數(shù)。集落培養(yǎng)第0天將 磁柱分離后的CD34+細胞2X IO3鋪于MC培養(yǎng)基中，加入細胞因子KL(50ng/l. 5mL MC)， IL-3(10ng/l. 5mL MC)，GM-CSF(10ng/l. 5mL MC)，EP0(3U/1.5mL MC)。37°C，5% CO2，全濕 條件下培養(yǎng)，14天后進行集落的計數(shù)。實結果如表1所示。
2. 5天時，與對照組相比，rhDSL (1. 5 μ g/ml)組總細胞數(shù)及⑶34+細胞數(shù)分別顯著 性擴增1. 57及1. 68倍，總CFU、HPP-CFU及GM-CFU也分別顯著性擴增1. 31、1. 79及1. 39 倍。4. 5 天后，rhDSL (1. 5 μ g/ml)組總細胞、CD34+ 細胞數(shù)、總 CFU、HPP-CFU 及 GM-CFU 較 對照組也有顯著性增加。6. 5天時，rhDSL組總細胞、⑶34+細胞數(shù)較對照組減少。各組 ⑶34+CD38_細胞數(shù)與對照組相比無顯著性變化，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，⑶34+CD38_細胞 數(shù)呈降低趨勢，說明延長培養(yǎng)時間增加了造血干/祖細胞的分化。因此，確定2. 5天是最佳 培養(yǎng)條件。
表1造血干/祖細胞擴增效率
權利要求
1. 一種以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，rhDSL重組蛋白的制備首先構建rhDSL的重組表達質粒pQE30_hDSL，挑取轉 化有pQE30-hDSL質粒的DH5 α的單菌落，25 30mL含100 μ g/mLAmp的LB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜；次日將過夜菌液按2%的接種量轉接到IL 2L的含100 μ g/mL Amp的LB 培養(yǎng)基內(nèi)，轉接后37 °C培養(yǎng)2. 5 3. Oh左右，待0D600 = 0. 6 0. 8的時候停止培養(yǎng)，加 入IPTG至終濃度為ImM，誘導表達4h，收集菌體，用30mL預冷1 XPBS洗滌菌體，收集的菌 體用30mL預冷Sonicate buffer重懸，經(jīng)超聲裂解和100 μ g/mL的溶菌酶裂解細菌后，高 速離心，收集沉淀包涵體，每克包涵體用18mL Pellet Wash Buffer洗滌3次；洗滌后的包涵體用Buffer/Urea變性，離心取上清，將上清緩慢滴加到10倍體積的復 性液Alkaline Buffer A內(nèi)，再將復性液同體積的稀釋液緩慢加入復性蛋白液中；用Wash Buffer平衡Q S印harose陰離子柱后，將復性后的上清過柱純化，用elution buffer梯度洗脫，得到初步純化的rhDSL重組蛋白，之后采用金屬離子Ni2+親和層析純化， 用IXHis-Tag Binding Buffer平衡金屬離子Ni2+，將陰離子交換層析后所得蛋白溶液過 柱純化，用IXHis-Tag Elution Buffer洗脫目的蛋白，得到純度> 99%的rhDSL重組蛋 白；所述構建rhDSL的重組表達質粒pQE30-hDSL是指以重組質粒pGEX_2T/hDSL為模板， PCR的方法擴增hDSL基因片段，包括進化中的保守結構區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個 氨基酸，共99個氨基酸，共298bp，割膠回收后的PCR目的產(chǎn)物和含6 XHis標簽的原核表達 質粒pQE30經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hindlll、BamH I雙酶切，連接割膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連 接產(chǎn)物轉化到預先制備的DH5 α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆，經(jīng)測序證實無突變且讀框 正確；所述的rhDSL重組蛋白為含有6XHis標簽的Notch配體Delta-Iike-I的衍生多肽， 所述的衍生多肽由含有進化中的保守結構區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸構成， 共 99 個氨基酸，其氨基酸序列為LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYS YRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI ；所述的 Sonicate buffer 為含 ImM EDTA, 5mM DTT，0. ImM PMSF, ρΗ7· 3 的 PBS ； 所述的超聲裂解為中等程度超聲，每次超聲30sec、停30sec，共20次； 所述的 Pellet Wash Buffer 為含 1 % Triton X-100, IOmM EDTA, 50mMNaCl, 100 μ M PMSF, ρΗ 7. 3 的 PBS ；所述的 Buffer/Urea 為 8Μ urea, 50mMTris-HCl, ImM EDTA, 50mMNaCl, 0. ImM PMSF, pH8. 5 ；所述的復性液 Alkaline Buffer A 為 50mM NaH2PO4,0. ImM PMSF, pHlO. 7 ；所述的稀釋液為 20mM Tris-HCl，0. ImM PMSF, pH 8. 0 ；所述的 Wash Buffer 為 20mMTris_HCl，pH 9. 1 ；所述的 elution buffer 為 20mM Tris-HCl, IM NaCl，pH 9. 1 ；所述的 IXHis-Tag Binding Buffer 為 0· 05M imidazole，0· 5M NaCl, 20mMTris, ρΗ8· 5 ；所述的 IXHis-Tag Elution Buffer 為 0· 2M imidazole，0· 5M NaCl, 20mMTris, pH`8. 5 ；第二步，在HS/PCs體外培養(yǎng)體系中加入上述制備的rhDSL重組蛋白及早期造血因子， 采用這兩者結合擴增造血干細胞和祖細胞。
2.根據(jù)權利要求
1所述的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其特征 是，所述的rhDSL重組蛋白擴增濃度為0. 5 μ g/ml 4. 5 μ g/ml。
3.根據(jù)權利要求
1或2所述的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其 特征是，所述的rhDSL重組蛋白擴增濃度為1. 5 μ g/ml。
4.根據(jù)權利要求
1所述的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其特征 是，所述的早期造血因子的濃度為10ng/ml-30ng/ml。
5.根據(jù)權利要求
1或4所述的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其 特征是，所述的早期造血因子為干細胞因子，濃度為20ng/ml。
6.根據(jù)權利要求
1所述的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其特征 是，所述的結合擴增造血干細胞和祖細胞的時間為0 7天。
7.根據(jù)權利要求
1或6所述的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，其 特征是，所述的rhDSL重組蛋白及早期造血因子的結合擴增造血干細胞和祖細胞的時間為 2. 5 天。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程領域的以rhDSL重組蛋白擴增造血干細胞及祖細胞的方法，在HS/PCs體外培養(yǎng)體系中加入rhDSL重組蛋白及早期造血因子，采用這兩者結合擴增造血干細胞和祖細胞。所述rhDSL重組蛋白為含有6×His標簽的Notch配體Delta-like-1的衍生多肽，衍生多肽由含有進化中的保守結構區(qū)DSL和與之相鄰的N-端50個氨基酸構成，共99個氨基酸，其氨基酸序列為LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。本發(fā)明中rhDSL重組蛋白在造血干/祖細胞擴增中具有分子量小，使用方便，節(jié)約成本的特點。
文檔編號C07K14/47GKCN101363012 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200810200654
公開日2011年4月6日 申請日期2008年9月27日
發(fā)明者趙梅, 韓偉 申請人:上海交通大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),