專利名稱:一種乳酸鏈球菌素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活性小分子肽的制備方法。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸鏈球菌代謝合成的一種由34個(gè)氨基酸組成的多肽，分子式C143H228037N42S7，分子量為3348 ;乳酸鏈球菌素由親水端和疏水端構(gòu)成，是典型的表面活性物質(zhì)。Nisin是高效、無(wú)毒生物防腐劑，目前已廣泛應(yīng)用于乳及乳制品、發(fā)酵飲料、罐裝食品、植物蛋白食品、肉類及肉制品的防腐。
發(fā)明專利申請(qǐng)"乳酸菌肽的分離制備方法"(申請(qǐng)?zhí)?00410020391，公開(kāi)號(hào)CN1743339A)雖然采用了 "發(fā)泡法"，適合低濃度表面活性物質(zhì)的分離，能在很小濃度下快速分離有效成分(乳酸鏈球菌素)，而且具有大幅度降低能耗，減少生產(chǎn)、分離成本；提高Nisin分離效率；及用鹽量大幅度減少的優(yōu)點(diǎn)。但是此方法仍然存在乳酸鏈球菌和蛋白利用率低的缺陷，蛋白利用率僅為20%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的乳酸鏈球菌素分離制備方法中乳酸鏈球菌產(chǎn)率和蛋白利用率低的缺陷，而提供的一種乳酸鏈球菌素的制備方法。
乳酸鏈球菌素按以下步驟制備(一)從已經(jīng)培養(yǎng)了9 15h的乳酸鏈球菌發(fā)酵液底部通入潔凈空氣，并收集泡沫；(二 )消泡處理；(三)過(guò)濾發(fā)泡液；(四)超濾濃縮乳酸鏈球菌素；(五)鹽析；(六)離心，之后固相物再次溶解、噴霧干燥，即得到乳酸鏈球菌素。[0006] 本發(fā)明中培養(yǎng)了9 15h的生產(chǎn)菌(乳酸鏈球菌)處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，具有旺盛生長(zhǎng)能力；在泡沫收集過(guò)程中生產(chǎn)菌(乳酸鏈球菌) 一直保持旺盛生長(zhǎng)、延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，乳酸鏈球菌可以繼續(xù)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素，提高了生產(chǎn)菌的產(chǎn)率和產(chǎn)量。本發(fā)明在"發(fā)泡"的過(guò)程中收集泡沫，去除了產(chǎn)物(乳酸鏈球菌素)對(duì)生產(chǎn)菌(乳酸鏈球菌)的抑制作用，提高了發(fā)酵液中蛋白利用率和產(chǎn)物(乳酸鏈球菌素)的產(chǎn)量。而且乳酸鏈球菌素的生產(chǎn)和分離同時(shí)進(jìn)行，大大的縮短了生產(chǎn)周期。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式
一 本實(shí)施方式乳酸鏈球菌素按以下步驟制備(一)從已經(jīng)培養(yǎng)了9 15h的乳酸鏈球菌發(fā)酵液底部通入潔凈空氣，并收集泡沫；(二 )消泡處理；(三)過(guò)濾發(fā)泡液；(四)超濾濃縮乳酸鏈球菌素；(五)鹽析；(六)離心，之后固相物再次溶解、噴霧干燥，即得到乳酸鏈球菌素。
本實(shí)施方式用滅菌的管道導(dǎo)出泡沫，直到泡沫產(chǎn)生量降低到難以收集為止，一般收集時(shí)間為9 12h。本實(shí)施方式發(fā)泡是在培養(yǎng)了 9 15h的乳酸鏈球菌發(fā)酵液中進(jìn)行，此時(shí)發(fā)酵液中乳酸鏈球菌為優(yōu)勢(shì)菌種，雜菌難以生長(zhǎng)。
本實(shí)施方式乳酸鏈球菌素的產(chǎn)量提高了 20% 40%，發(fā)酵液中蛋白利用率為82% 85%。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟( 一 )中潔凈 空氣的通入速率為1X10—6 1X10—3m3/s。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(一)收集泡
沫過(guò)程中乳酸鏈球菌發(fā)酵液的溫度為25 35°C、 pH值保持為5. 5 6. 5。其它步驟及所 選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(二 )向收集 的泡沫中加入酸性溶液將pH值調(diào)節(jié)到2. 0 3. 5，然后立即升溫至60 90°C 、并保持60 9(TC的溫度10 30min。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式經(jīng)消泡處理形成的發(fā)泡液的體積為原乳酸鏈球菌發(fā)酵液總體積的 10% 30%，其中含有95%以上的乳酸鏈球菌素。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四的不同點(diǎn)是步驟(二 )中加入
的酸性溶液為鹽酸、乙酸、硫酸或磷酸。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式四相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(三)中采用
膜孔徑為0. 1 0. 2微米的陶瓷膜過(guò)濾發(fā)泡液，陶瓷膜的工作頻率為20 60Hz、進(jìn)膜壓力
為2 8MPa、工作溫度為25 65°C。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟(三)可完全去處乳酸鏈球菌菌體。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(四)中采用 膜孔徑為3 100納米的超濾膜，超濾膜的工作頻率為20 60Hz、進(jìn)膜壓力為2 8MPa、 工作溫度為25 65°C。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式可截留分子量大于1000的分子，能夠完全截留乳酸鏈球菌素。本實(shí)施 方式可除去大量水分及小分子雜質(zhì)，以提高乳酸鏈球菌素的純度。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(五)鹽析按 濃縮液與氯化鈉2 3:1的重量比向濃縮液中添加氯化鈉。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施 方式一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
八的不同點(diǎn)是步驟(五)鹽析的 時(shí)間為1 2h。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式八相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(六)中以 2000 3000r/min的速度進(jìn)行離心。其它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
i^一 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(六)中離 心得到的固相物用pH值為2 3. 5的鹽酸完全溶解，之后再加入固相物質(zhì)量50% 80% 的氯化鈉和固相物質(zhì)量10% 20%的奶粉，然后再在180 25(TC的條件下噴霧干燥。其 它步驟及所選參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十二 本實(shí)施方式乳酸鏈球菌素按以下步驟制備(一)從已經(jīng)培養(yǎng) 了 10h的乳酸鏈球菌發(fā)酵液底部按5X 10—4m3/s的速率通入潔凈空氣，并收集泡沫，收集泡 沫過(guò)程中乳酸鏈球菌發(fā)酵液的溫度為30°C 、pH值保持為6 ; ( 二 )消泡處理向收集的泡沫 中加入鹽酸溶液將pH值調(diào)節(jié)到3. O，然后立即升溫至7(TC、并保持7(TC的溫度20min，形 成發(fā)泡液；(三)過(guò)濾發(fā)泡液采用膜孔徑為0. 1微米的陶瓷膜過(guò)濾發(fā)泡液，陶瓷膜的工作 頻率為50Hz、進(jìn)膜壓力為5MPa、工作溫度為30°C ;(四)超濾采用膜孔徑為40納米的超濾膜，超濾膜的工作頻率為40Hz、進(jìn)膜壓力為5MPa、工作溫度為50°C，濃縮乳酸鏈球菌素； (五)鹽析按濃縮液與氯化鈉2.5 : l的重量比向濃縮液中添加氯化鈉，鹽析時(shí)間為1 2h ;(六)以2500r/min的速度離心，之后離心得到的固相物再用pH值為3的鹽酸完全溶 解，然后再加入固相物質(zhì)量60%的氯化鈉和固相物質(zhì)量15%的奶粉，再在20(TC的條件下 噴霧干燥，即得到乳酸鏈球菌素。
膜分離技術(shù)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作容易、無(wú)需加熱、能耗低、速度快等特點(diǎn)。本實(shí)施方 式采用了陶瓷膜和超濾膜兩步膜分離技術(shù)，濃縮倍數(shù)高、大幅度縮短了膜濃縮的過(guò)液量和 時(shí)間，有效的緩解了分離和濃縮膜的運(yùn)行壓力，減少鹽析過(guò)程中的用鹽量，提高乳酸鏈球菌 素產(chǎn)量的同時(shí)節(jié)約生產(chǎn)成本。
本實(shí)施方式膜分離步驟自動(dòng)化程度高，無(wú)任何化學(xué)成分添加，對(duì)產(chǎn)物活性結(jié)構(gòu)無(wú) 破壞，提高產(chǎn)品品質(zhì)。本實(shí)施方式濃縮效果好、產(chǎn)品純度高，可達(dá)92%，乳酸鏈球菌素回收率 高，達(dá)95%以上。本實(shí)施方式綠色環(huán)保、不產(chǎn)生新的污染源，噪音低。
權(quán)利要求
一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于乳酸鏈球菌素按以下步驟制備(一)從已經(jīng)培養(yǎng)了9～15h的乳酸鏈球菌發(fā)酵液底部通入潔凈空氣，并收集泡沫；(二)消泡處理；(三)過(guò)濾發(fā)泡液；(四)超濾濃縮乳酸鏈球菌素；(五)鹽析；(六)離心，之后固相物再次溶解、噴霧干燥，即得到乳酸鏈球菌素；其中步驟(一)中潔凈空氣的通入速率為1×10-6～1×10-3m3/s；步驟(一)收集泡沫過(guò)程中乳酸鏈球菌發(fā)酵液的溫度為25～35℃、pH值保持為5.5～6.5。
2. 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(二)向收集的泡沫中加入酸溶液將pH值調(diào)節(jié)到2. 0 3. 5，然后立即升溫至60 90°C 、并保持60 90。C的溫度10 30min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(三)中采用膜孔徑為0. 1 0. 2微米的陶瓷膜過(guò)濾發(fā)泡液，陶瓷膜的工作頻率為20 60Hz、進(jìn)膜壓力為2 8MPa、工作溫度為25 65°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(四)中采用膜孔徑為3 100納米的超濾膜，超濾膜的工作頻率為20 60Hz、進(jìn)膜壓力為2 8MPa、工作溫度為25 65°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(五)鹽析按濃縮液與氯化鈉2 3:1的重量比向濃縮液中添加氯化鈉。
6. 根據(jù)權(quán)利要求
5所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(五)鹽析的時(shí)間為1 2h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(六)中以2000 3000r/min的速度進(jìn)行離心。
8. 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的一種乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于步驟(六)中離心得到的固相物用pH值為2 3. 5的鹽酸完全溶解，之后再加入固相物質(zhì)量50% 80%的氯化鈉和固相物質(zhì)量10% 20%的奶粉，然后再在180 25(TC的條件下噴霧干燥。
專利摘要
一種乳酸鏈球菌素的制備方法，它涉及一種活性小分子肽的制備方法。它解決了現(xiàn)有乳酸鏈球菌素分離制備方法中乳酸鏈球菌產(chǎn)率和蛋白利用率低的缺陷。乳酸鏈球菌素按以下步驟制備(一)從發(fā)酵液底部通入潔凈空氣，并收集泡沫；(二)消泡處理；(三)過(guò)濾發(fā)泡液；(四)超濾；(五)鹽析；(六)離心，之后固相物再次溶解、噴霧干燥，即得到乳酸鏈球菌素。本發(fā)明生產(chǎn)菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，具有旺盛生長(zhǎng)能力；在泡沫收集過(guò)程中生產(chǎn)菌一直保持旺盛生長(zhǎng)，可以繼續(xù)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素，提高了生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力和乳酸鏈球菌素的產(chǎn)量。本發(fā)明在發(fā)泡的過(guò)程中收集泡沫，解決發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物對(duì)生產(chǎn)菌的抑制作用，提高了發(fā)酵液中蛋白利用率和產(chǎn)物的產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C07K1/14GKCN101113463 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710072250
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2007年5月23日
發(fā)明者張欽革, 梁恒宇, 黃亦存 申請(qǐng)人:齊齊哈爾安泰生物工程有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),