專利名稱:一種重組人尿激酶原的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人尿激酶原的純化方法，更具體地說是用色譜技術(shù)純化重組人尿激酶原的方法。
背景技術(shù)：
尿激酶原是一種特異性溶血栓藥物，具有良好的市場前景。目前，已經(jīng)能夠通過基因重組技術(shù)在多種基因工程細(xì)胞如大腸桿菌、哺乳動(dòng)物、酵母、昆蟲等細(xì)胞生產(chǎn)尿激酶原。在尿激酶原的生產(chǎn)過程中產(chǎn)品的純化技術(shù)非常重要，是決定產(chǎn)品質(zhì)量、影響生產(chǎn)成本和效益的關(guān)鍵步驟。
公開文獻(xiàn)報(bào)道的尿激酶原的純化技術(shù)，如Avgennos G.C.等(1990)用快流速磺酸型瓊脂糖凝膠珠(S-Sepharose Fast Flow)陽離子交換色譜、對氨基苯甲脒親和色譜、磺酸型陽離子交換快速蛋白質(zhì)液相色譜(mono-S FPLC)、第二次對氨基苯甲脒親和色譜四步法從CHO基因工程細(xì)胞培養(yǎng)物中純化人尿激酶原，但是該四步方法在實(shí)際應(yīng)用中操作比較繁瑣，延長了生產(chǎn)操作時(shí)間，而且純化的尿激酶原總產(chǎn)率僅為40％。按此方法進(jìn)行放大工業(yè)化生產(chǎn)，勢必受到限制。
另外如專利申請“溶血栓新藥——重組人尿激酶原的純化工藝”(申請國中國，公開號CN1164536A，
公開日1997年11月12日)公開了一種對CHO基因工程細(xì)胞培養(yǎng)液中重組人尿激酶原的四步純化工藝，包含第一步羧甲基徑向陽離子交換色譜法(CM-徑向陽離子交換色譜法)、第二步微孔高硅玻璃珠(MPG)吸附色譜法、第三步S-200型葡聚糖聚丙烯酰氨高效凝膠(Sephacryl S-200HR)色譜法和第四步對氨基苯甲脒親和色譜法。該純化方法采用的CM-徑向陽離子交換色譜填料不能在線清洗消毒，使用壽命短，而且剛性差，結(jié)構(gòu)不規(guī)則，裝填色譜柱比較麻煩，不利于放大；另外，該純化方法的收率較低，僅有50％，用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的尿激酶原的大規(guī)模純化問題。
為此，本發(fā)明提供了一種用Streamline-SP擴(kuò)張床色譜、Sephacryl S-200凝膠色譜、對氨基苯甲脒Sepharose Fast Flow親和色譜和DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜法等，從哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞培養(yǎng)上清中大量純化基因工程產(chǎn)品的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案A.用陽離子交換Streamline-SP擴(kuò)張床色譜從工程細(xì)胞培養(yǎng)上清中回收重組人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝膠色譜進(jìn)一步純化上述A收集的尿激酶原粗產(chǎn)品；C.用對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜法除去粗產(chǎn)品中的尿激酶；D.用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜除去重組人尿激酶原中殘留細(xì)胞DNA。
本發(fā)明還提供了優(yōu)選的工藝條件其中步驟A優(yōu)選的工藝條件是指將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，調(diào)pH至5.5～6.8。色譜柱先用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5～6.8)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速30～60ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5～6.8)和0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.8～1.2mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
步驟A更優(yōu)選的工藝條件是收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，調(diào)pH至6.4。色譜柱先用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速40ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含1.0mol/L氯化鈉，pH7.0)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
其中步驟B優(yōu)選的工藝條件是指將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2～0.6mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速10～40ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
步驟B更優(yōu)選的工藝條件是將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.4)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速20ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
其中步驟C優(yōu)選的工藝條件是指將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2～0.6mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
步驟C更優(yōu)選的工藝條件是將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
其中步驟D優(yōu)選的工藝條件是指將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005～0.010mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至7.5～8.5后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
步驟D更優(yōu)選的工藝條件是將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用1mol/L Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至8.2后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
為了達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)效果，優(yōu)選的方法是在步驟C和D之間還包括步驟E用陽離子交換Streamline-SP固定床色譜柱濃縮尿激酶原，濃縮可達(dá)10～15倍左右，大大方便了后續(xù)操作。
步驟E優(yōu)選的工藝條件是將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5～6.8)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至5.5～6.8后，上柱，隨后用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2～0.6mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
步驟E更優(yōu)選的工藝條件是將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至6.4后，上柱，隨后用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
本發(fā)明所采用的純化方法，培養(yǎng)液上清不需要離心或過濾，即可直接上柱，并且該純化方法處理量大，流速快，可以節(jié)省操作步驟，節(jié)約成本，提高收率，適合于大規(guī)模生產(chǎn)；另外，所采用的分離介質(zhì)便于裝填色譜柱，而且操作簡便，易于清洗消毒。經(jīng)上述方法分離純化的尿激酶原產(chǎn)品可以達(dá)到SFDA對生物制品的要求，并且回收率達(dá)到70％以上，優(yōu)于以往的尿激酶原產(chǎn)品純化方法。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下列舉實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施例。
實(shí)施例一尿激酶原基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建(參見中國專利重組人糖基化尿激酶原的制備方法，公告號CN1062016C，公告日2001年2月14日)采用肉豆寇酯(PMA)誘導(dǎo)Detroit 562細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，構(gòu)建cDNA文庫，通過篩選獲得了含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株，得到人尿激酶原全長cDNA基因并克隆至pUC19質(zhì)粒，獲得了PMM-UK重組質(zhì)粒；從pMM-UK質(zhì)粒DNA中，分離pro-UK cDNA并插入中間載體1pSV2-pro-UK中得到可表達(dá)尿激酶原的重組質(zhì)粒pSV2-pro-UK；從pSV2-dhfr載體中得到內(nèi)含SV40增強(qiáng)子和二氫葉酸還原酶基因，將此片段插入pXMT載體中，從而獲得中間載體pMTSV-dhfr；從pSV2-pro-UK中得到含SV40增強(qiáng)子和全長尿激酶原cDNA，并將該片段插入PMTSV-dhfr中間載體中，即可獲得可表達(dá)尿激酶原的載體pMTsv-du。
實(shí)施例二轉(zhuǎn)染和篩選高效表達(dá)的CHO工程細(xì)胞將20-40μg pMTSV-du質(zhì)粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，先用HAT選擇培養(yǎng)基篩選，10大后換成含1-3×10-8M MTX的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行dhfr和MTX雙重篩選，并對表達(dá)有尿激酶原活性的陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)多次亞克隆和MTX加壓擴(kuò)增基因，鋅離子誘導(dǎo)，最終篩選到能高效表達(dá)尿激酶原的細(xì)胞株。
實(shí)施例三CHO工程細(xì)胞的培養(yǎng)和放大CHO工程細(xì)胞由方瓶(單層貼壁培養(yǎng))一轉(zhuǎn)瓶(單層貼壁培養(yǎng))一攪拌瓶(多孔微載體培養(yǎng))一5LCelligen反應(yīng)器(多孔微載體培養(yǎng))一30L Biostat UC反應(yīng)器(多孔微載體培養(yǎng))逐級放大培養(yǎng)。由于細(xì)胞能在長滿細(xì)胞的載體和空載體之間自動(dòng)轉(zhuǎn)移，每級放大培養(yǎng)時(shí)，先在更大規(guī)模的反應(yīng)器中預(yù)先加入適量培養(yǎng)基和經(jīng)過處理的多孔微載體，長滿細(xì)胞的多孔微載體通過管道直接近人下一級反應(yīng)器中?？刂苝H為7.0±0.5，DO為7％-40％，溫度為37.0±0.1℃，攪拌轉(zhuǎn)速為70r/min-90r/min.多孔微載體的濃度為2g/L-g/L培養(yǎng)基。采用批式換液連續(xù)培養(yǎng)方式，每天通過細(xì)胞截留系統(tǒng)換液1-1.2個(gè)工作體積，將微載體截留在反應(yīng)器中，收獲含產(chǎn)品的上清并加入新鮮培養(yǎng)基。
實(shí)施例四用色譜純化法純化重組人尿激酶原A.收集50升工程細(xì)胞培養(yǎng)上清，用HCl調(diào)pH至6.4。色譜柱先用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速40ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含1.0mol/L氯化鈉，pH7.0)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
B.將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速20ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
D.將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至8.2后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
實(shí)施例五用色譜純化法純化重組人尿激酶原A.收集100升工程細(xì)胞培養(yǎng)上清，用HCl調(diào)pH至6.0。色譜柱先用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速40ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0)和0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(含1.2mol/L氯化鈉，pH7.6)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
B.將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2mol/L氯化鈉，pH7.6)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速20ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2mol/L氯化鈉，pH7.6)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
D.將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至7.8后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
實(shí)施例六用色譜純化法純化重組人尿激酶原A.收集200升工程細(xì)胞培養(yǎng)上清，用HCl調(diào)pH至5.8。色譜柱先用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.8)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速60ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.8)和0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.8mol/L氯化鈉，pH6.8)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
B.將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4mol/L氯化鈉，pH6.8)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速40ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4mol/L氯化鈉，pH6.8)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
D.將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.008mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至8.2后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
實(shí)施例七用色譜純化法純化重組人尿激酶原A.收集200升工程細(xì)胞培養(yǎng)上清，用HCl調(diào)pH至5.5。色譜柱先用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速45ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5)和0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.8mol/L氯化鈉，pH7.5)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
B.將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.3mol/L氯化鈉，pH7.5)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速30ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.3mol/L氯化鈉，pH7.5)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
E.將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至5.5后，上柱，隨后用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.3mol/L氯化鈉，pH7.5)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
D.將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.010mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至7.5后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
實(shí)施例八用色譜純化法純化重組人尿激酶原A.收集150升工程細(xì)胞培養(yǎng)上清，用HCl調(diào)pH至6.4。色譜柱先用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速50ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)和0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含1.2mol/L氯化鈉，pH7.8)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
B.將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2mol/L氯化鈉，pH7.8)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速40ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2mol/L氯化鈉，pH7.8)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
E.將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至6.4后，上柱，隨后用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2mol/L氯化鈉，pH7.8)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
D.將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至8.0后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
實(shí)施例九用色譜純化法純化重組人尿激酶原A.收集150升工程細(xì)胞培養(yǎng)上清，用HCl調(diào)pH至6.8。色譜柱先用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速50ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)和0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含1.2mol/L氯化鈉，pH7.0)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
B.將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速35ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
C.將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
E.將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至6.8后，上柱，隨后用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
D.將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液將步驟C收集的穿過液的pH調(diào)至8.2后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
權(quán)利要求
1.一種重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于該方法包括如下步驟A.用陽離子交換Streamline-SP擴(kuò)張床色譜從工程細(xì)胞培養(yǎng)上清中回收重組人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝膠色譜進(jìn)一步純化上述A收集的尿激酶原粗產(chǎn)品；C.用對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜法除去粗產(chǎn)品中的尿激酶；D.用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜除去重組人尿激酶原中殘留細(xì)胞的DNA。
2.按照權(quán)利要求
1所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于在步驟C和D之間還包括步驟E用陽離子交換Streamline-SP固定床色譜濃縮尿激酶原。
3.按照權(quán)利要求
2所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟E是指將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5～6.8)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至5.5～6.8后，上柱，隨后用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2～0.6mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
4.按照權(quán)利要求
3所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟E是指將Streamline-SP固定床色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)平衡色譜柱3～5個(gè)柱體積，第C步下來的樣品稀釋后，用NaOH調(diào)pH至6.4后，上柱，隨后用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)洗脫，并收集洗脫蛋白吸收峰。
5.按照權(quán)利要求
1、2或3所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟A是指將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，調(diào)pH至5.5～6.8。色譜柱先用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5～6.8)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速30～60ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5～6.8)和0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.8～1.2mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
6.按照權(quán)利要求
5所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟A是指將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，調(diào)pH至6.4。色譜柱先用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)沖洗并平衡3～5個(gè)柱體積，然后加細(xì)胞培養(yǎng)上清，流速40ml/分鐘，直至上清液全部通過色譜柱，再用同種緩沖液沖洗色譜柱，并用檢測器監(jiān)測色譜柱流出液，直至紫外吸收值≤0.005，然后改用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.4)和0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含1.0mol/L氯化鈉，pH7.0)進(jìn)行梯度洗脫吸附在色譜柱上的尿激酶原，收集洗脫蛋白吸收峰組分。
7.按照權(quán)利要求
1、2或3所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟B是指將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2～0.6mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速10～40ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
8.按照權(quán)利要求
7所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟B是指將Sephacryl S-200凝膠色譜柱置于4℃并與一臺制備型高效液相色譜儀相連，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡1～2個(gè)柱體積；A收集的尿激酶原通過進(jìn)樣管上樣，流速20ml/分鐘，紫外檢測波長280nm，收集蛋白吸收主峰流出液。
9.按照權(quán)利要求
1、2或3所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟C是指將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2～0.6mol/L氯化鈉，pH6.8～7.8)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
10.按照權(quán)利要求
9所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟C是指將對氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜柱進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，置于4℃，用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5mol/L氯化鈉，pH7.0)平衡3～5個(gè)柱體積，將色譜柱出口與紫外檢測器連接，將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入B收集液中，用紫外檢測器監(jiān)測流出液，收集穿過蛋白吸收峰流出液。
11.按照權(quán)利要求
1、2或3所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟D是指將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005～0.010mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用Tris溶液調(diào)步驟C收集的穿過液pH至7.5～8.5后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
12.按照權(quán)利要求
11所述的重組人尿激酶原的純化方法，其特征在于所述步驟D是指將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱置于4℃，進(jìn)液管與蠕動(dòng)泵相連，出口端與紫外檢測器相連，用0.005mol/L Tris-HCl緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，用1mol/L Tris溶液調(diào)步驟C收集的穿過液pH至8.2后上柱，用紫外檢測器在280nm波長下監(jiān)測蛋白吸收值，收集蛋白質(zhì)吸收穿過液，得到純的重組人尿激酶原。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種重組人尿激酶原的純化方法，更具體地說是用色譜技術(shù)純化制備重組人尿激酶原的方法。為了解決動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的尿激酶原的大規(guī)模純化問題，本發(fā)明公開了一種用Streamline－SP擴(kuò)張床色譜、Sephacryl S－200凝膠色譜、對氨基苯甲脒Sepharose Fast Flow親和色譜和DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜法，從哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞培養(yǎng)液回收基因工程產(chǎn)品的方法。還可以在步驟C和D之間包括步驟E用陽離子交換Streamline－SP固定床色譜柱濃縮尿激酶原。采用上述方法得到符合SFDA要求的重組人尿激酶原，總回收率在70％以上，純度達(dá)到99％以上。
文檔編號C12N9/72GKCN1680550SQ200410018835
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月5日
發(fā)明者肖成祖, 張正光, 姜燕, 胡顯文, 胥照平, 李世崇, 劉健, 高麗華 申請人:天津天士力制藥股份有限公司, 上海天士力藥業(yè)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan