本發(fā)明屬于基因工程疫苗領(lǐng)域，具體是涉及共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雞馬立克氏?。╩d）、新城疫（nd）和傳染性法氏囊?。╥bd）是雞的三大疫病，各類(lèi)雞群必須采用疫苗進(jìn)行免疫防控?，F(xiàn)地新城疫病毒（ndv）和傳染性法氏囊病毒（ibdv）常發(fā)生混合感染，然而目前尚缺乏一種能夠不受母源抗體干擾，適于孵化場(chǎng)一日齡雛雞早期免疫的疫苗用于上述疫病的聯(lián)合免疫。自1982年在我國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，ibdv感染在我國(guó)大部分養(yǎng)禽地區(qū)廣泛流行。2017年以來(lái)，我國(guó)和周邊國(guó)家相繼出現(xiàn)非典型ibd疫情，患病雞群生產(chǎn)性能和免疫機(jī)能低下，剖檢可見(jiàn)法氏囊嚴(yán)重萎縮，經(jīng)鑒定引起該疫情的病原為ibdv新型變異株（varibdv）。目前ibdv新型變異株在我國(guó)廣泛流行，但市場(chǎng)上使用的商品化ibd疫苗卻不能對(duì)該變異毒株提供良好的免疫保護(hù)，進(jìn)而造成感染雞群產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，成為目前影響我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的新威脅。

2、雞馬立克氏病病毒（mdv）能引起雞的高度傳染性、淋巴組織增生性、免疫抑制性腫瘤病。血清1型mdv弱毒活疫苗cvi988株在國(guó)內(nèi)外被廣泛用于雞馬立克氏病的防控。mdv屬于皰疹病毒，基因組較大，可供外源基因插入或替換的復(fù)制非必需基因多，是一種理想的構(gòu)建重組活載體疫苗的病毒載體。mdv復(fù)制具有嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性，病毒在細(xì)胞間傳播，不受母源抗體干擾，適于早期免疫，疫苗可以胚內(nèi)免疫或在雞一日齡時(shí)免疫，免疫抗體產(chǎn)生早。mdv感染后機(jī)體終身帶毒，可持續(xù)表達(dá)外源蛋白抗原，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，從而使機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫力。另外，mdv?的自然宿主只有禽類(lèi)，對(duì)其他動(dòng)物和人類(lèi)是安全的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒。

2、本發(fā)明的目的還在于提供一種共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒的構(gòu)建方法。

3、本發(fā)明的目的還在于提供一種共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒的應(yīng)用。

4、為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

5、一種共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒，所述重組馬立克氏病病毒是將包含雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因編碼序列f2aa2、土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表達(dá)框架cagw-f2aa2插入馬立克氏病病毒基因組后獲得的。

6、所述編碼序列f2aa2是由新城疫病毒f基因編碼序列和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因編碼序列以豬捷申病毒2a自剪切肽編碼序列連接獲得，所述編碼序列f2aa2的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

7、所述表達(dá)框架cagw-f2aa2是將f2aa2克隆入pcaggs載體的雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之間，并將土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列插入f2aa2序列與兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之間獲得的，所述表達(dá)框架cagw-f2aa2的核苷酸序列如seq?idno.2所示。

8、所述重組馬立克氏病病毒是將含有血清1型馬立克氏病病毒cvi988株基因組dna片段的重組黏粒c1、c2、c3、c5、c6以及含有新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因表達(dá)框架的重組黏粒c4-45-f2aa2共轉(zhuǎn)染cef細(xì)胞后，通過(guò)病毒拯救獲得的；所述的重組黏粒c1、c2、c3、c5、c6分別含有馬立克氏病病毒cvi988株基因組第1-37644位、第29969-68579位，第60962-99647位、第115670-152340、第143712-178311位核苷酸片段；所述的重組黏粒c4-45-f2aa2是在c4的基礎(chǔ)上，在cvi988株基因組第105561-105563位核苷酸之間插入表達(dá)框架cagw-f2aa2后獲得的，所述的重組黏粒c4包含cvi988株基因組第91415-126182位核苷酸片段。

9、所述表達(dá)框架cagw-f2aa2插入在馬立克氏病病毒cvi988株基因組第105561-105563位核苷酸之間。

10、一種所述的共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒在制備新城疫、雞傳染性法氏囊病和雞馬立克氏病疫苗中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含新城疫病毒基因vii型毒株f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的表達(dá)框架插入到馬立克病毒cvi988株基因組的105561-105563位核苷酸之間，構(gòu)建了共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒疫苗株c20103株。將該重組病毒疫苗株免疫無(wú)特定病原體（spf）雞后，能使spf雞獲得對(duì)新城疫病毒基因vii型強(qiáng)毒株、傳染性法氏囊病毒新型變異株以及雞馬立克氏病病毒強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)，可以用于新城疫、雞傳染性法氏囊病和雞馬立克氏病疫苗的制備。

12、本發(fā)明提供的重組馬立克氏病病毒制備的疫苗能夠同時(shí)提供針對(duì)新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒新型變異株以及雞馬立克氏病強(qiáng)毒感染的多重保護(hù)，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒，其特征在于，所述重組馬立克氏病病毒是將包含雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因編碼序列f2aa2、土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表達(dá)框架cagw-f2aa2插入雞馬立克氏病病毒基因組后獲得；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒，其特征在于，所述重組馬立克氏病病毒是將含有血清1型雞馬立克氏病病毒cvi988株基因組dna片段的重組黏粒c1、c2、c3、c5、c6以及含有新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因表達(dá)框架的重組黏粒c4-45-f2aa2共轉(zhuǎn)染cef細(xì)胞后，通過(guò)病毒拯救獲得的；所述的重組黏粒c1、c2、c3、c5、c6分別含有馬立克氏病病毒cvi988株基因組第1-37644位、第29969-68579位，第60962-99647位、第115670-152340、第143712-178311位核苷酸片段；所述的重組黏粒c4-45-f2aa2是在c4的基礎(chǔ)上，在cvi988株基因組第105561-105563位核苷酸之間插入表達(dá)框架cagw-f2aa2后獲得的，所述的重組黏粒c4包含cvi988株基因組第91415-126182位核苷酸片段。

3.一種如權(quán)利要求1所述的共同表達(dá)新城疫病毒f基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株vp2基因的重組馬立克氏病病毒在制備新城疫、雞傳染性法氏囊病和雞馬立克氏病疫苗中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種共同表達(dá)新城疫病毒F基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株VP2基因的重組馬立克氏病病毒及其應(yīng)用，屬于基因工程疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含新城疫病毒基因VII型毒株F基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株VP2基因的表達(dá)框架插入到血清1型雞馬立克氏病病毒CVI988株基因組的105561?105563位核苷酸之間，構(gòu)建獲得在雞馬立克氏病病毒基因組中插入新城疫病毒F基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株VP2基因表達(dá)框架的重組黏粒，由其拯救獲得共同表達(dá)新城疫病毒F基因和傳染性法氏囊病毒新型變異株VP2基因的重組病毒C20103株。本發(fā)明提供的重組雞馬立克氏病病毒制備的疫苗能夠同時(shí)預(yù)防新城疫、雞傳染性法氏囊病和雞馬立克氏病，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：李凱,田世茂,王笑梅,李曉涵,李守軍,車(chē)艷杰,朱秀同
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9