本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種用于構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的培養(yǎng)基及其方法。

背景技術(shù)：

1、頭頸部腫瘤是世界第六大常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約89萬(wàn)、死亡病例近45萬(wàn)。頭頸部腫瘤的原發(fā)部位和病理分型多樣，包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面腫瘤三大類別。頸部腫瘤常見的是甲狀腺腫瘤；耳鼻喉科腫瘤常見的有喉癌、副鼻竇癌等；口腔頜面腫瘤常見的為各種口腔癌，如舌癌、牙齦癌、頰癌等。

2、頭頸部的重要器官比較集中、解剖較為復(fù)雜，血供及淋巴引流十分豐富，故而頭頸部腫瘤易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差。頭頸部腫瘤建議早診斷、早治療，然而其發(fā)病部位相對(duì)隱匿，患者在就診時(shí)多處于中晚期階段。盡管已有手術(shù)、放療、化療、靶向和免疫等多種綜合治療方式，但是晚期患者5年總生存率也僅為20%-35%。因此，如何根據(jù)患者個(gè)體化差異情況制定精準(zhǔn)治療方案、延長(zhǎng)生存時(shí)間并且改善生存質(zhì)量是國(guó)內(nèi)外學(xué)者面臨的棘手問題，具有重大科學(xué)理論價(jià)值和社會(huì)實(shí)踐意義。

3、截至目前，腫瘤體外替代物模型的轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍然受限，主要原因是細(xì)胞模型組成單一、缺少對(duì)免疫微環(huán)境的模擬，動(dòng)物模型與人類的種屬差異、欠缺對(duì)個(gè)性化醫(yī)療需求的考慮等。針對(duì)頭頸部腫瘤診療現(xiàn)狀，亟待開發(fā)和構(gòu)建一種樣本易于獲取、操作可重復(fù)性好，高通量、標(biāo)準(zhǔn)化、充分保留原始腫瘤組織各項(xiàng)生物學(xué)特征的體外3d細(xì)胞模型，從而推動(dòng)臨床前有效性及安全性評(píng)價(jià)、加速新藥研發(fā)、帶動(dòng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和患者受益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的培養(yǎng)基及其方法。

2、第一方面，本發(fā)明要求保護(hù)一種構(gòu)建用于頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的培養(yǎng)基。

3、本發(fā)明要求保護(hù)的用于頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型構(gòu)建的培養(yǎng)基，由抗菌抗真菌劑三抗、hepes、glutamax、mem非必需氨基酸溶液、人重組蛋白egf、人重組蛋白bfgf、人重組蛋白hgf、人重組蛋白msp、人重組蛋白wnt-3a、人重組蛋白noggin、人重組蛋白r-spondin1、人重組蛋白il-2、人重組蛋白il-15、毛喉素（forskolin，一種腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑）、chir99021、sb202190、a83-01、primocin、n-乙酰-l-半胱氨酸（n-acetyl-l-cysteine）、煙堿（nicotinamide）、n2添加劑（n2?supplement）、b27、its-x（insulin,?transferrin,selenium,?ethanolamine?solution）、y-27632和基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗為青霉素、鏈霉素和兩性霉素b。

4、在所述培養(yǎng)基中，所述hepes的終濃度為8-12mm（如10mm）；所述glutamax的終濃度為0.8-1.2%（如1%）體積百分含量；所述mem非必需氨基酸溶液的終濃度為0.8-1.2%（如1%）體積百分含量；所述人重組蛋白egf的終濃度為10-100ng/ml（如50ng/ml）；所述人重組蛋白bfgf的終濃度為10-50ng/ml（如20ng/ml）；所述人重組蛋白hgf的終濃度為5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重組蛋白msp的終濃度為5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重組蛋白wnt-3a的終濃度為200-300ng/ml（如200ng/ml）；所述人重組蛋白noggin的終濃度為100-200ng/ml（如100ng/ml）；所述人重組蛋白r-spondin?1的終濃度為250-500ng/ml（如400ng/ml）；所述人重組蛋白il-2的終濃度為10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述人重組蛋白il-15的終濃度為10-100ng/ml（如10ng/ml）；所述毛喉素的終濃度為2-10μm（如5μm）；所述chir99021的終濃度為1.5-6μm（如2μm）；所述sb202190的濃度為5-10μm（如5μm）；所述a83-01的濃度為0.25-1.25μm（如1μm）；所述primocin的濃度為0.5mg/ml；所述n-乙酰-l-半胱氨酸的濃度為0.5-2mm（如2mm）；所述煙堿的濃度為5-10mm（如10mm）；所述n2添加劑的終濃度為1%體積百分含量；所述b27的終濃度為1.5-2.5%（如2%）體積百分含量；所述its-x的終濃度為0.8-1.2%（如1%）體積百分含量；所述y-27632的終濃度為5-20μm（如7.5μm）。

5、進(jìn)一步地，所述mem非必需氨基酸溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：甘氨酸10mm；l-丙氨酸10mm；l-天冬酰胺10mm；l-天冬氨酸10mm；l-谷氨酸10mm；l-脯氨酸10mm；l-絲氨酸10mm。所述glutamax是一種高級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，可直接替代細(xì)胞培養(yǎng)基中的l-谷氨酰胺。所述glutamax為“glutamax??supplement”（如gibco#35050061，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述“glutamax??supplement”的成分為l-alanyl-l-glutamine，是l-glutamine的替代物，濃度為200nm，溶劑為0.85%?nacl溶液。所述a83-01為“3-(6-methyl-2-pyridinyl)-n-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1h-pyrazole-1-carbothioamide”（如tocris#2939，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述sb202190為“4-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑”（如sigma#s7067，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述b27為“b-27??supplement(50x),?minus?vitamin?a”（如gibco#12587010，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述“b-27??supplement?(50x),?minus?vitamin?a”中含有生物素（biotin）、dl-α-生育酚乙酸酯（dl?alpha?tocopherol?acetate）、dl-α-生育酚（dl?alpha-tocopherol）、bsa（fatty?acidfree?fraction?v）、過氧化氫酶（catalase）、人重組胰島素（human?recombinantinsulin）、人轉(zhuǎn)鐵蛋白（human?transferrin）、超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase）、皮質(zhì)酮（corticosterone）、d?-半乳糖（d-galactose）、乙醇胺鹽酸（ethanolamine?hcl）、還原型谷胱甘肽（glutathione?(reduced)）、左旋肉堿鹽酸（l-carnitine?hcl）、亞油酸（linoleic?acid）、亞麻酸（linolenic?acid）、孕酮（progesterone）、腐胺（putrescine2hcl）、亞硒酸鈉（sodium?selenite）、三碘甲狀腺原氨酸（t3?(triodo-i-thyronine)）。所述its-x的溶劑為ebss溶液（earle's平衡鹽溶液），溶質(zhì)及濃度如下：胰島素1g/l；轉(zhuǎn)鐵蛋白0.55g/l；亞硒酸鈉0.00067g/l；乙醇胺0.2g/l。所述y-27632為“y-27632?dihydrochloride（一種atp競(jìng)爭(zhēng)性的rock-i和rock-ii抑制劑，ki分別為220nm和300nm）”（如mce#129830-38-2，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述primocin為原代細(xì)胞用抗菌劑（如invivogene#ant-pm-1，或與其組成相同的其他產(chǎn)品），用于保護(hù)原代細(xì)胞免受微生物污染的抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、支原體和真菌均有殺傷作用。所述n-2添加劑為“n-2?supplement(100x)”（如gibco#17502001，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述“n-2?supplement(100x)”中含有終濃度為1mm的人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（humantransferrin(holo)）、500mg/l的重組胰島素全鏈（insulin?recombinant?full?chain）、0.63mg/l的孕酮（progesterone）、10mm的腐胺（putrescine）、0.52mg/l的亞硒酸鹽（selenite）。所述chir99021是一種高特異性的糖原合酶激酶-3（gsk-3）抑制劑，抑制gsk-3α和gsk-3β，ic50值分別為10nm和6.7nm。

6、進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為advanced?dmem/f12培養(yǎng)基。

7、在所述培養(yǎng)基中，所述抗菌抗真菌劑中的青霉素的終濃度為100-200u/ml（如100u/ml），鏈霉素的終濃度為100-200μg/ml（如100μg/ml），兩性霉素b的終濃度為200-250ng/ml（如250ng/ml）。

8、進(jìn)一步地，所述抗菌抗真菌劑三抗為“antibiotic-antimycotic,100x”（如gibco#15240062，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述“antibiotic-antimycotic,100x”每毫升包含10000單位青霉素(堿)、10000μg鏈霉素(堿)和25μg兩性霉素b，利用0.85％鹽液形式的青霉素g(鈉鹽)、硫酸鏈霉素和兩性霉素b作為抗真菌劑。

9、進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基的存在形式可為兩種：

10、其一，所述培養(yǎng)基為由所述抗菌抗真菌劑三抗、所述hepes、所述glutamax、所述mem非必需氨基酸溶液、所述人重組蛋白egf、所述人重組蛋白bfgf、所述人重組蛋白hgf、所述人重組蛋白msp、所述人重組蛋白wnt-3a、所述人重組蛋白noggin、所述人重組蛋白r-spondin?1、所述人重組蛋白il-2、所述人重組蛋白il-15、所述毛喉素、所述chir99021、所述sb202190、所述a83-01、所述primocin、所述n-乙酰-l-半胱氨酸、所述煙堿、所述n2添加劑、所述b27、所述its-x、所述y-27632和所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成混合而成的溶液。

11、所述培養(yǎng)基配制好后需用0.22μm針頭式濾器（millipore?slgp033rs）過濾除菌，在4℃可以保存兩周。

12、其二，所述培養(yǎng)基中的各組分單獨(dú)存在，使用時(shí)按照配方進(jìn)行配制。

13、更進(jìn)一步地，其中人重組蛋白?egf、人重組蛋白bfgf、人重組蛋白hgf、人重組蛋白msp、人重組蛋白wnt-3a、人重組蛋白noggin、人重組蛋白r-spondin?1、人重組蛋白il-2、人重組蛋白il-15可以儲(chǔ)液（母液）形式存在，具體可為1000倍儲(chǔ)液（母液）。sb202190、forskolin、n-acetyl-l-cysteine、nicotinamide和y-27632可以儲(chǔ)液（母液）形式存在，具體可為1000倍儲(chǔ)液（母液）。a83-01可以儲(chǔ)液（母液）形式存在（-20℃可長(zhǎng)期保存），具體可為100000倍儲(chǔ)液（母液）。chir99021可以儲(chǔ)液（母液）形式存在（-20℃可長(zhǎng)期保存），具體可為10000倍儲(chǔ)液（母液）。

14、1000×人重組蛋白egf儲(chǔ)液由人重組蛋白egf、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白egf的終濃度為20μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

15、1000×人重組蛋白bfgf儲(chǔ)液由人重組蛋白bfgf、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白bfgf的終濃度為20μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

16、1000×人重組蛋白hgf儲(chǔ)液由人重組蛋白hgf、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白hgf的終濃度為20μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

17、1000×人重組蛋白msp儲(chǔ)液由人重組蛋白msp、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白msp的終濃度為20μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

18、1000×人重組蛋白wnt-3a儲(chǔ)液由人重組蛋白wnt-3a、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白wnt-3a的終濃度為200μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

19、1000×人重組蛋白noggin儲(chǔ)液由人重組蛋白noggin、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白noggin的終濃度為100μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

20、1000×人重組蛋白r-spondin?1儲(chǔ)液由人重組蛋白r-spondin?1、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白r-spondin?1的終濃度為250μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

21、1000×人重組蛋白il-2儲(chǔ)液由人重組蛋白il-2、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白il-2的終濃度為20μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

22、1000×人重組蛋白il-15儲(chǔ)液由人重組蛋白il-15、bsa和pbs組成，其中所述人重組蛋白il-15的終濃度為20μg/ml，所述bsa的終濃度為0.01g/ml，余量均為pbs。

23、上述九種1000倍儲(chǔ)液中，所述bsa是可以100倍儲(chǔ)液（母液）形式存在（現(xiàn)配現(xiàn)用），具體由bsa和pbs組成，其中bsa（sigma#a1933）的終濃度為0.1g/ml，余量均為pbs。

24、另外，1000×forskolin由forskolin和dmso組成，其中forskolin的終濃度為10mm，余量均為dmso。

25、1000×sb202190儲(chǔ)液由sb202190和dmso組成，其中所述sb202190的終濃度為10mm，余量均為dmso。

26、1000×n-acetyl-l-cysteine儲(chǔ)液由n-acetyl-l-cysteine和超純水組成，其中所述n-acetyl-l-cysteine的濃度為0.5m，余量均為超純水。

27、1000×nicotinamide儲(chǔ)液由nicotinamide和超純水組成，其中所述nicotinamide的濃度為5m，余量均為超純水。

28、1000×y-27632由y-27632和超純水組成，其中y-27632的終濃度為10mm，余量均為超純水。

29、10000×chir99021儲(chǔ)液由chir99021和dmso組成，其中所述chir99021的濃度為30mm，余量均為dmso。

30、100000×a83-01儲(chǔ)液由a83-01和dmso組成，其中所述a83-01的濃度為25mm，余量均為dmso。

31、第二方面，本發(fā)明要求保護(hù)一種用于構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的成套試劑。

32、本發(fā)明所要求保護(hù)的用于構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的成套試劑，由前文第一方面中所述培養(yǎng)基和如下中的全部或部分組成：樣本解離液、樣本保存液、樣本清洗液、細(xì)胞消化液、消化終止液和細(xì)胞凍存液。

33、進(jìn)一步地，所述樣本解離液由膠原酶i、膠原酶ii、膠原酶iv和pbs組成；其中，所述膠原酶i的終濃度為150-250u/ml（如200u/ml）；所述膠原酶ii的終濃度為150-250u/ml（如200u/ml）；所述膠原酶iv的終濃度為150-250u/ml（如200u/ml）；余量均為pbs。

34、其中，用蛋白酶的酶活來定義膠原酶（所述膠原酶i或所述膠原酶ii或所述膠原酶iv）的單位u：在37℃，ph7.5的條件下，用1u蛋白酶處理膠原酶（所述膠原酶i或所述膠原酶ii或所述膠原酶iv）5小時(shí)，可以釋放l-亮氨酸1μmol。

35、進(jìn)一步地，所述樣本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌劑三抗、hepes和hbss組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗為青霉素、鏈霉素和兩性霉素b；在所述樣本保存液中，所述胎牛血清的終濃度為1-5％（如2%）體積百分含量；所述抗菌抗真菌劑三抗中的青霉素的終濃度為100-200u/ml（如100u/ml），鏈霉素的終濃度為100-200μg/ml（如100μg/ml），兩性霉素b的終濃度為200-250ng/ml（如250ng/ml）；所述hepes的終濃度為8-12mm（如10mm）；余量均為hbss。

36、進(jìn)一步地，所述樣本清洗液由抗菌抗真菌劑三抗和pbs組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗為青霉素、鏈霉素和兩性霉素b；在所述樣本清洗液中，所述抗菌抗真菌劑三抗中的青霉素的終濃度為100-200u/ml（如100u/ml），鏈霉素的終濃度為100-200μg/ml（如100μg/ml），兩性霉素b的終濃度為200-250ng/ml（如250ng/ml）；余量均為pbs。

37、進(jìn)一步地，所述細(xì)胞消化液組成如下：每10ml所述細(xì)胞消化液中含有4-6ml（如5ml）?accutase，終濃度為5mm的edta，1.5-2.5ml（如2ml）?tryple?express，余量為pbs。

38、其中，所述accutase為“stempro??accutase??cell?dissociation?reagent”（如gibco#a11105-01，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。?所述accutase是一種單一成分的酶，在d-pbs，0.5mm?edta溶液中溶解。所述tryple?express為“tryple??express?enzyme(1x),?no?phenol?red”（如gibco#12604013，或與其組成相同的其他產(chǎn)品）。所述“tryple?express?enzyme?(1x),?no?phenol?red”中含有200mg/l的kcl、200mg/l的kh2po4、8000mg/l的nacl、2160mg/l的na2hpo4·7h2o、457.6mg/l的edta；還含有重組蛋白酶。

39、進(jìn)一步地，所述消化終止液由胎牛血清、抗真菌劑三抗和dmem培養(yǎng)基組成；其中，所述抗菌抗真菌劑三抗為青霉素、鏈霉素和兩性霉素b；在所述消化終止液中，所述胎牛血清的終濃度為8-12％（如10%）體積百分含量；所述抗菌抗真菌劑三抗中的青霉素的終濃度為100-200u/ml（如100u/ml），鏈霉素的終濃度為100-200μg/ml（如100μg/ml），兩性霉素b的終濃度為200-250ng/ml（如250ng/ml）；余量均為dmem培養(yǎng)基。

40、進(jìn)一步地，所述細(xì)胞凍存液由advanced?dmem/f12培養(yǎng)基、dmso和1％甲基纖維素溶液組成；其中，所述advanced?dmem/f12培養(yǎng)基、所述dmso和所述1％甲基纖維素溶液的體積配比為20:2:(0.8-1.2)，如20:2:1；所述1％甲基纖維素溶液是濃度為1g/100ml的甲基纖維素水溶液。

41、第三方面，本發(fā)明要求保護(hù)前文第一方面中所述的培養(yǎng)基或前文第二方面中所述成套試劑在構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型中的應(yīng)用。

42、其中，所述頭頸部腫瘤可為頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤或者口腔頜面腫瘤，從病理學(xué)上可分為鱗癌和腺癌。在本發(fā)明的實(shí)施案例中，所述頭頸部腫瘤為喉癌、鼻咽癌或甲狀腺癌。

43、第四方面，本發(fā)明要求保護(hù)一種構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的方法。

44、本發(fā)明要求保護(hù)的構(gòu)建頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的方法，可包括如下步驟：

45、（a1）用前文第二方面中所述的樣本解離液對(duì)頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離處理；

46、（a2）利用前文第一方面中所述培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)步驟（a1）解離出來的單細(xì)胞，形成細(xì)胞團(tuán)，即得頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型。

47、進(jìn)一步地，在步驟（a1）中，可按照包括如下步驟的方法用所述樣本解離液對(duì)所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離：按1ml所述樣本解離液不超過0.5mg組織的用量，將剪碎后的所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織用所述樣本解離液在37℃條件下進(jìn)行樣本解離，解離時(shí)間15分鐘至2小時(shí)（如1小時(shí)）。

48、進(jìn)一步地，步驟（a2）中，可按照包括如下步驟的方法用所述培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)（a1）解離出來的細(xì)胞：使用低吸附表面的細(xì)胞培養(yǎng)容器，利用所述培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)（a1）解離出來的細(xì)胞，37℃、5％co2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

49、其中，初始接種密度可為105個(gè)/?cm2容器底面積，以六孔板為例，按每孔106個(gè)細(xì)胞的密度鋪板。

50、進(jìn)一步地，步驟（a2）中培養(yǎng)的時(shí)間為3-5天。

51、進(jìn)一步地，在步驟（a1）之前，還可包括如下對(duì)所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離前處理的步驟：用體積百分含量為70-75％（如75%）的乙醇清洗頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織樣本表面10-30秒；用前文第二方面中所述樣本清洗液清洗所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織樣本5-10次（如5次），用無(wú)菌的pbs溶液清洗所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織樣本5-10次（如5次）；然后除去所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織樣本中的雜質(zhì)、結(jié)締組織、脂肪組織、壞死組織等影響微腫瘤培養(yǎng)的成分。

52、對(duì)所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離前處理的步驟需要在冰上操作，整個(gè)操作步驟需要在10分鐘內(nèi)完成。

53、進(jìn)一步地，在步驟（a1）中，用所述樣本解離液對(duì)所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織進(jìn)行解離處理后還包括如下步驟：用8-15倍（如10倍）體積的前文第二方面中所述消化終止液終止解離反應(yīng)，收集細(xì)胞懸液；用100μm或40μm無(wú)菌細(xì)胞濾網(wǎng)過濾所述細(xì)胞懸液，去除組織殘片和粘連細(xì)胞；800-1000g（如800g）室溫離心10-15分鐘（如10分鐘），棄去上清；后用3-5ml（如5ml）無(wú)菌pbs重懸細(xì)胞；再800-1000g（如800g）室溫離心10-15分鐘（如10分鐘），棄去上清；然后用前文第一方面中所述培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

54、進(jìn)行所述解離前處理的所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織樣本的離體時(shí)間為12小時(shí)以內(nèi)，且在進(jìn)行所述解離前處理之前一直保存于前文第二方面中所述樣本保存液中。

55、其中，所述頭頸部腫瘤可為頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤或者口腔頜面腫瘤，從病理學(xué)上可分為鱗癌和腺癌。在本發(fā)明的實(shí)施案例中，所述頭頸部腫瘤為喉癌、鼻咽癌或甲狀腺癌。

56、第五方面，本發(fā)明要求保護(hù)利用前文第四方面中所述方法得到的頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型。

57、第六方面，本發(fā)明要求保護(hù)一種獲得頭頸部腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞的方法。

58、本發(fā)明要求保護(hù)的獲得頭頸部腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞的方法，是從利用前文第四方面中所述方法得到的頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型中分離得到頭頸部腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞。

59、所述方法具體可包括如下步驟：

60、（b1）采用細(xì)胞消化液（如前文所述細(xì)胞消化液）對(duì)所述頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型進(jìn)行消化處理，得到單細(xì)胞；

61、進(jìn)一步地，還包括終止消化的步驟。如采用前文所述消化終止液終止消化。

62、（b2）從步驟（b1）所得單細(xì)胞中分選出cd326陽(yáng)性細(xì)胞，即得所述頭頸部腫瘤實(shí)體瘤原代細(xì)胞。

63、進(jìn)一步地，可通過cd326磁珠分選cd326陽(yáng)性細(xì)胞。

64、在上述各方面中，所述頭頸部腫瘤具體可為各種病理分型的原發(fā)性頭頸部腫瘤或繼發(fā)性頭頸部腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，手術(shù)標(biāo)本重量超過20mg的樣本。

65、在本發(fā)明中，以上所有的所述pbs均可為1×pbs，ph7.3-7.5。其具體組成如下：溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為：kh2po4144mg/l，nacl?9000?mg/l，na2hpo4·7h2o?795?mg/l。

66、本發(fā)明提供了一種從新鮮頭頸部腫瘤實(shí)體瘤組織中提取培養(yǎng)頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型的方法和配套試劑，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

67、1、組織樣本用量少，僅需20mg左右的頭頸部腫瘤手術(shù)樣本；

68、2、培養(yǎng)周期短，僅需2-3天即可獲得104-106數(shù)量級(jí)的頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型；

69、3、培養(yǎng)穩(wěn)定性高，用本方法對(duì)合格的頭頸部腫瘤手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行體外培養(yǎng)的成功率高達(dá)90%；

70、4、細(xì)胞類型豐富，頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型可以保存原病灶中的腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，很好地再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境；

71、5、頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型可以準(zhǔn)確再現(xiàn)原病灶的病理亞型；

72、6、頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型可以準(zhǔn)確再現(xiàn)原病灶的遺傳背景。

73、利用本發(fā)明方法得到的頭頸部腫瘤體外3d微腫瘤模型可以準(zhǔn)確反應(yīng)患者原病灶的各種特征，是腫瘤精準(zhǔn)診療領(lǐng)域良好的科研實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床前實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。可以預(yù)見，這種培養(yǎng)方法在頭頸部腫瘤的研究和臨床診斷治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。