本發(fā)明涉及基因工程，特別是涉及地梢瓜 ctpds基因及其vigs病毒載體和沉默方法。

背景技術(shù)：

1、地梢瓜[ cynanchum?thesioides（freyn）k.?schum.]是蘿藦科鵝絨藤屬植物，直立半灌木；地下莖單軸橫生；莖自基部多分枝。在中國(guó)分布于內(nèi)蒙古、東北、新疆等地，生長(zhǎng)于干旱沙地、荒地、田邊等處?？勺鳛橐环N藥、食、飼用資源，也可用于荒坡、荒地治理。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、便捷、快速的地梢瓜基因功能驗(yàn)證技術(shù)方案對(duì)地梢瓜的遺傳改良具有重要作用。

2、病毒誘導(dǎo)的基因沉默具有操作簡(jiǎn)便、研究周期短、不需遺傳轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，已在多種單、雙子葉植物中廣泛應(yīng)用，它基于植物對(duì)病毒基因復(fù)制的防御機(jī)制，綜合植物病毒的非轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)性侵染、植物的免疫應(yīng)答機(jī)制于一體，可以簡(jiǎn)易快速且高效的沉默靶向基因，極大地方便了植物基因功能的反向遺傳學(xué)研究，與傳統(tǒng)的基因功能分析方法相比，病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced?genesilencing，vigs）能夠在侵染植物當(dāng)代對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行沉默和功能分析，無(wú)需開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，并且具有沉默單個(gè)或多個(gè)基因家族成員的潛力。

3、八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene?desaturase，pds）是類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵酶，當(dāng)類胡蘿卜素合成途徑被阻斷后，植物出現(xiàn)白化現(xiàn)象，常作為表型對(duì)照來(lái)監(jiān)測(cè)沉默效果，是用于開(kāi)發(fā)vigs沉默技術(shù)的一個(gè)非常重要的基因。而當(dāng)前地梢瓜基因功能研究還比較滯后，地梢瓜的八氫番茄紅素脫氫酶及編碼序列并不明確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了地梢瓜 ctpds基因及其vigs病毒載體和沉默方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了地梢瓜八氫番茄紅素脫氫酶的氨基酸序列及其編碼基因 ctpds的序列，在此基礎(chǔ)上，提供了一種沉默 ctpds基因的靶標(biāo)核酸分子、vigs沉默體系和沉默方法，能夠有效降低地梢瓜 ctpds基因的表達(dá)水平，并使地梢瓜葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降，為地梢瓜基因的功能驗(yàn)證提供重要技術(shù)支撐。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種地梢瓜的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明提供了編碼上述技術(shù)方案所述八氫番茄紅素脫氫酶的 ctpds基因，所述 ctpds基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、本發(fā)明提供了沉默上述技術(shù)方案所述的 ctpds基因在降低地梢瓜葉片中葉綠素含量和/或類胡蘿卜素含量中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明提供了一種沉默上述技術(shù)方案所述 ctpds基因的靶標(biāo)核酸分子，所述靶標(biāo)核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.13所示。

7、本發(fā)明提供了一種沉默上述技術(shù)方案所述 ctpds基因的vigs病毒載體，所述vigs病毒載體包括上述技術(shù)方案所述的靶標(biāo)核酸分子。

8、優(yōu)選的，所述vigs病毒載體的骨架載體包括ptrv2載體。

9、本發(fā)明提供了一種沉默上述技術(shù)方案所述 ctpds基因的工程菌，所述工程菌包括上述技術(shù)方案所述的vigs病毒載體。

10、本發(fā)明提供了一種沉默上述技術(shù)方案所述 ctpds基因的侵染菌液，所述侵染菌液包括上述技術(shù)方案所述的工程菌。

11、優(yōu)選的，所述侵染菌液還包括含有輔助載體的工程菌；所述輔助載體包括ptrv1載體；所述侵染菌液的od600值為0.8~1.0。

12、本發(fā)明提供了一種沉默上述技術(shù)方案所述 ctpds基因的方法，包括：將上述技術(shù)方案所述侵染菌液注射到地梢瓜幼苗頂端分生組織中。

13、有益效果：

14、本發(fā)明提供了一種地梢瓜的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了地梢瓜八氫番茄紅素脫氫酶的氨基酸序列及其編碼基因 ctpds的序列，在此基礎(chǔ)上，提供了一種沉默 ctpds基因的靶標(biāo)核酸分子、vigs沉默體系和沉默方法。利用本發(fā)明提供的方法構(gòu)建的 ctpds基因沉默植株的葉片 ctpds基因表達(dá)水平顯著降低，沉默效率達(dá)到56%~65%，葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降，葉片出現(xiàn)白化表型，為開(kāi)展地梢瓜關(guān)鍵基因的功能研究提供了技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種地梢瓜的八氫番茄紅素脫氫酶，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述八氫番茄紅素脫氫酶的ctpds基因，其特征在于，所述ctpds基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.沉默權(quán)利要求2所述的ctpds基因在降低地梢瓜葉片中葉綠素含量和/或類胡蘿卜素含量中的應(yīng)用。

4.一種沉默權(quán)利要求2所述ctpds基因的靶標(biāo)核酸分子，其特征在于，所述靶標(biāo)核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.13所示。

5.一種沉默權(quán)利要求2所述ctpds基因的vigs病毒載體，其特征在于，所述vigs病毒載體包括權(quán)利要求4所述的靶標(biāo)核酸分子。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的vigs病毒載體，其特征在于，所述vigs病毒載體的骨架載體包括ptrv2載體。

7.一種沉默權(quán)利要求2所述ctpds基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括權(quán)利要求5或6所述的vigs病毒載體。

8.一種沉默權(quán)利要求2所述ctpds基因的侵染菌液，其特征在于，所述侵染菌液包括權(quán)利要求7所述的工程菌。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的侵染菌液，其特征在于，所述侵染菌液還包括含有輔助載體的工程菌；所述輔助載體包括ptrv1載體；所述侵染菌液的od600值為0.8~1.0。

10.一種沉默權(quán)利要求2所述ctpds基因的方法，其特征在于，包括：將權(quán)利要求8或9所述侵染菌液注射到地梢瓜幼苗頂端分生組織中。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及地梢瓜CtPDS基因及其VIGS病毒載體和沉默方法。本發(fā)明提供了一種地梢瓜的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了地梢瓜八氫番茄紅素脫氫酶的氨基酸序列及其編碼基因CtPDS的序列，在此基礎(chǔ)上，提供了一種沉默CtPDS基因的靶標(biāo)核酸分子、VIGS沉默體系和沉默方法。利用本發(fā)明提供的方法構(gòu)建的CtPDS基因沉默植株的葉片CtPDS基因表達(dá)水平顯著降低，沉默效率達(dá)到56%~65%，葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著下降，葉片出現(xiàn)白化表型，為開(kāi)展地梢瓜關(guān)鍵基因的功能研究提供了技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：楊忠仁,常小瑤,張曉艷,張鳳蘭,張東,盧旭東,唐嘉駿,張國(guó)然,李曉杰,張益然
受保護(hù)的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9