本發(fā)明屬于病原體檢測，尤其涉及一種單孔檢測多種呼吸道病原體核酸的試劑盒及其預使用方法。

背景技術：

1、呼吸道感染是臨床最常見的疾病之一，發(fā)病率居急性傳染病的首位，一般由細菌和病毒引起，其中大約90％為呼吸道病毒所導致，這些病原體感染都會導致發(fā)熱、咳嗽、肺炎或白細胞不明顯升高等類似臨床癥狀。急性呼吸道感染往往是病毒和細菌混合感染或者繼發(fā)感染，或單一及多種病毒感染，隨著病情的持續(xù)發(fā)展，混合感染現(xiàn)象較為普遍。這給患者病情的控制和病原體的確定增加了難度。因此，早診斷、早治療、早隔離是防治的根本。而只有明確鑒別引起呼吸道感染的病原體后，才便于進行針對性的治療，提高療效、降低患者負擔，并有效減少抗生素的濫用。

2、目前呼吸道病原體的檢測方法有很多種，主要包括病毒培養(yǎng)、血清學檢測和分子生物學檢測。其中，病毒培養(yǎng)和血清學檢測由于耗時長、靈敏度低、培養(yǎng)要求高且容易出現(xiàn)假陰性。常用的分子生物學方法包括普通pcr、巢式pcr、熒光定量pcr和恒溫擴增等。對于呼吸道多種病原體的檢測，由于受到檢測通道的限制，一般由多管試劑構成，不僅操作繁瑣、操作時間較長，而且通量也會降低。因此，核酸多重檢測方案孕育而生，目前主要有：固相/液相芯片法、溶解曲線分析法、質譜法、片段分析法等。多重pcr體系中同時含有多條引物、探針或者分子信標，反應體系復雜；且可能會出現(xiàn)多個靶點之間擴增條件不兼容，擴增位點相互的抑制，以及多條引物、探針之間相互干擾的情況。這些因素都會導致實驗難度急劇增大，檢測的靈敏度和準確度不佳，所以如何既能簡化多重pcr反應體系的復雜度又能保證多靶標檢測的性能是解決多重pcr檢測應用的關鍵。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測特異性好、靈敏度高、重復性好且檢測準確性高的可用于同時檢測多種病原菌的多重rt-pcr試劑盒。

2、本發(fā)明提供了一種單孔檢測多種呼吸道病原體核酸的試劑盒，包括2～5種引物組合和成膜劑；所述成膜劑為聚乙烯蠟；每一種引物組合包括若干引物對，所述引物對用于擴增特定的呼吸道病原體核酸。

3、優(yōu)選的，所述聚乙烯蠟由熱塑性樹脂和石蠟制備而成，所述熱塑性樹脂的熔程為95～107℃，熔點為96℃～100℃。

4、優(yōu)選的，所述聚乙烯蠟的分子量為1000～3500，所述聚乙烯蠟的純度≧95％。

5、優(yōu)選的，檢測的呼吸道病原體包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒、副流感病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、肺炎支原體和衣原體。

6、優(yōu)選的，當所述試劑盒包括兩種引物組合時，第一種引物組合包括：

7、擴增冠狀病毒oc43的引物對，如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；擴增冠狀病毒229e的引物對，如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示；擴增冠狀病毒nl63的引物對，如seq?idno.5和seq?id?no.6所示；擴增季節(jié)性甲型流感病毒h3n2的引物對，如seq?id?no.7和seqid?no.8所示；擴增博卡病毒的引物對，如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示；擴增甲型流感病毒h7n9的引物對，如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示；擴增肺炎支原體的引物對，如seq?id?no.13和seq?id?no.14所示；擴增sars-cov的引物對，如seq?id?no.15和seq?idno.15所示；擴增呼吸道合胞病毒b組的引物對，如seq?id?no.17和seq?id?no.18所示；擴增副流感病毒3型的引物對，如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示；擴增鼻病毒2型的引物對，如seq?id?no.21和seq?id?no.22所示；擴增沙眼衣原體的引物對，如seq?id?no.23和seqid?no.24所示；擴增肺炎衣原體的引物對，如seq?id?no.25和seq?id?no.26所示；

8、第二種引物組合包括：

9、擴增冠狀病毒hku1的引物對，如seq?id?no.27和seq?id?no.28所示；擴增甲型流感病毒h1n1(2009)的引物對，如seq?id?no.29和seq?id?no.30所示；擴增甲型流感病毒h1n1的引物對，如seq?id?no.31和seq?id?no.32所示；擴增甲型流感病毒h5n2的引物對，如seq?id?no.33和seq?id?no.34所示；擴增甲型流感病毒h3n2的引物對，如seq?id?no.35和seq?id?no.36所示；擴增偏肺病毒hmpv的引物對，如seq?id?no.37和seq?id?no.38所示；擴增呼吸道合胞病毒a組的引物對，如seq?id?no.39和seq?id?no.40所示；擴增乙型流感病毒yamagata株的引物對，如seq?id?no.41和seq?id?no.42所示；擴增乙型流感病毒victoria株的引物對，如seq?id?no.43和seq?id?no.44所示；擴增副流感病毒1型的引物對，如seqid?no.45和seq?id?no.46所示；擴增副流感病毒2型的引物對，如seq?id?no.47和seq?idno.48所示；擴增副流感病毒4型的引物對，如seq?id?no.49和seq?id?no.50所示；擴增鼻病毒1型的引物對，如seq?id?no.51和seq?id?no.52所示；擴增腺病毒b組的引物對，如seq?idno.53和seq?id?no.54所示；擴增腺病毒c組的引物對，如seq?id?no.55和seq?id?no.56所示；擴增腺病毒e組的引物對，如seq?id?no.57和seq?id?no.58所示。

10、優(yōu)選的，所述試劑盒還包括pcr反應預混液、陰性對照品和陽性對照品。

11、本發(fā)明提供了所述試劑盒的預使用方法，將第一種引物組合、pcr反應預混液、水和待檢測樣本的核酸提取物混合形成第一反應體系，然后將成膜劑添加到第一反應體系的表層形成隔離層，最后將第二種引物組合、pcr反應預混液、水和待檢測樣本的核酸提取物混合于隔離層上方，形成第二反應體系。

12、本發(fā)明還提供了使用所述試劑盒進行多重rt-pcr檢測多種呼吸道病原體核酸中的擴增體系，包括以下組成：

13、

14、優(yōu)選的，第一種引物組合或第二種引物組合中每一條引物在反應體系中的終濃度為50～250nm。

15、本發(fā)明還提供了所述的擴增體系對應的擴增程序，擴增程序如下：

16、

17、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

18、本發(fā)明通過分析呼吸道病原體的基因組序列，選擇合適的目的基因片段，設計了多組不同的pcr引物，以此構建可用于同時檢測上述病原體的多重pcr試劑盒。但在檢測所設引物的檢測效果時發(fā)現(xiàn)，引物本身、以及引物間二聚體，交叉干擾等因素都會影響多重pcr檢測體系的準確性和靈敏度。例如，個別引物的檢測特異性不佳；將不同的引物組合在一起后，其檢測效果相較于其單獨使用時明顯下降。為了解決這個問題，本發(fā)明將反應分為兩個體系，用成膜劑隔開，在同一個反應管內進行兩個反應體系的擴增，多重擴增完成后，加熱融化隔離膜，使兩組擴增產物混合，然后進行擴增產物的檢測，本發(fā)明成功構建得到了一個檢測特異性好、靈敏度高、重復性好且檢測準確性高的可用于同時檢測多種病原菌的多重rt-pcr試劑盒。

19、本發(fā)明提供的試劑盒適用于臨床急性呼吸道感染病例的篩查，單次檢測可以實現(xiàn)29種可能感染類型的同時篩查，極大降低了檢測成本，節(jié)省檢測時間，適用于臨床常規(guī)檢測以及應對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應急檢測。

20、本發(fā)明實施例結果表明，本發(fā)明提供的試劑盒具備多重檢測能力，能實現(xiàn)復合感染樣品的檢測；同時可以實現(xiàn)低濃度樣品檢測，靈敏度可達到10copies/反應。