本發(fā)明涉及外泌體提取，具體是指一種組織外泌體的提取方法。

背景技術(shù)：

1、目前外泌體的研究方法主要是從細胞培養(yǎng)液中分離外泌體，或從體液中分離外泌體，然后進行下一步的研究。然而組織內(nèi)外泌體的研究是對體外外泌體研究的補充，相對更能體現(xiàn)相應(yīng)生理或病理條件下組織或器官內(nèi)外泌體的成分和功能變化?，F(xiàn)在從組織中提取外泌體的研究較少，主要是由于組織外泌體是該組織中多種細胞分泌的外泌體混合物，難以確定單獨某種細胞分泌的外泌體的功能，另外一個原因是組織外泌體分離方法還有待進一步開發(fā)，現(xiàn)存的從組織中提取外泌體的方法很難避免破壞細胞，從而導致外泌體樣品中存在胞內(nèi)物質(zhì)的污染。

2、根據(jù)外泌體特有的物理化學性質(zhì)，如密度、大小、形態(tài)、標志物蛋白、親疏水性等特性，可以采用不同的方法或者多種方法結(jié)合對外泌體進行分離提取。但由于外泌體來源的生物流體具有復雜性，是胞外囊泡和其他胞外物質(zhì)的混合物，且外泌體和其他胞外囊泡的理化性質(zhì)存在重疊，同時外泌體自身之間存在異質(zhì)性，使用這些方法也無法完全分離外泌體。目前，外泌體分離和分析方法缺乏標準化，開發(fā)高得率、高特異性、可重復、快速有效的外泌體分離方法仍然是挑戰(zhàn)。

3、目前組織外泌體的提取方法主要是膠原酶酶解法。或直接用液體浸潤組織釋放外泌體等方法，其中利用較多的膠原酶酶解法利用膠原酶酶解細胞間質(zhì)中的膠原蛋白，使細胞之間黏附降低從而相互分離，進而釋放外泌體。膠原酶酶解法存在一些缺點，如膠原酶需要在37℃發(fā)揮作用，而溫度過高可能會不利于外泌體的保存，購買的膠原酶中可能含有其他種類的酶對實驗產(chǎn)生影響，另外不同批次的膠原酶由于保存或運輸?shù)脑蚧钚詴兓?，不好把握消化的時間，可能導致消化時間不夠或者過長，從而使外泌體釋放較少或消化過度破壞細胞。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決上述技術(shù)問題，提供一種組織外泌體的提取方法。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

3、一種組織外泌體的提取方法，包括以下步驟：

4、s1、動物管理：

5、選取大鼠，動物飼養(yǎng)遵循12小時光照及12小時晝夜處理，自由飲食飲水；

6、s2、動物麻醉與前處理：

7、對大鼠麻醉徹底后固定在手術(shù)架，小心剃除腹部絨毛，進行消毒后，緊貼腹部蓋上一層干凈的保鮮膜；

8、s3、灌流取肝：

9、采用十字開刀法暴露腹腔，注射針頭由肝門靜脈插入，縫合線固定好之后，用恒流泵以每分鐘5毫升的流量灌流冰冷的生理鹽水，灌流開始立即剪開胸膈膜，處死大鼠，當肝臟沖洗到發(fā)白后剪取肝臟，置冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

10、s4、螯合：

11、稱取1g左右的肝臟置于細胞培養(yǎng)皿中，按質(zhì)量：體積比1：10加入ph7.4含0.5％edta-2na的pbs溶液，在冰上用手術(shù)刀片將肝臟切成2×2×2毫米的小塊，隨后將培養(yǎng)皿置于水平搖床4℃螯合30min，螯合結(jié)束后加入等體積的dmem培養(yǎng)基，以補充被螯合的鈣離子等陽離子，隨后將培養(yǎng)皿中的組織塊及上清轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，置冰上保存?zhèn)溆茫?/p>

12、s5、差速離心提取外泌體：

13、將螯合得到的組織混合液于3-6℃，250-350g離心，以除去組織塊及細胞碎片；隨后將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中于3-6℃，1500-2500g離心，進一步除去死細胞及細胞碎片；再次將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中于3-6℃，9000-11000g離心，以除去大囊泡和線粒體的污染，獲得的上清液過0.20-0.24μm濾膜，將濾液于3-6℃，99000-103000g離心1.5-2.5h，得到的沉淀用pbs重懸，然后再次于3-6℃，99000-103000g離心1.5-2.5h，得到的沉淀用90-110μlpbs重懸保存于-80℃，即為制備的外泌體樣品。

14、優(yōu)選地，所述的大鼠肝臟經(jīng)稱重后，按1g:10ml的比例加入ph7.4含0.5％edta-2na的pbs溶液，并置于冰上將肝臟切成2×2×2毫米的小塊。

15、優(yōu)選地，所述的上清液依次進行300g、2000g、10000g離心且離心的時間分別為10min、20min和60min。

16、優(yōu)選地，所述的外泌體樣品通過透射電鏡鑒定法、粒徑鑒定法或分子標記物鑒定法中的一種或者多種組合的方式進行鑒定。

17、優(yōu)選地，所述的edta-2na的制作方法如下：

18、第一步，準備原料：

19、制備乙二胺四乙酸二鈉的主要原料是乙二胺和四乙酸，其中乙二胺為固體，四乙酸為液體，加入輔助材料，

20、第二步，制備四乙酸酐：

21、將四乙酸加入反應(yīng)釜中，加熱至100℃，并加入過氧化氫作為催化劑，在氧氣氣氛下反應(yīng)3-4小時，得到四乙酸酐；

22、第三步，制備乙二胺四乙酸：

23、將四乙酸酐和乙二胺以1:1.3的比例混合，加熱至180-200℃，反應(yīng)2-3小時，反應(yīng)物在加熱過程中會發(fā)生水的脫除反應(yīng)，形成乙二胺四乙酸，反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物冷卻并加入氫氧化鈉溶液中中和，得到乙二胺四乙酸二鈉的初步產(chǎn)物；

24、第四步，精制：

25、將初步產(chǎn)物溶于水中，過濾得到濾液，濾液中加入硝酸，調(diào)節(jié)ph值至8.0左右，然后慢慢加入碳酸鈉溶液，直到生成白色沉淀，再進行反應(yīng)、沉淀、過濾步驟，最終得到edta-2na。

26、優(yōu)選地，所述的輔助材料為過氧化氫、氫氧化鈉、硝酸中的一種或者多種組合。

27、優(yōu)選地，所述的肝臟可替換為腎、脾或肺。

28、采用以上方法后，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

29、本發(fā)明利用edta-2na螯合法，使大部分黏著因子失去作用，使組織細胞與細胞之間離散，從而釋放胞外基質(zhì)中的外泌體，然后采用差速超速離心的方法分離大鼠肝組織中的外泌體。通過蛋白質(zhì)組學結(jié)果顯示edta-2na螯合法提取到的蛋白種類更多，同時可以得到更多的外泌體蛋白，edta-2na螯合法提取的大鼠肝組織外泌體純度較高。并且edta-2na螯合法簡單易行，效果穩(wěn)定，4℃進行操作相較于膠原酶法37℃操作能更好的保持外泌體的活性，edta-2na原材料來源廣泛保存方便。

30、上述概述僅僅是為了說明書的目的，并不意圖以任何方式進行限制。除上述描述的示意性的方面、實施方式和特征之外，通過參考附圖和以下的詳細描述，本發(fā)明進一步的方面、實施方式和特征將會是容易明白的。

技術(shù)特征：

1.一種組織外泌體的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織外泌體的提取方法，其特征在于：所述的大鼠肝臟經(jīng)稱重后，按1g:10ml的比例加入ph7.4含0.5％edta-2na的pbs溶液，并置于冰上將肝臟切成2×2×2毫米的小塊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織外泌體的提取方法，其特征在于：所述的上清液依次進行300g、2000g、10000g離心且離心的時間分別為10min、20min和60min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織外泌體的提取方法，其特征在于：所述外泌體樣品通過透射電鏡鑒定法、粒徑鑒定法或分子標記物鑒定法中的一種或者多種組合的方式進行鑒定。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織外泌體的提取方法，其特征在于：所述的edta-2na的制作方法如下：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種組織外泌體的提取方法，其特征在于：所述的輔助材料為過氧化氫、氫氧化鈉、硝酸中的一種或者多種組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織外泌體的提取方法，其特征在于：所述的肝臟可替換為腎、脾或肺。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種組織外泌體的提取方法，屬于外泌體提取技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明利用乙二胺四乙酸二鈉螯合鈣離子或鎂離子，使大部分黏著因子失去作用，使組織細胞與細胞之間離散，從而釋放胞外基質(zhì)中的外泌體，然后采用差速超速離心的方法分離大鼠肝組織中的外泌體。通過蛋白質(zhì)組學結(jié)果顯示EDTA?2Na螯合法提取到的蛋白種類更多，同時可以得到更多的外泌體蛋白，EDTA?2Na螯合法提取的大鼠肝組織外泌體純度較高。并且EDTA?2Na螯合法簡單易行，效果穩(wěn)定，4℃進行操作相較于膠原酶法37℃操作能更好的保持外泌體的活性，EDTA?2Na原材料來源廣泛保存方便。

技術(shù)研發(fā)人員：陳海燕,陳平,劉中華,楊長城
受保護的技術(shù)使用者：湖南師范大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9