本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種油茶snp分子標記組合及其應用。

背景技術：

1、油茶是重要的油料樹種之一，與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料樹種，是木本食用油料產(chǎn)業(yè)中不可或缺的重要支柱。長期以來，油茶因生長周期太長，導致育種技術相對落后，遺傳改良進展緩慢，且缺少已開發(fā)成熟的油茶可用的基因分型產(chǎn)品。因此，利用高效的現(xiàn)代分子育種技術手段，開發(fā)一款經(jīng)濟、合適的基因分型產(chǎn)品能有效解決油茶育種現(xiàn)存的困境，有效提高油茶育種效率，加快油茶良種選育的進程，培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)以及抗逆性強的優(yōu)良品種，確保油茶產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

2、單核苷酸多態(tài)性(snp)是指基因組水平上由單堿基突變所引起的一種dna序列多態(tài)性。具有分布廣、穩(wěn)定性高和易于實現(xiàn)自動化分析的特點，使得它成為研究遺傳變異、進行分子育種和種質(zhì)資源評估的理想工具。目前，用于snp位點分型的基因芯片主要包括固相芯片和液相芯片，傳統(tǒng)的固相芯片是基于探針與dna序列的互補雜交，通過標記物的熒光顯色信號進行分型。液相芯片則是基于靶向測序技術原理，為每個待測位點設計的一條生物素(biotin)標記、覆蓋目標snp的探針，這些探針在液態(tài)中與基因組目標區(qū)域雜交形成雙鏈，再利用鏈霉親和素包衣的磁珠與帶有生物素的分子的吸附作用，經(jīng)洗脫、擴增、建庫之后進行二代測序，最終獲得目標位點及其周圍snp的基因分型結(jié)果，具有檢測準確性高、通量大的優(yōu)點。目前被廣泛應用于遺傳多樣性分析、全基因組關聯(lián)分析、全基因組選擇育種、基因/qtl定位、種質(zhì)資源開發(fā)評價和dna指紋鑒定。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明提出一種油茶snp分子標記組合。

2、本發(fā)明還提出一種用于檢測上述油茶snp分子標記組合的液相芯片。

3、本發(fā)明還提出一種用于檢測上述油茶snp分子標記組合的試劑盒。

4、本發(fā)明還提出一種上述油茶snp分子標記組合的篩選方法。

5、本發(fā)明還提出一種上述油茶snp分子標記組合、液相芯片或試劑盒的應用。

6、本發(fā)明還提出一種油茶的育種方法。

7、根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提出了一種油茶snp分子標記組合，包括50,454個snp分子標記中的至少一種，所述50,454個snp分子標記的物理位置是基于油茶參考基因組gca_039905865.1進行序列比對確定的，位點信息具體如下表1所示。

8、表1

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33、在本發(fā)明的第二方面，提出了一種液相芯片，所述液相芯片包含用于檢測上述的油茶snp分子標記組合的引物組和/或探針。

34、在本發(fā)明的第三方面，提出了一種試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測上述的油茶snp分子標記組合的引物組和/或探針。

35、在本發(fā)明的第四方面，提出了上述油茶snp分子標記組合的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：

36、(1)使用sentieon軟件對油茶樣本的全基因組測序數(shù)據(jù)進行比對和變異檢測，進行初步硬過濾，得到包含所有樣本snp變異信息的文件；

37、(2)對所述包含所有樣本snp變異信息的文件進行挖掘并篩選得到靶位點snp；所述挖掘并篩選參數(shù)為：maf≥0.05、檢出率≥90％、雜合≤45％、depth≥10×；

38、(3)對油茶樣本的表型性狀數(shù)據(jù)進行收集整理；對所述表型性狀數(shù)據(jù)進行全基因組關聯(lián)分析，得到性狀關聯(lián)的snp位點；所述表型性狀數(shù)據(jù)包括含油率、脂肪酸組成、抗病性和果實特性數(shù)據(jù)；

39、(4)基于所述包含所有樣本snp變異信息的文件，對不同油茶品種的每個snp變異位點進行群體間遺傳分化指數(shù)計算；參數(shù)為--weir-fst-pop，按照fst>0.8的閾值進行過濾，篩選得到油茶品種特異性snp位點；

40、(5)基于所述包含所有樣本snp變異信息的文件，提取得到與油脂合成相關的基因的snp位點；

41、(6)基于所述包含所有樣本snp變異信息的文件，提取得到與果皮薄厚、果實大小、育性及炭疽病抗性相關的基因的snp位點；

42、(7)對步驟(2)得到的靶位點snp、步驟(3)得到的性狀關聯(lián)的snp位點、步驟(4)得到的油茶品種特異性snp位點、步驟(5)得到的與油脂合成相關的基因的snp位點和步驟(6)得到的與果皮薄厚、果實大小、育性及炭疽病抗性相關的基因的snp位點，進行探針設計，篩選探針符合要求的snp，得到油茶snp分子標記組合。

43、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶樣本的品種包括油茶古樹、湖南油茶、衡東油茶、江西油茶、浙江油茶、湖北油茶、福建油茶、廣西油茶、攸縣油茶、狹葉油茶、小果油茶、博白大果油茶中的至少一種。

44、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶包括二倍體油茶、四倍體油茶、六倍體油茶和八倍體油茶。

45、在本發(fā)明的一些實施方式中，使用sentieon軟件對油茶樣本的全基因組測序數(shù)據(jù)進行比對和變異檢測具體包括以下步驟：

46、(1)使用sentieon軟件將所述油茶樣本的全基因組測序數(shù)據(jù)比對至油茶參考基因組gca_039905865.1，進行位置排序和標記重復reads；

47、(2)使用sentieon軟件對每個樣本進行變異位點檢測，獲得每個樣本的gvcf；

48、(3)使用sentieon進行joint-calling，對所有樣本的gvcf進行聯(lián)合分析，得到群體中每個個體的變異結(jié)果。

49、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述硬過濾的標準如下：qd<2.0||fs>60.0||mq<40.0||sor>3.0||mqranksum<-12.5||readposranksum<-8.0。

50、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述全基因組關聯(lián)分析包括以下步驟：利用r包rmvp進行全基因組關聯(lián)分析；所述r包rmvp包含一般線性模型(glm)和混合線性模型(mlm)；將親緣關系矩陣和主成分當做協(xié)變量加入模型進行校正，全基因組水平顯著閾值為0.04-0.06。

51、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶品種包括狹葉油茶和小果油茶。

52、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的長度為80-120bp。

53、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的長度約為100bp。

54、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的gc含量在20％-80％之間。

55、在本發(fā)明的一些實施方式中，篩選探針符合要求的snp包括以下步驟：對探針進行設計，去除在基因組上無法唯一比對、側(cè)翼序列中包含重復序列的探針。

56、在本發(fā)明的一些實施方式中，過濾的標準如下：qd<2.0||fs>60.0||mq<35.0||mqranksum<-12.5||read?posranksum<-8.0||dp>6950。

57、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的長度為80-120bp。

58、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的長度約為100bp。

59、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的gc含量在20％-80％之間。

60、在本發(fā)明的一些實施方式中，篩選探針符合要求的snp包括以下步驟：對探針進行設計，去除在基因組上無法唯一比對、側(cè)翼序列中包含重復序列的探針。

61、在本發(fā)明的第五方面，提出了上述油茶snp分子標記組合、液相芯片和試劑盒中的至少一種的應用，所述應用為在油茶全基因組選擇育種中的應用。

62、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用為在油茶的全基因組關聯(lián)分析中的應用。

63、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用為在油茶的種質(zhì)資源和品種鑒定中的應用。

64、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用為在油茶的聚類分析及親緣關系鑒定中的應用。

65、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用為在油茶重要性狀挖掘和鑒定中的應用。

66、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用為在油茶的基因分型檢測中的應用。

67、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用為在油茶的分子設計育種中的應用。

68、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述應用具體可以通過以下方法實現(xiàn)：

69、s1、采用油茶snp分子標記組合、液相芯片和試劑盒中的至少一種對待測試的樣本進行基因型分型，獲得基因型分型結(jié)果；

70、s2、對步驟s1獲得的基因型分型結(jié)果進行分析。

71、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶的品種包括油茶古樹、湖南油茶、衡東油茶、江西油茶、浙江油茶、湖北油茶、福建油茶、廣西油茶、攸縣油茶、狹葉油茶、小果油茶、博白大果油茶中的至少一種。

72、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶包括二倍體油茶、四倍體油茶、六倍體油茶和八倍體油茶。

73、在本發(fā)明的第六方面，提出了一種油茶的育種方法，包括如下步驟：利用上述油茶snp分子標記組合、液相芯片和試劑盒中的至少一種對待測油茶的dna進行檢測，選擇油茶進行后續(xù)育種。

74、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶的品種包括油茶古樹、湖南油茶、衡東油茶、江西油茶、浙江油茶、湖北油茶、福建油茶、廣西油茶、攸縣油茶、狹葉油茶、小果油茶、博白大果油茶中的至少一種。

75、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述油茶包括二倍體油茶、四倍體油茶、六倍體油茶和八倍體油茶。

76、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述檢測基于液相探針捕獲測序分型技術進行。

77、本發(fā)明至少具有以下有益效果：

78、本發(fā)明方案的油茶snp分子標記組合可以有效用于油茶的分子標記育種。將本發(fā)明方案的油茶snp分子標記組合制備得到油茶首款全基因組液相芯片，有效降低了油茶在科研中遺傳多樣性分析、qtl定位、gwas分析等應用的成本，解決了油茶分子輔助育種、全基因組選擇育種無適用產(chǎn)品的難題，加快了油茶基礎研究及育種的進程。

79、同時，本發(fā)明方案制備得到的油茶液相芯片具有普適性強的特點，油茶倍性復雜，除了二倍體油茶外，還存在四倍體、六倍體和八倍體油茶，本發(fā)明在二倍體油茶檢測中平均檢出率能達到98.98％，四倍體、六倍體和八倍體油茶中的平均檢出率能達85.78％，能滿足不同倍性油茶的檢測需求。且本發(fā)明方案制備得到的油茶液相芯片中功能基因豐富，添加了與油茶的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性、育性和品種特異性相關位點7,554個，有利于分子標記輔助選擇、定向改良、多基因聚合育種以及重要性狀基因挖掘鑒定和功能解析等，在油茶品種改良和品種選育過程中存在很大的利用價值。

80、液相芯片技術相較于傳統(tǒng)的固相芯片技術，展現(xiàn)出了顯著的靈活性與高效性。液相芯片無需等待湊樣，少量樣本也能進行檢測，從而極大地縮短了檢測周期，加速了科研與育種進程的效率。同時，液相芯片在位點設計上靈活，通過對現(xiàn)有產(chǎn)品的不斷的優(yōu)化和調(diào)整，可以基于現(xiàn)有芯片進行位點增減，從而改變芯片密度，以滿足不同研究或應用場景下的具體需求。另外，液相芯片除獲取目標snp信息外，還可以獲取目標區(qū)間(200-300bp/目標區(qū)域)內(nèi)的所有遺傳變異位點，為油茶分子育種提供更豐富的位點信息支撐。