本發(fā)明涉及真菌檢測，更具體地說，它涉及一種柑橘輪斑病菌和炭疽病菌的快速檢測方法。

背景技術(shù)：

1、炭疽病是影響柑橘生產(chǎn)的主要病害，可為害葉、花、果和枝條，引起果面斑點、枯梢、落花和落果，還可引起采后腐爛。葉片受害表現(xiàn)急性型和慢性型，枝條受害多表現(xiàn)幼嫩新梢枯死，果實受害表現(xiàn)干疤、淚痕和腐爛型。其病原菌屬于刺盤孢屬(colletotrichum)的兩個種，即膠孢炭疽菌(c.gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(c.acutatum)，以及平頭炭疽菌(c.truncatum),c.gloeosporioide是優(yōu)勢菌。除培養(yǎng)性狀和形態(tài)學外，特異性引物cgint/its4和caint/its4可用于區(qū)分c.gloeosporioides和c.acutatum。

2、柑橘輪斑病是由pseudofabraea?citricarpa造成的一種柑橘真菌性病害，自2004年在陜西城固首次報道，鑒定該病菌為cryptosporiopsis?citricarpa?zhu，hyde&li(c.citricarpa)，稱此病為“輪斑病”(target?spot)。后人們將該菌重新鑒定為一個新的單型屬pseudofabraea?citricarpar。柑橘輪斑病屬于低溫型病害，在冬末春初發(fā)病最重，高溫季節(jié)一般不發(fā)病。其在12月中旬開始出現(xiàn)癥狀，并逐漸加重，2月下旬至3月中旬為發(fā)病高峰，病葉在3月中下旬基本落光。在萬州檸檬上，該病也侵染果實，造成果實出現(xiàn)直徑0.2cm-2.2cm、黑褐色凹陷斑點，最終落果爛果。

3、柑橘輪斑病、炭疽病為陜西、重慶、湖北部分地區(qū)柑橘生產(chǎn)中的主要病害，因早期癥狀極為相似，田間診斷難，室內(nèi)鑒定需要通過分離培養(yǎng)、提取dna后再分別進行每種病害檢測，耗時費力，檢測時間長達15d以上，檢測效率低，且需要真菌鑒定經(jīng)驗豐富的人員操作，得到鑒定結(jié)果時往往貽誤最佳防治時機，缺乏早期快速檢測技術(shù)，造成果面斑點嚴重，果農(nóng)經(jīng)濟損失的現(xiàn)實問題。

4、因此，現(xiàn)亟需建立區(qū)分這兩種病原菌種類的快速分子檢測體系來快速檢測柑橘病害病原菌種類。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種基于柑橘炭疽病菌和輪斑病菌的檢測方法，能夠靈敏、可靠、特異地檢測柑橘炭疽病菌和輪斑病菌，且價格低廉，操作簡便，不易出現(xiàn)假陽性。

2、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：

3、一種柑橘輪斑病菌和炭疽病菌的快速檢測方法，包括以下步驟：

4、s1.樣品采集：從田間采集早期發(fā)病組織，培養(yǎng)保濕2天，長出少量菌絲后，挑取菌絲作為pcr模板；

5、s2.pcr檢測：優(yōu)化pcr反應(yīng)體系和參數(shù)，進行直接pcr擴增；

6、s3.病菌檢測：pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增條帶，根據(jù)擴增條帶的有無，即可快速區(qū)分樣品中是否含有輪斑病菌或炭疽病菌。

7、本發(fā)明還提供了一種柑橘炭疽病菌特異性擴增引物，所述引物用于上述柑橘炭疽病菌和輪斑病菌的快速鑒定方法中，其核苷酸序列為：cg-f:tacgctctac?aaccctttgt?ga；co-r：accaagcaga?gcttgagggt?tg。

8、本發(fā)明還提供了一種柑橘輪斑病菌特異性擴增引物，所述引物用于上述柑橘炭疽病菌和輪斑病菌的快速鑒定方法中，其核苷酸序列為：ps-f：catgcccttc?ggggtagatc?tc；co-r：accaagcaga?gcttgagggt?tg。

9、優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)體系建立包括以下步驟：

10、(1)pcr擴增體系：由2×taq?pcr?master?mix?15ul，0.5μl的上游引物，0.5μl的下游引物，14μl的ddh2o以及菌絲構(gòu)成；

11、(2)pcr反應(yīng)條件為：第一步，在95℃下保持3min；第二步，在95℃下保持10s；第三步，在55℃下保持30s；第四步，在72℃下保持20s；第五步，重復(fù)第二、三、四步38次；第六步，在72℃下保持5min；第七步，產(chǎn)物維持在4℃。

12、優(yōu)選的，所述s1中pcr模板包括僅輪斑菌菌絲、僅炭疽菌菌絲、以及輪斑病菌和炭疽菌混合菌絲。

13、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：相較于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明能達到的檢測限更低，靈敏度更高，可應(yīng)用于進行快速檢測，整個判斷過程不需要病菌分離，克隆和測序，檢測時間可以保持在5小時以內(nèi)，且檢測過程中特異性更強，該方法可在柑橘的病害早期能快速區(qū)分目前柑橘生產(chǎn)中的2種主要病害(輪斑病和炭疽病)，大大縮短檢測鑒定時間，能夠很好的解決柑橘輪斑病、炭疽病早期癥狀極為相似，田間診斷難的問題，避免貽誤最佳防治時機，有非常好的經(jīng)濟價值。

技術(shù)特征：

1.一種柑橘輪斑病菌和炭疽病菌的快速檢測方法，其特征是：包括以下步驟：

2.一種柑橘炭疽病菌特異性擴增引物，所述引物用于權(quán)利要求1所述柑橘炭疽病菌和輪斑病菌的快速鑒定方法中，其特征是，其核苷酸序列為：cg-f:tacgctctac?aaccctttgtga；co-r：accaagcaga?gcttgagggt?tg。

3.一種柑橘輪斑病菌特異性擴增引物，所述引物用于權(quán)利要求1所述柑橘炭疽病菌和輪斑病菌的快速鑒定方法中，其特征是，其核苷酸序列為：ps-f：catgcccttc?ggggtagatctc；co-r：accaagcaga?gcttgagggt?tg。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘輪斑病菌和炭疽病菌的快速檢測方法，其特征是：所述pcr反應(yīng)體系建立包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘輪斑病菌和炭疽病菌的快速檢測方法，其特征是：所述s1中pcr模板包括僅輪斑菌菌絲、僅炭疽菌菌絲、以及輪斑病菌和炭疽菌混合菌絲。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種柑橘輪斑病菌和炭疽病菌的快速檢測方法，涉及真菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，其技術(shù)方案要點是：建立區(qū)分這兩種病原菌種類的快速分子檢測體系：根據(jù)柑橘輪斑病和炭疽病的ITS序列差異，設(shè)計特異性引物PS?F/Co?R和Cg?F/Co?R引物，采用直接PCR檢測技術(shù)，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和參數(shù)，以田間采集的早期發(fā)病的組織室內(nèi)保濕培養(yǎng)2d，長出菌絲后，挑取少量菌絲為模板，進行直接PCR檢測。該方法根據(jù)觀察擴增條帶有無，可快速判斷肉眼無法判斷的樣品是哪種病菌侵染或者兩種病菌都含有，整個判斷過程不需要病菌分離、克隆和測序，檢測時間可保持在5小時以內(nèi)，可在病害早期快速區(qū)分2種病害。

技術(shù)研發(fā)人員：陳泉,何錦輝,羊煉,劉忠賢
受保護的技術(shù)使用者：重慶三峽農(nóng)業(yè)科學院（重慶市萬州區(qū)甘寧蠶種場）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6