本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及編碼抗原蛋白的核酸分子、重組表達(dá)載體及其應(yīng)用與基于浮萍的可食用疫苗。

背景技術(shù)：

1、疫苗是預(yù)防傳染性疾病最有效的手段。大多數(shù)病原體都能從粘膜部位入侵機(jī)體，黏膜疫苗是指在黏膜部位接種并能成功誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗。黏膜疫苗作用于黏膜免疫系統(tǒng)，除了能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫反應(yīng)外，還能誘導(dǎo)局部的黏膜免疫反應(yīng)產(chǎn)生分泌型iga抗體，阻止病原體對(duì)粘膜部位的感染。傳統(tǒng)的注射疫苗只能誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫反應(yīng)，很難激活局部的黏膜免疫。因此，對(duì)于通過(guò)粘膜感染的傳染性疾病，黏膜疫苗相比注射疫苗更具優(yōu)勢(shì)。

2、利用可食用植物表達(dá)抗原，并通過(guò)口服的方式將抗原遞送到腸道這一身體最大的黏膜免疫器官是開(kāi)發(fā)黏膜疫苗的新策略。轉(zhuǎn)基因可食用植物不但可以作為生物工廠表達(dá)抗原，而且可以扮演口服遞送載體的角色。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁可以保護(hù)植物細(xì)胞中表達(dá)的抗原在口服給藥時(shí)免受消化系統(tǒng)的降解，從而將抗原安全遞送到腸道粘膜。該技術(shù)無(wú)需昂貴的下游提取和純化過(guò)程，具有極大的成本優(yōu)勢(shì)，并且制備的疫苗可常溫儲(chǔ)存、無(wú)需冷鏈，可增加疫苗的流通和使用的便利性。

3、浮萍是地球上最小的開(kāi)花植物，結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單。浮萍的蛋白質(zhì)含量高，傳統(tǒng)上主要用來(lái)喂養(yǎng)家禽家畜。浮萍的生長(zhǎng)速度極快，在條件適宜的情況下在16～48h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)生物量翻倍，是生長(zhǎng)最快的植物之一。并且，浮萍可以在封閉的系統(tǒng)中培養(yǎng)，不占用耕地，可避免轉(zhuǎn)基因釋放到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)。因此，相比于玉米、生菜、水稻等可食用植物，利用浮萍開(kāi)發(fā)可食用疫苗具有極大的優(yōu)勢(shì)。

4、禽業(yè)是世界上最大的畜牧業(yè)。在家禽業(yè)中，傳染病的防控是一個(gè)重要的問(wèn)題。傳染性支氣管炎(infectious?bronchitis,ib)是由禽傳染性支氣管炎病毒(infectiousbronchitis?virus,ibv)引起的一種急性、高傳染性疾病，同時(shí)伴隨著呼吸道癥狀、泌尿和生殖系統(tǒng)衰竭，導(dǎo)致家禽的產(chǎn)蛋量低和死亡。ibv屬于冠狀病毒科(coronaviridae)，冠狀病毒屬(coronavirinae)，其病毒粒含有一個(gè)正義單鏈rna，自1931年美國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，ibv已傳播到了全世界范圍內(nèi)所有存在養(yǎng)禽業(yè)的國(guó)家和地區(qū)，給家禽業(yè)造成了巨大的損失。ibv通過(guò)呼吸道途徑傳播，主要在呼吸系統(tǒng)內(nèi)定殖，其次是腎臟、生殖系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)，造成氣管、腎臟和生殖系統(tǒng)損傷，降低機(jī)體免疫力以及卵的產(chǎn)量和質(zhì)量。感染ibv的雞會(huì)出現(xiàn)呼吸道癥狀，由于氣管纖毛損傷，導(dǎo)致感染ibv的雞又容易感染其它的病毒和細(xì)菌，造成較高的死亡率。

5、接種疫苗是預(yù)防ibv感染最有效的方法，目前市售的ibv疫苗包括減毒疫苗和滅活疫苗。減毒疫苗是用于ibv防控的第一代疫苗，通過(guò)噴霧或飲水方式接種，在接種后2～3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，接種方式簡(jiǎn)單，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫反應(yīng)和黏膜免疫反應(yīng)，但存在著毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)以及在接種后會(huì)造成組織損傷的問(wèn)題。滅活疫苗不會(huì)在體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，相對(duì)安全，但不能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，也不能激活黏膜免疫反應(yīng)，并且，滅活疫苗需要逐只雞進(jìn)行注射接種，接種人力成本高，在接種部位可能導(dǎo)致胴體排斥而影響雞的品質(zhì)。因此，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)成本更低，使用更方便，更加安全、有效的口服ibv疫苗已成為了本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供編碼抗原蛋白的核酸分子、重組表達(dá)載體，編碼抗原蛋白的核酸分子、重組表達(dá)載體和含有所述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍的應(yīng)用，以及基于浮萍的可食用疫苗，為ibv感染的預(yù)防或治療提供生產(chǎn)成本更低、流通和使用更便利并且安全有效的可食用疫苗。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供了編碼抗原蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列選自：

4、(a)如seq?id?no.1～seq?id?no.4中任一序列所示的核苷酸序列；或，

5、(b)與(a)所限定的核苷酸序列編碼相同抗原蛋白的核苷酸序列。

6、第二方面，本發(fā)明提供了包含上述編碼抗原蛋白的核酸分子的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體是將所述編碼抗原蛋白的核酸分子重組到強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)表達(dá)載體上形成的。

7、本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：將上述編碼抗原蛋白的核酸分子重組到強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)表達(dá)載體上形成重組表達(dá)載體，將所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入浮萍中使所述編碼抗原蛋白的核酸分子過(guò)表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因浮萍。以該轉(zhuǎn)基因浮萍作為可食用疫苗(不含疫苗佐劑的可食用疫苗)，將該不含疫苗佐劑的可食用疫苗給雞口服后，在雞的ibv病毒攻毒實(shí)驗(yàn)中，所述不含疫苗佐劑的可食用疫苗可以誘導(dǎo)ibv特異性igg抗體、抗ibv黏膜抗體siga，并降低組織病毒載量。以該轉(zhuǎn)基因浮萍和疫苗佐劑(表達(dá)細(xì)胞因子il-17b的轉(zhuǎn)基因浮萍)共同作為可食用疫苗(含疫苗佐劑的可食用疫苗)，將該含疫苗佐劑的可食用疫苗給雞口服后，在雞的ibv病毒攻毒實(shí)驗(yàn)中，含疫苗佐劑的可食用疫苗所誘導(dǎo)的ibv特異性igg抗體、抗ibv黏膜抗體siga、以及降低組織病毒載量的水平均高于前述不含疫苗佐劑的可食用疫苗。

8、第三方面，基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供了上述編碼抗原蛋白的核酸分子或上述重組表達(dá)載體在制備預(yù)防或治療ibv感染的疫苗、藥物或飼料添加劑中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供了含有上述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍在制備預(yù)防或治療ibv感染的疫苗、藥物或飼料添加劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，所述預(yù)防或治療ibv感染的疫苗包括可食用疫苗。

9、上述應(yīng)用的技術(shù)方案中，所述含有上述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍是將上述編碼抗原蛋白的核酸分子重組到強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物過(guò)表達(dá)載體上，將所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入浮萍中使所述編碼抗原蛋白的核酸分子過(guò)表達(dá)得到的。

10、進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述編碼抗原蛋白的核酸分子、上述重組表達(dá)載體或者含有上述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍在預(yù)防傳染性疾病中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括以下幾方面：(1)通過(guò)口服誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，(2)預(yù)防或治療ibv感染相關(guān)疾病，(3)制備ibv抗原或抗體，(4)遞送抗原，(5)制備動(dòng)物飼料。

11、第四方面，基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明還提供了基于浮萍的可食用疫苗，該可食用疫苗中包括含有上述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍。該可食用疫苗以含有上述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍作為唯一成分或主要成分，是否采用其他輔助成分或者采用何種輔助成分，可以參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行確定。

12、進(jìn)一步地，上述基于浮萍的可食用疫苗的技術(shù)方案中，所述可食用疫苗中還含有疫苗佐劑，所述疫苗佐劑為表達(dá)細(xì)胞因子il-17b的轉(zhuǎn)基因植物。更進(jìn)一步地，所述表達(dá)細(xì)胞因子il-17b的轉(zhuǎn)基因植物為表達(dá)細(xì)胞因子il-17b的轉(zhuǎn)基因浮萍。當(dāng)所述可食用疫苗中含有疫苗佐劑時(shí)，該可食用疫苗以含有上述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍和疫苗佐劑作為主要成分，是否采用其他輔助成分或者采用何種輔助成分，可以參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行確定。

13、本發(fā)明提供的技術(shù)方案產(chǎn)生了以下有益的技術(shù)效果：

14、1.本發(fā)明提供了編碼抗原蛋白的核酸分子、重組表達(dá)載體，并基于編碼抗原蛋白的核酸分子或重組表達(dá)載體構(gòu)建了含有所述編碼抗原蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因浮萍，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：以該轉(zhuǎn)基因浮萍作為可食用疫苗(不含疫苗佐劑的可食用疫苗)，或是以該轉(zhuǎn)基因浮萍和疫苗佐劑共同作為可食用疫苗(含疫苗佐劑的可食用疫苗)，給雞口服可食用疫苗后，在對(duì)雞的ibv病毒攻毒實(shí)驗(yàn)中，所述不含疫苗佐劑和含疫苗佐劑的可食用疫苗均獲得了100％的保護(hù)率，與給雞口服商品化ibv?h120疫苗的保護(hù)率一致；所述不含疫苗佐劑的可食用疫苗在部分免疫學(xué)指標(biāo)上優(yōu)于ibv?h120疫苗，例如，不含疫苗佐劑的可食用疫苗誘導(dǎo)的血清ibv特異性igg抗體水平、降低氣管組織病毒載量的能力均顯著高于ibv?h120疫苗；含疫苗佐劑的可食用疫苗在大部分所檢測(cè)的指標(biāo)上優(yōu)于ibv?h120疫苗，例如，含疫苗佐劑的可食用疫苗誘導(dǎo)的血清ibv特異性igg抗體水平、氣管組織黏膜抗體siga水平、腸道組織黏膜抗體siga水平、降低氣管組織病毒載量的能力均顯著高于ibv?h120疫苗，這說(shuō)明本發(fā)明所述含疫苗佐劑的可食用疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)及粘膜免疫反應(yīng)強(qiáng)于ibv?h120疫苗。

15、2.本發(fā)明提供的基于浮萍的可食用疫苗，以浮萍作為植物工廠表達(dá)ibv抗原，同時(shí)利用浮萍作為口服遞送載體遞送抗原。與傳統(tǒng)疫苗相比，本發(fā)明所述基于浮萍的可食用疫苗具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)基于浮萍的可食用疫苗的生產(chǎn)成本低廉，可通過(guò)直接口服起效，無(wú)需將抗原分離純化，避免了昂貴的下游提取和純化過(guò)程，具有極大的成本優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，浮萍的生長(zhǎng)速度極快、生長(zhǎng)周期短，可通過(guò)立體栽培模式進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，這有利于進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本；(2)基于浮萍的可食用疫苗可常溫儲(chǔ)存、無(wú)需冷鏈，流通和使用都更加便利；(3)基于浮萍的可食用疫苗通過(guò)口服免疫、無(wú)需注射，用于畜禽防疫時(shí)還可做成飼料或飼料添加劑的形式使用，不但使用方便，而且可節(jié)約注射的人工成本；(4)基于浮萍的可食用疫苗可通過(guò)口服誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，對(duì)于經(jīng)由粘膜感染的傳染性疾病更具優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明所述基于浮萍的可食用疫苗極具應(yīng)用前景。