本發(fā)明涉及一種利用谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)及乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)的方法，更詳細(xì)地，涉及一種重組谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)及利用其生產(chǎn)lnt及l(fā)nnt的方法，上述重組谷氨酸棒狀桿菌被轉(zhuǎn)化，以使從外部引入的基因在谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)中表達，并且使谷氨酸棒狀桿菌本身具有的基因過表達，以提高lnt及l(fā)nnt的生產(chǎn)率。

背景技術(shù)：

1、母乳低聚糖(human?milk?oligosaccharides，hmos)為母乳中含有的低聚糖，是母乳中僅次于乳糖及脂肪的第三豐富的成分。母乳低聚糖大約有200多種的不同類型，母乳低聚糖的代表性的例子包括2’-巖藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose，2’-fl)、3-巖藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)、乳糖-n-三糖(lacto-n-triose)ii、乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)、乳糖-n-巖藻五糖(lacto-n-fucopentaose，lnfp)、乳糖-n-新巖藻五糖(lacto-n-neofucopentaose)、乳糖-n-六糖(lacto-n-hexaose，lnh)、乳糖-n-新六糖(lacto-n-neohexaose，lnnh)、6’-半乳糖基乳糖(6’-galactosylactose)及3’-半乳糖基乳糖(3’-galactosylactose)等。

2、由于母乳低聚糖具有增強免疫功能或?qū)和陌l(fā)育及行為產(chǎn)生有益影響等各種優(yōu)點，因此需要不斷研究用于生產(chǎn)各種母乳低聚糖的技術(shù)。在現(xiàn)有的研究中，已對利用微生物生產(chǎn)母乳低聚糖的技術(shù)進行研究，其中使用重組大腸桿菌。然而，雖然大腸桿菌實際上并不是病原體，但被消費者普遍認(rèn)為是有害的細(xì)菌，而且由于大腸桿菌的細(xì)胞膜成分可能起到內(nèi)毒素的作用，因此分離及純化所生產(chǎn)的母乳低聚糖的成本很高，并且由于大腸桿菌細(xì)胞因乳糖滲透酶(lactose?permease)的作用而出現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞死亡的現(xiàn)象(“乳糖殺傷”)，因此其使用受到一定限制。因此，持續(xù)需要利用新微生物生產(chǎn)母乳低聚糖的技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、在本發(fā)明中旨在開發(fā)并提供一種利用比大腸桿菌更安全的谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)作為生產(chǎn)作為食品及藥物材料的乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)及乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)的宿主細(xì)胞來以高濃度、高收率、高生產(chǎn)率生產(chǎn)lnt及l(fā)nnt的方法。

3、技術(shù)方案

4、本發(fā)明提供一種重組谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)，其特征在于，上述重組谷氨酸棒狀桿菌被轉(zhuǎn)化，以使從外部引入的編碼乳糖滲透酶(lactosepermease)的基因、編碼β-1,3-n-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(β-1,3-n-acetylglucosaminyltransferase)的基因、編碼β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β-1,3-galactosyltransferase)的基因在谷氨酸棒狀桿菌中表達，并且上述重組谷氨酸棒狀桿菌被轉(zhuǎn)化，以使選自作為棒狀桿菌屬本身具有的基因的編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine-fructose-6-phosphate?aminotransferase)的基因、編碼磷酸葡萄糖胺變位酶(phosphoglucosamine?mutase)的基因、編碼葡萄糖胺-1-磷酸n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glucosamine-1-phosphate?n-acetyltransferase)的基因、編碼udp-n-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(udp-n-acetylglucosamine?pyrophosphorylase)的基因、編碼磷酸葡糖變位酶(phosphoglucomutase)的基因、編碼utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶(utp-glucose-1-phosphate?uridylyltransferase)的基因、編碼udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶(udp-glucose-4-epimerase)的基因中的一種以上基因過表達。

5、并且，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose)的方法，其特征在于，在添加有乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述重組谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)。

6、另一方面，在本發(fā)明的生產(chǎn)乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose)的方法中，上述培養(yǎng)基還包含葡萄糖為宜。

7、并且，本發(fā)明提供一種重組谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)，其特征在于，上述重組谷氨酸棒狀桿菌被轉(zhuǎn)化，以使從外部引入的編碼乳糖滲透酶(lactosepermease)的基因、編碼β-1,3-n-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶(β-1,3-n-acetylglucosaminyltransferase)的基因、編碼β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β-1,4-galactosyltransferase)的基因在谷氨酸棒狀桿菌中表達，并且上述重組谷氨酸棒狀桿菌被轉(zhuǎn)化，以使選自作為棒狀桿菌屬本身具有的基因的編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine-fructose-6-phosphate?aminotransferase)的基因、編碼磷酸葡萄糖胺變位酶(phosphoglucosamine?mutase)的基因、編碼葡萄糖胺-1-磷酸n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(glucosamine-1-phosphate?n-acetyltransferase)的基因、編碼udp-n-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(udp-n-acetylglucosamine?pyrophosphorylase)的基因、編碼磷酸葡糖變位酶(phosphoglucomutase)的基因、編碼utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶(utp-glucose-1-phosphate?uridylyltransferase)的基因、編碼udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶(udp-glucose-4-epimerase)的基因中的一種以上基因過表達。

8、并且，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose)的方法，其特征在于，在添加有乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述重組谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)。

9、另一方面，在本發(fā)明的生產(chǎn)乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose)的方法中，上述培養(yǎng)基還包含葡萄糖為宜。

10、發(fā)明的效果

11、本發(fā)明可以利用谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)以高濃度、高收率、高生產(chǎn)率且比現(xiàn)有的大腸桿菌更安全地生產(chǎn)乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)及乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)。