本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)，尤其涉及一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法。

背景技術(shù)：

1、隨著生物技術(shù)的進步，基礎(chǔ)科研得到廣泛的關(guān)注，尤其在類器官培養(yǎng)、前沿醫(yī)學(xué)治療及細胞農(nóng)業(yè)方向得以快速發(fā)展，綜合來講，細胞在體外的應(yīng)用技術(shù)得到廣泛和快速的提升。此外，細胞科學(xué)、細胞醫(yī)學(xué)及細胞農(nóng)業(yè)相關(guān)的研究進一步向細胞改造的方向發(fā)展，隨之帶來的是細胞安全問題的探討和評價，但是，目前以細胞為底盤技術(shù)的各個方向的發(fā)展仍然存在著重大挑戰(zhàn)，尤其在細胞體外培養(yǎng)和使用過程中細胞狀態(tài)、細胞異變及細胞穩(wěn)定性等的判斷，導(dǎo)致目前體外細胞使用過程仍然處于高成本、低效率的階段，同時在商業(yè)化使用過程中通過技術(shù)手段完成對細胞的評價仍然是一項重大挑戰(zhàn)。

2、除了通過活性檢測查看細胞群體某一個時間點的總體狀況以外，還需要更為綜合的、實時可以實施的、更全面、更深層的評價手段。因此本發(fā)明開發(fā)了針對細胞培育肉用細胞本身穩(wěn)定性和可實時評價、連續(xù)評價、綜合評價的細胞穩(wěn)定性評價方案，包含細胞增殖、細胞遷移、細胞粘附、細胞活力、細胞凋亡、細胞自噬、細胞癌變、細胞衰老等多方面評價因素，可用于細胞連續(xù)傳代、細胞實驗、細胞類器官培養(yǎng)、細胞培育肉及細胞醫(yī)療等過程使用的細胞全面評價技術(shù)。

3、因此，細胞穩(wěn)定性評價目前尚未被關(guān)注但生命科學(xué)研究領(lǐng)域及針對細胞的工業(yè)化應(yīng)用過程亟須解決的針對培育肉細胞連續(xù)傳代過程中細胞生命活動、功能檢測及穩(wěn)定性評價的技術(shù)方案是目前所需要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法，適用于細胞培育過程中穩(wěn)定性的檢測，主要在細胞使用中對連續(xù)傳代的細胞進行穩(wěn)定性檢測，綜合判斷細胞的生命周期，使細胞應(yīng)用于最佳經(jīng)濟/效率使用壽命；可以有效、準(zhǔn)確評判細胞狀態(tài)，具有良好的可靠性。

2、解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法，包括細胞樣品，其特征在于：所述細胞樣品包括經(jīng)細胞功能、細胞異變、細胞穩(wěn)定性能三個方面的檢測，其中當(dāng)細胞增殖效果良好、細胞不發(fā)生遷移行動、細胞活力>80%、細胞早期及晚期凋亡比例≤10%、細胞自噬比例＜5%、細胞無原癌基因顯著表達、細胞核型分析為染色體數(shù)目和形態(tài)無異變；細胞粘附指標(biāo)：2h內(nèi)有明顯粘附即可；細胞毒性指標(biāo)≤10%、細胞衰老比例占比≤20%和細胞倍增時間＜48小時的細胞為穩(wěn)定細胞；若其中一項指標(biāo)沒有達到標(biāo)準(zhǔn)，則為細胞傳代不穩(wěn)定，中止細胞培育進程。

3、細胞穩(wěn)定性評價的關(guān)鍵指標(biāo)，是衡量細胞培育肉相關(guān)細胞使用周期、判斷細胞的最佳經(jīng)濟/效率使用壽命的評判技術(shù)，可以在細胞培育肉方向奠定技術(shù)基礎(chǔ)，在細胞農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)療和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

4、本發(fā)明中檢測方法可鑒定0-35代或更多代的細胞穩(wěn)定性，篩選穩(wěn)定傳代細胞株以用于細胞培育肉的研發(fā)和優(yōu)化，可為細胞培育肉高效制造奠定技術(shù)基礎(chǔ)，可評價細胞使用過程種的經(jīng)濟/效率效價，篩選最優(yōu)使用壽命周期的細胞實現(xiàn)培育肉制造。

5、本發(fā)明中一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法，具體步驟如下：

6、（1）獲取細胞樣品：所述細胞為用于細胞培育肉的種子細胞；

7、（2）將細胞進行體外培養(yǎng)；

8、（3）細胞性能的檢測：對細胞增殖、細胞遷移能力或細胞活力等進行檢測，其中細胞增殖效果良好、細胞不發(fā)生遷移行動和細胞活力>80%；整體的細胞增殖、遷移和活力等屬于細胞性能檢測的一部分；

9、或細胞異變的檢測：對細胞凋亡比例、細胞自噬比例或細胞癌變等檢測，其中細胞早期及晚期凋亡比例≤10%、細胞自噬比例＜5%和細胞無原癌基因顯著表達；

10、或細胞穩(wěn)定性能的檢測：對核型分析、細胞粘附、細胞衰老和細胞毒性等檢測：其中細胞核型分析為染色體數(shù)目和形態(tài)無異變；細胞粘附指標(biāo)：2h內(nèi)有明顯粘附即可；細胞毒性指標(biāo)≤10%、細胞衰老比例占比≤20%和細胞倍增時間＜48h；

11、細胞穩(wěn)定性能的檢測中也可做細胞組學(xué)分析；

12、（4）所述步驟（3）中的指標(biāo)檢測無先后順序之分，任一指標(biāo)不達標(biāo)即可判段該細胞穩(wěn)定性不達標(biāo)；

13、優(yōu)化方案中，所述細胞樣品包括原代細胞、生物工程改造細胞和永生化細胞等；

14、所述細胞來源包括人、鼠、豬、雞、牛、羊等。

15、進一步驟優(yōu)化方案中，所述步驟（3）細胞穩(wěn)定性能的檢測中，細胞核型分析檢測包括以下步驟：通過秋水仙素進行染色體核型分析測定細胞染色體的異位突變情況，然后將所述細胞與x-gal底物混合進行反應(yīng)，再通過觀察是否生成深藍色產(chǎn)物判斷細胞是否擁有觀察衰老特異性的β-半乳糖苷酶。

16、所述β-半乳糖苷酶通過催化x-gal顯示生成深藍色產(chǎn)物。

17、所述步驟（3）細胞性能的檢測中，細胞遷移能力測定采用細胞劃痕實驗，通過細胞爬片狀態(tài)判斷細胞遷移能力。

18、所述步驟（3）細胞異變的檢測中，細胞凋亡比例測定采用細胞流式實驗，通過觀察不同代數(shù)細胞凋亡比例進行經(jīng)濟/效率細胞生命周期評價，判斷細胞是否適應(yīng)規(guī)?；鲋尺^程。

19、所述步驟（3）細胞異變的檢測中，細胞自噬比例測定通過lc3b兔多克隆抗體與吞噬細胞結(jié)合產(chǎn)生標(biāo)記，作為自噬膜的一般標(biāo)記再通過熒光顯微鏡和高含量成像與分析來判斷細胞自噬情況。

20、所述步驟（3）細胞穩(wěn)定性能的檢測中，細胞粘附性能的測定通過熒光染料鈣黃綠素乙酰氧基甲酯來測量。

21、所述步驟（3）細胞穩(wěn)定性能的檢測中，細胞毒性水平（≤10%）測定通過將所述細胞等份轉(zhuǎn)移到新板中，并添加cyquant??ldh細胞毒性測定試劑盒反應(yīng)混合物，乳酸脫氫酶(ldh)是一種存在于許多不同細胞類型中的胞質(zhì)酶，質(zhì)膜受損會將ldh釋放到周圍的細胞培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)基中的細胞外ldh可以通過偶聯(lián)酶反應(yīng)使用酶標(biāo)儀進行定量，可有效反映細胞毒性水平。

22、本發(fā)明提供以上所述的細胞穩(wěn)定性評價方法在以下任一種中的應(yīng)用：

23、（1）在細胞連續(xù)傳代過程中的應(yīng)用；

24、（2）在細胞類器官培養(yǎng)中的應(yīng)用；

25、（3）在細胞培育肉中的應(yīng)用；

26、（4）先進細胞醫(yī)學(xué)術(shù)前安全評價。

27、本發(fā)明中檢測方法解決了目前沒有綜合評價技術(shù)和方案的問題，同時對現(xiàn)有判斷方案單一、片面等問題，可作為一種商業(yè)化的細胞評價方案和細胞檢測及評價方法，實現(xiàn)細胞狀態(tài)評估，具有良好的效率和安全性，能夠較好地支持細胞進行相關(guān)應(yīng)用，可在培養(yǎng)皿、生物反應(yīng)器等多種細胞培養(yǎng)裝置中進行擴增細胞的連續(xù)檢測、綜合評價，可用于細胞連續(xù)傳代、細胞培育肉應(yīng)用。具體的優(yōu)勢至少包括以下幾方面：

28、（1）本發(fā)明提供的細胞穩(wěn)定性評價方法可直接對細胞狀態(tài)進行全方面的評價，也可通過特定需求增減評價方案，開發(fā)了商業(yè)化的細胞穩(wěn)定性評價新方法；

29、（2）本發(fā)明提供的細胞穩(wěn)定性評價方法能夠最大程度地了解細胞狀態(tài)以及細胞體外應(yīng)用的三維生長環(huán)境，有利于細胞在體外的培養(yǎng)及應(yīng)用；

30、（3）本發(fā)明提供的細胞穩(wěn)定性評價方法具有良好的生物安全性，支持細胞增殖、遷移、粘附、活力、凋亡、自噬、癌變、衰老等多方面評價的細胞穩(wěn)定性評價方法，呈現(xiàn)出直觀的細胞狀態(tài)評價；

31、（4）本發(fā)明的細胞穩(wěn)定性評價方法，可有效判斷細胞狀態(tài)是否適合進行細胞的大規(guī)模高效擴增培養(yǎng)，綜合評價細胞成本、時間成本、效率效價等，保障細胞的高效、低成本的商業(yè)運行，同時支持連續(xù)傳代的細胞狀態(tài)需求或進行其他應(yīng)用；

32、（5）本發(fā)明的細胞穩(wěn)定性評價方法，成本較低，可在生命科學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及細胞農(nóng)業(yè)領(lǐng)域大規(guī)模推廣應(yīng)用，有助于提高細胞研究及商業(yè)應(yīng)用的效率、減少浪費、降低成本。其中，評價方案中的實驗試劑或試劑盒均容易獲取，發(fā)明的思路是目前尚未被提出的；

33、（6）本發(fā)明的細胞穩(wěn)定性評價方法/細胞狀態(tài)評價方案可作商業(yè)使用，其實驗過程簡單、方便，結(jié)果準(zhǔn)確、有效，優(yōu)勢明顯，便于進行推廣應(yīng)用。

34、本發(fā)明所述細胞穩(wěn)定性評價方法匯合了目前使用較廣泛的細胞活性檢測方法，并且通過多方面共判斷細胞潛力，結(jié)果較準(zhǔn)確，具有重要研究意義和應(yīng)用價值。本發(fā)明在一定程度上可以成為細胞培育肉領(lǐng)域商業(yè)化使用過程中對細胞穩(wěn)定性的評價方案，促進細胞應(yīng)用效率，提高細胞使用效價。