本發(fā)明涉及發(fā)酵菌種制備，具體為一種丁酸梭菌凍干粉及其制備方法。

背景技術：

1、丁酸梭菌(clostridium?butyricum)又名酪酸菌，隸屬于厚壁菌門(firmicutes)芽孢桿菌科(bacillaceae)梭菌屬(clostridium)，是一種嚴格厭氧、可產(chǎn)生孢子的革蘭氏陽性菌，其代謝產(chǎn)物丁酸、乙酸、丙酸以及各種消化酶等可修復損傷的腸道黏膜及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，有益于動物健康及生長發(fā)育，是理想的飼料用抗生素替代品。

2、為了便于將丁酸梭菌應用于營養(yǎng)保健、食品、醫(yī)藥等產(chǎn)品的生產(chǎn)中，通常以液體培養(yǎng)基發(fā)酵的方式來使丁酸梭菌增殖，獲得較高活菌數(shù)的菌體，然后經(jīng)干燥得到益生菌菌粉，常規(guī)的熱風干燥因過高的致死率而不適用于丁酸梭菌的干燥，因此，丁酸梭菌通常采用冷凍干燥的方式制備菌粉。然而，在冷凍干燥的過程中，細胞冷凍產(chǎn)生的冰晶會破壞細胞膜而使得丁酸梭菌同樣存在一定的活菌損失，此外，在丁酸梭菌的商品貨架期，處于常溫保存條件下，丁酸梭菌以活菌形態(tài)保持在商品中，也會因自身的生長耗盡營養(yǎng)或者因環(huán)境溫度過高而死亡，會導致丁酸梭菌在貨架期活菌數(shù)量衰減速度過快，商品出售時其丁酸梭菌的活菌數(shù)量不能達到商品標簽中標注的含量，從而出現(xiàn)質(zhì)量問題，因此，如何提供一種丁酸梭菌凍干粉，以實現(xiàn)對丁酸梭菌的簡易保藏和延長保藏時間的同時避免菌種退化，是目前亟需解決的技術問題之一。

技術實現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術問題

2、針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種丁酸梭菌凍干粉及其制備方法，通過限定載體、凍干保護劑、分散穩(wěn)定劑的質(zhì)量之比，利用載體將丁酸梭菌充分的吸附承載，保證凍干粉中丁酸梭菌能夠以芽孢形式休眠；利用凍干保護劑減少低溫凍結(jié)對丁酸梭菌細胞的損傷，減少凍結(jié)過程中丁酸梭菌細胞內(nèi)自由水的外溢或凍結(jié)，以調(diào)節(jié)凍干粉中丁酸梭菌細胞的水分活度；利用分散穩(wěn)定劑使得丁酸梭菌能夠分散均勻的同時穩(wěn)定存在，從而使得丁酸梭菌在載體上穩(wěn)定存在。同時限定丁酸梭菌的菌活數(shù)，進一步提高凍干粉存放過程中丁酸梭菌存活率，能使得足夠多的菌株進入芽孢休眠狀態(tài)，不僅有利于延長菌種的保藏時間，還能保證菌種在保藏階段不發(fā)生退化，也不會影響代謝系統(tǒng)，而通過凍干粉的方式，相比試管保藏具有簡易保藏的優(yōu)勢，從而實現(xiàn)丁酸梭菌的簡易保藏和長時間保藏，同時還能避免菌種退化，從而解決了上述技術問題。

3、(二)技術方案

4、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種丁酸梭菌凍干粉，所述凍干粉的原料包括丁酸梭菌菌液、載體、凍干保護劑和分散穩(wěn)定劑，所述載體、凍干保護劑和分散穩(wěn)定劑的質(zhì)量之比為5：5：1，所述丁酸梭菌菌液的活菌數(shù)＞2×109cfu/g。

5、優(yōu)選的，所述載體為可溶性淀粉(50g/l)。

6、通過上述技術方案，載體限定了具體種類和具體濃度，能保證丁酸梭菌能夠穩(wěn)定存在于載體上。

7、優(yōu)選的，所述凍干保護劑包括蔗糖(40g/l)、甘露醇(8g/l)、半胱氨酸(1g/l)、維生素c(1g/l)。

8、通過上述技術方案，凍干保護劑限定了的具體種類和具體濃度，能減少低溫凍結(jié)對丁酸梭菌細胞的損傷。

9、優(yōu)選的，所述分散穩(wěn)定劑包括羧甲基纖維素鈉(10g/l)。

10、通過上述技術方案，分散穩(wěn)定劑的設置，可以使得丁酸梭菌能夠分散均勻的同時穩(wěn)定存在。

11、本發(fā)明還提供一種丁酸梭菌凍干粉的制備方法，其檢測步驟如下：

12、s1：將實驗室-80℃保存的丁酸梭菌菌種取出，以1％的接種量接種至梭菌增殖培養(yǎng)基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸鈉3.0g/l、氯化鈉5.0g/l、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/l)中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，得到菌種懸液；

13、s2：將菌種懸液按照體積比為5％的接種量接種于一級梭菌增殖培養(yǎng)基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸鈉3.0g/l、氯化鈉5.0g/l、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/l)中，在厭氧培養(yǎng)箱37℃條件下厭氧培養(yǎng)24h，得到一級菌種培養(yǎng)液；

14、s3：將一級菌種培養(yǎng)液按體積比為5％的接種量接種于二級梭菌增殖培養(yǎng)基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸鈉3.0g/l、氯化鈉5.0g/l、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/l)中，在厭氧培養(yǎng)箱37℃條件下厭氧培養(yǎng)24h，得到二級菌種培養(yǎng)液；

15、s4：將二級菌種培養(yǎng)液按體積比為5％的接種量接種于三級梭菌增殖培養(yǎng)基(牛肉粉10.0g/l、蛋白胨10.0g/l、酵母粉3.0g/l、可溶性淀粉1.0g/l、葡萄糖5.0g/l、乙酸鈉3.0g/l、氯化鈉5.0g/l、l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g/l)中，在厭氧培養(yǎng)箱37℃條件下厭氧培養(yǎng)24h，得到三級菌種培養(yǎng)液；

16、s5：將三級丁酸梭菌培養(yǎng)液按照體積比為5％的接種量接種于梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉膏33.1g/l、蛋白胨32.7g/l、可溶性淀粉24.2g/l、碳酸鈣24.7g/l、七水硫酸鎂0.25g/l、一水硫酸錳0.25g/l、發(fā)酵專用消泡劑1.0g/l)中，在37℃下攪拌10min，在厭氧培養(yǎng)箱37℃條件下厭氧培養(yǎng)24h。培養(yǎng)過程中每間隔2h攪拌5min，每間隔6h取樣進行革蘭氏染色觀察，芽孢應為直桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性；同時利用分光光度計測定od值，當活菌數(shù)大于2×109cfu/g時即代表丁酸梭菌已培養(yǎng)至對數(shù)期，此時即可獲取丁酸梭菌菌液；

17、s6：向丁酸梭菌菌液中加入可溶性淀粉(50g/l)，并進行混合，得到混合物，隨后分別于水中溶解蔗糖(40g/l)、甘露醇(8g/l)、半胱氨酸(1g/l)、維生素c(1g/l)、羧甲基纖維素鈉(10g/l)，后加入到混合物中進行混合，并進行冷凍離心(轉(zhuǎn)速為5500rpm，時間為25min)，得到丁酸梭菌菌泥；

18、s7：對丁酸梭菌菌泥進行平衡(溫度為37℃，時間為50min)，然后進行預冷凍(溫度為-40℃，時間為12h)，然后進行真空冷凍干燥(溫度≤-40℃，真空度為6pa，時間為22h)，得到丁酸梭菌凍干粉。

19、s8：將制備好的丁酸梭菌凍干粉按梯度兌水活化，活化半小時后震勻，用移液槍吸取100μl到梭菌選擇培養(yǎng)基上涂板，置于37℃下厭氧培養(yǎng)16h，觀察菌落生長情況。此外，試驗同步設立一個丁酸梭菌原液對照組，該組不添加任何添加劑，與活化后的凍干粉進行菌落生長能力對比。

20、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種丁酸梭菌凍干粉及其制備方法，具備以下有益效果：

21、(1)本發(fā)明實施例提供的一種丁酸梭菌凍干粉，其活菌數(shù)大于2×109cfu/g，含水率小于2％，且芽孢處于休眠狀態(tài)，因此有利于菌種長時間的保藏，且菌種在保藏過程中不會發(fā)生退化，也就不會影響代謝系統(tǒng)，可減少在接種過程中，由于不停的傳代擴培所帶來的衰退。

22、(2)本發(fā)明實施例提供的一種丁酸梭菌凍干粉，由于丁酸梭菌處于芽孢休眠狀態(tài)，因此方便在發(fā)酵生產(chǎn)中接種，接種的干粉菌種能快速的進行芽胞萌發(fā)，形成營養(yǎng)體細胞，減少接種步驟，保持菌種活性，縮短生產(chǎn)周期。

23、(3)本發(fā)明實施例提供的一種制備丁酸梭菌凍干粉的方法，通過對原始菌種進行活化、擴培，在三級液體培養(yǎng)液中，按比例加入載體(可溶性淀粉)、凍干保護劑(蔗糖、甘露醇、半胱氨酸、維生素c)、分散穩(wěn)定劑(羧甲基纖維素鈉)，并利用冷凍離心機進行離心收集菌體混合物，再將收集的菌體混合物通過真空冷凍干燥處理，所得的凍干粉利用平板計數(shù)法，可知凍干粉菌種的活菌數(shù)含量大于2×109cfu/g。

24、(4)本發(fā)明實施例提供的一種制備丁酸梭菌凍干粉的方法，制作的干粉菌種相比試管菌種具有保藏時間長、容易保藏、不易于發(fā)生退化，菌落數(shù)多、方便接種等優(yōu)點，并且在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，利用干粉菌種可以縮短生產(chǎn)周期、減少微生物傳代中發(fā)生自發(fā)突變概率，提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點。