背景技術(shù)：

1、由新型冠狀病毒sars-cov-2引起的covid-19大流行已經(jīng)引起了大規(guī)模的全球混亂。降低疾病和感染風(fēng)險(xiǎn)的最重要希望被認(rèn)為是開發(fā)有效和大量的sars-cov2疫苗的方法。

2、s蛋白，即sars-cov-2的最關(guān)鍵表面蛋白，是具有許多糖基化修飾的、大的三聚體跨膜糖蛋白，這些糖基化修飾在病毒表面形成獨(dú)特的花冠結(jié)構(gòu)。s蛋白由s1亞單位和s2亞單位組成。sars-cov2-s的總長(zhǎng)度是1273個(gè)氨基酸，并由位于n-末端的信號(hào)肽(1-13位氨基酸)、s1亞單位(14-685位殘基)和s2亞單位(686-1273位殘基)組成；最后兩個(gè)區(qū)域分別負(fù)責(zé)受體結(jié)合和膜融合。在s1亞單位中，存在n-末端結(jié)構(gòu)域(14-305位殘基)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(319-541位殘基)；

3、融合肽(fp)(788-806位殘基)、七肽重復(fù)序列1(hr1)(912-984位殘基)、hr2(1163-1213位殘基)、tm結(jié)構(gòu)域(1213-1237位殘基)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(1237-1273位殘基)組成s2亞單位(huang等人，2020)。s1亞單位主要含有受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rbd)，負(fù)責(zé)識(shí)別受體。涉及rbd相關(guān)氨基酸的突變導(dǎo)致病毒種類偏好和感染特征的改變。s2亞單位包含膜融合所必需的元件。s蛋白在病毒與宿主細(xì)胞膜受體的結(jié)合以及病毒與宿主細(xì)胞膜受體的融合中起關(guān)鍵作用。鑒于s蛋白在sars-cov2感染和適應(yīng)性免疫中的關(guān)鍵作用，s蛋白是中和抗體的重要靶位點(diǎn)和疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵靶標(biāo)。

4、粗略地說(shuō)，在識(shí)別出第一例covid-19后3年，許多疫苗獲得了美國(guó)fda的緊急使用授權(quán)(eua)。用于開發(fā)這些疫苗的新技術(shù)也有助于加快開發(fā)候選疫苗的速度。

5、在臨床試驗(yàn)的64種covid-19疫苗中，44種基于s蛋白，其中29種基于全長(zhǎng)s蛋白(65.91％，29/44)，14種基于s蛋白rbd(31.82％，14/44)，1種基于s蛋白s-2p(2.27％，1/44)。此外，基于s蛋白的核苷酸序列設(shè)計(jì)modernamrna-1273疫苗和pfizer-biontechbnt162b2疫苗(golob等人，2021)。

6、三種主要的全滅活病毒(wiv)疫苗開始廣泛分發(fā)。幾種基于蛋白質(zhì)和基于蛋白質(zhì)顆粒的疫苗正在取得有希望的結(jié)果(hotez和bottazzi，2021)

7、傳統(tǒng)上，疫苗從確定目標(biāo)和選擇平臺(tái)到完成i期、ii期和iii期臨床試驗(yàn)以及最終獲得監(jiān)管批準(zhǔn)需要超過(guò)10年的時(shí)間。世界范圍內(nèi)的大規(guī)模sars-cov2感染和巨大的死亡人數(shù)要求采取不同的方法。在2020年5月，美國(guó)政府建立了“曲速行動(dòng)”(operation?warpspeed)，這是一個(gè)公私合作關(guān)系，旨在加速covid-19疫苗、治療劑和診斷劑的開發(fā)、生產(chǎn)和分發(fā)(golob等人，2021)。

8、盡管形勢(shì)緊迫，sars-cov2疫苗的開發(fā)通過(guò)與其他疫苗相同的步驟進(jìn)行：目標(biāo)確定、平臺(tái)選擇、候選疫苗的設(shè)計(jì)和分階段的人體臨床試驗(yàn)。在i期和ii期臨床試驗(yàn)中，對(duì)sars-cov2疫苗的免疫應(yīng)答主要基于針對(duì)s蛋白和rbd的抗體的檢測(cè)來(lái)確定?；谂c恢復(fù)期血漿中發(fā)現(xiàn)的抗體滴度相似的抗體滴度檢測(cè)和與病毒中和測(cè)定中有效水平相當(dāng)?shù)膃lisa抗體檢測(cè)結(jié)果，假定針對(duì)sars-cov2感染的保護(hù)。

9、i/ii期試驗(yàn)集中于劑量發(fā)現(xiàn)、安全性和免疫原性的測(cè)量(例如，針對(duì)sars-cov2-s蛋白的中和抗體的開發(fā))。iii期試驗(yàn)需要雙盲、隨機(jī)和安慰劑對(duì)照，并且考慮緊急使用授權(quán)(eua)需要最少2個(gè)月的安全性數(shù)據(jù)(golob等人，2021)。

10、在發(fā)病后7天至10天內(nèi)，檢測(cè)針對(duì)病毒表面糖蛋白(主要是刺突(s)糖蛋白)的病毒特異性抗體(iga和igm，然后是igg)。研究表明中和抗體是短暫的，在幾個(gè)月內(nèi)下降到不可檢測(cè)的水平。

11、目前報(bào)道的效力估計(jì)是基于首劑候選疫苗后的前3-4個(gè)月期間的數(shù)據(jù)。因此，為了阻止病毒的傳播，整個(gè)人群的至少60％應(yīng)在2-3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行免疫。然而，上述疫苗生產(chǎn)方法不能在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出足夠的疫苗來(lái)接種如此龐大的人群。因此，實(shí)現(xiàn)疫苗接種目標(biāo)的持續(xù)挑戰(zhàn)包括生產(chǎn)出足夠的疫苗來(lái)接種龐大人群和供應(yīng)鏈問(wèn)題，及時(shí)和公平的分發(fā)，以及不斷出現(xiàn)的病毒變體的持續(xù)威脅。

12、因此，需要能夠在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)的有效疫苗方法。

13、一些研究表明sars-cov2刺突蛋白單獨(dú)穿過(guò)血腦屏障(rhea等人，2021)。

14、此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，沒有完整的病毒體或基因組的sars-cov2?s蛋白的s1亞單位在來(lái)自肺的培養(yǎng)人血管中觸發(fā)生長(zhǎng)信號(hào)并且介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的增生和/或肥大，從而導(dǎo)致復(fù)雜的心血管結(jié)果(suzuki等人，2020)。

15、本發(fā)明涉及在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)安全有效的sars-cov2疫苗的方法。

16、本發(fā)明基于lontok等人描述的冠狀病毒刺突蛋白的細(xì)胞內(nèi)靶信號(hào)區(qū)(lontok等人，2004)。

17、根據(jù)他們的發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間區(qū)室(ergic)出芽需要在分泌途徑中的這一點(diǎn)上積累病毒包膜蛋白。他們證明了來(lái)自第3組冠狀病毒傳染性支氣管炎病毒(ibv)的刺突(s)蛋白在其胞質(zhì)尾中含有典型的雙賴氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢索信號(hào)(-kkxx-cooh)。該信號(hào)可在ergic中保留嵌合報(bào)告蛋白，并且當(dāng)該蛋白突變時(shí)允許全長(zhǎng)s蛋白以及嵌合體轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜上。最近，boson等人指出包膜蛋白(e)和膜蛋白(m)調(diào)節(jié)s的胞內(nèi)運(yùn)輸及其胞內(nèi)加工。事實(shí)上，數(shù)據(jù)顯示，在e或m共表達(dá)時(shí)，s重新定位在ergic或高爾基體區(qū)室，如在sars-cov-2感染的細(xì)胞中觀察到的，這阻止了合胞體的形成。他們還表明，在s的胞質(zhì)尾中的c-末端檢索基序是m介導(dǎo)的s在ergic中的保留所必需的，而e通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌途徑誘導(dǎo)s保留。他們還表明，所制備的在c末端區(qū)具有21個(gè)氨基酸缺失的s蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，并且該s蛋白基本上位于細(xì)胞膜中，這導(dǎo)致合胞體的形成。

18、他們得出結(jié)論，sars-cov2-s胞質(zhì)尾的c-末端部分對(duì)于s蛋白在ergic區(qū)室中的保留是必需的(boson等人，2020)。

19、因此，我假設(shè)當(dāng)sars-cov2-sδ21蛋白在沒有m表達(dá)的細(xì)胞中異位表達(dá)時(shí)，它將密集地位于細(xì)胞質(zhì)膜中而不保留在ergic中。此外，e蛋白的缺失將增加sars-cov2-s向細(xì)胞膜的分泌，并阻止sars-cov2-s在ergic中的保留。重要的是，與通過(guò)其他不同方法獲得s蛋白的條件相比，sars-cov2-sδ21蛋白將以其最天然的形式位于細(xì)胞膜中(hotez和bottazzi，2021)。

20、因此，我假設(shè)sars-cov2-s蛋白的抗原s1亞單位以其天然結(jié)構(gòu)在真核生物細(xì)胞膜中的大量呈遞及其作為全細(xì)胞或細(xì)胞膜的用途為sars-cov-2的新疫苗接種方案。以其天然結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜中大量呈遞sars-cov2的s1將提供強(qiáng)得多和更具特異性的免疫應(yīng)答。

21、最重要的是，以這種方式，有可能在短時(shí)間內(nèi)使用細(xì)胞系制備幾乎無(wú)限量的天然形式的sars-cov2-s抗原。

22、此外，由于s蛋白會(huì)附著在細(xì)胞膜上，無(wú)法自由循環(huán)，因此將不能通過(guò)血腦屏障，也可能不會(huì)表現(xiàn)出上述細(xì)胞信號(hào)刺激作用。

23、癌癥患者中的全死亡腫瘤細(xì)胞(自體或同種異體)疫苗接種已經(jīng)測(cè)試了很長(zhǎng)時(shí)間，并且其臨床應(yīng)用已經(jīng)被批準(zhǔn)和使用。neller等人檢查了173項(xiàng)已公布的同行評(píng)審免疫療法試驗(yàn)的臨床結(jié)果，這些試驗(yàn)使用了黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、胰腺癌或卵巢癌。他們表明，同種異體和自體的全腫瘤細(xì)胞都不引起任何顯著的副作用(neller等人，2008)

24、因此，在sars-cov2-sδ21在同種異體癌細(xì)胞中表達(dá)后，將可能將其作為全細(xì)胞(死亡)或細(xì)胞膜提取物用于疫苗接種。使用永生的自體和/或同種異體原代組織細(xì)胞或干細(xì)胞來(lái)表達(dá)sars-cov2-sδ21也是本發(fā)明的目的之一。

25、使用表達(dá)sars-cov2-s的活細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)之一是，來(lái)自死亡細(xì)胞的熱休克蛋白、尿酸、hmgb1(高遷移率族蛋白1)、atp和雙鏈基因組dna的出現(xiàn)具有佐劑效應(yīng)，如先前研究所示(radford等人，2014)。

26、最近，外泌體在癌癥疫苗和治療中的應(yīng)用變得越來(lái)越重要。外泌體是來(lái)源于晚期核內(nèi)體區(qū)室，能夠在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和rna的納米大小的膜囊泡。研究外泌體作為癌癥疫苗或療法的大多數(shù)研究集中于能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的全抗原負(fù)載的外泌體(nicolini等人，2021)。此外，最近的發(fā)現(xiàn)表明，b細(xì)胞和樹突細(xì)胞(dc)釋放表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(mhc)i類和ii類的外泌體以及共刺激分子(cd80/86)，并且可以mhc依賴性方式誘導(dǎo)肽特異性t細(xì)胞增殖(liu等人，2019)。

27、因此，s蛋白以其天然形式在細(xì)胞膜中大量表達(dá)并將其用于疫苗接種目的與外泌體疫苗方案相似。此外，已知與外泌體相反，所有組織在它們的細(xì)胞膜中含有mhci表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、外泌體是能夠在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和rna的納米大小的膜囊泡。全抗原負(fù)載的外泌體能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。

2、本發(fā)明是根據(jù)免疫應(yīng)答的邏輯開發(fā)的，該免疫應(yīng)答是負(fù)載在外泌體上的蛋白質(zhì)(抗原)轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)果。在本發(fā)明中，不是通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)抗原，而是基于通過(guò)將蛋白質(zhì)(抗原)負(fù)載到細(xì)胞膜中、提供抗原呈遞和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。

3、sars-cov2-s胞質(zhì)尾的c-末端部分對(duì)于s蛋白在ergic區(qū)室中的保留是必需的。因此，在本發(fā)明中，假設(shè)sars-cov2-s蛋白的c區(qū)氨基酸缺失將使sars-cov2-s蛋白在細(xì)胞膜中發(fā)生而不保留在ergic中。重要的是，它們將以其最天然的形式存在于細(xì)胞膜中。因此，本發(fā)明基于去除了最后21個(gè)氨基酸的sars-cov2-s的s2亞片段蛋白，將抗原蛋白(s1亞片段)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜并在那里密集呈遞(圖1b、圖1c)。

4、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，sars-cov2刺突δ21過(guò)表達(dá)將sars-cov2-s蛋白置于細(xì)胞膜中(圖1f至圖1j)。

5、因此，本發(fā)明提供了在真核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)并作為新型冠狀病毒sars-cov2疫苗呈遞在細(xì)胞膜中/帶有細(xì)胞膜且去除了最后21個(gè)氨基酸的完整sars-cov2-s蛋白(刺突δ21)片段。

6、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是使用被設(shè)計(jì)用于四環(huán)素誘導(dǎo)型逆轉(zhuǎn)錄病毒哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的載體系統(tǒng)進(jìn)行sars-cov2-sδ21基因的表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入強(qiáng)力霉素(dox)來(lái)控制。

7、本發(fā)明證實(shí)，根據(jù)sars-cov2-s蛋白的表達(dá)量，在dox加入后24小時(shí)在hep3b細(xì)胞中觀察到細(xì)胞-細(xì)胞融合，而在48小時(shí)后觀察到細(xì)胞的進(jìn)一步統(tǒng)一破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖2a)。盡管sars-cov2-sδ21的表達(dá)不如在hep3b細(xì)胞中顯著，但在renca和mad109細(xì)胞中也產(chǎn)生融合(圖1i和圖1j)

8、本發(fā)明還證實(shí)，表達(dá)sars-cov2刺突δ21的細(xì)胞在細(xì)胞膜中提供了大量的刺突蛋白表達(dá)，這通過(guò)除斑點(diǎn)印跡和ihc測(cè)定之外的elisa測(cè)定來(lái)確定(圖3a至圖3e)。

9、因此，本發(fā)明提供了elisa測(cè)定來(lái)測(cè)量感染或接種了sars-cov2的人的血清中抗sars-cov2-s抗體(igm、igg和iga)的水平。

10、本發(fā)明也首次提出，由于細(xì)胞中sars-cov2-sδ21過(guò)表達(dá)，s1蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜并取代主要的膜蛋白spta1和cdh2。可以確定，包括spta1或cdh2的細(xì)胞膜蛋白在細(xì)胞膜以類似于細(xì)胞膜中s蛋白的增加量的速率減少。這些結(jié)果通過(guò)斑點(diǎn)印跡和elisa證實(shí)(圖4a至圖4h)

11、本發(fā)明還提出，使用在其膜中表達(dá)sars-cov2-sδ21的同種異體癌細(xì)胞作為疫苗誘導(dǎo)大量的sars-cov2-s蛋白特異性抗體(圖5a、圖5b)。

12、本發(fā)明還證實(shí)，使用表達(dá)sars-cov2-s蛋白的同種異體細(xì)胞的活細(xì)胞、死亡(紫外線處理，凍融)細(xì)胞或僅細(xì)胞膜誘導(dǎo)大量的sars-cov2-s蛋白特異性抗體(數(shù)據(jù)未示出)。

13、本發(fā)明還證實(shí)，由于通過(guò)不同方法如光學(xué)、機(jī)械、電學(xué)和化學(xué)裂解技術(shù)獲得細(xì)胞膜，使用上述細(xì)胞或細(xì)胞膜還誘導(dǎo)了大量的sars-cov2-s蛋白特異性抗體(數(shù)據(jù)未示出)。

14、結(jié)果，在用含cfa的表達(dá)sars-cov2-s的rencawhc(whc-s)單次疫苗接種免疫的小鼠中s蛋白特異性igg的平均終點(diǎn)滴度顯著高于在接受含cfa的pbs的小鼠中觀察到的結(jié)果(圖5a)。另外，在用表達(dá)sars-cov2-s的cm(cm-s)免疫的小鼠中，s蛋白特異性igg雖然不顯著，但與用whc-s免疫的小鼠組相比觀察到略微增加(圖5c)。此外，在whc-s和cm-s免疫中加入cfa免疫略微增加了s蛋白特異性igg，盡管不是顯著的(圖5d)。

15、已確定用cm-s疫苗接種產(chǎn)生比用bnt162b2疫苗接種在統(tǒng)計(jì)學(xué)上強(qiáng)得多的免疫應(yīng)答。還確定了這兩組疫苗接種系統(tǒng)之間的差異在單劑量疫苗接種中更高(圖5e)。此外，與人恢復(fù)期患者血清(hcps)庫(kù)相比，用cm-s疫苗接種產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，即使是單劑量的cm-s疫苗接種也是如此(圖5e)。

16、在用呈遞sars-cov2-s蛋白(cm-s)的細(xì)胞膜和用sars-cov2-s蛋白的rbd單位包被的nm進(jìn)行的兩種中和試驗(yàn)中，與bnt162b2疫苗和hcps相比，在用cm-s雙重疫苗接種中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。所有中和試驗(yàn)都是用加強(qiáng)劑量后獲得的血清完成的(圖6a和圖6b)。

17、類似于上述中和試驗(yàn)，在活sarscov-2中和測(cè)定中，與bnt162b2疫苗和hcps相比，在用cm-s雙重疫苗接種中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。cm-s中的平均nt50(50％中和滴度)值分別為在bnt162b2疫苗和hcps中觀察到的值的3.8倍和4.2倍(圖6c)。

18、陳述

19、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從sars-cov2-s的s2亞片段蛋白中去除的氨基酸的數(shù)目可小于21個(gè)氨基酸，諸如20、19、18、17、16、15、14、13個(gè)或更少的氨基酸

20、在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，從sars-cov2-s的s2亞片段蛋白中去除的氨基酸的數(shù)目可多于21個(gè)氨基酸，諸如22、23、24、25、26、27個(gè)或更多的氨基酸。

21、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是sars-cov2-s的s2亞單位，其轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞膜融合的蛋白質(zhì)，可能不需要該亞單位的包括fp、hr1、hr2、tm和ct結(jié)構(gòu)域的所有區(qū)段來(lái)執(zhí)行到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

22、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是將優(yōu)選使用被設(shè)計(jì)用于四環(huán)素誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的載體系統(tǒng)進(jìn)行sars-cov2-sδ21基因的表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入dox來(lái)控制。其他誘導(dǎo)型載體系統(tǒng)也可用于此目的。

23、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是誘導(dǎo)型載體系統(tǒng)可以是重組病毒相關(guān)的，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒或腺病毒相關(guān)載體、噬菌體或任何其他病毒系統(tǒng)。

24、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是也可使用提供sars-cov2-s蛋白持續(xù)表達(dá)的重組病毒相關(guān)的載體系統(tǒng)，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒或腺病毒相關(guān)的載體系統(tǒng)，只要它們的表達(dá)不損害所用細(xì)胞。

25、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是sars-cov2-sδ21基因的表達(dá)將優(yōu)選使用含有ef1啟動(dòng)子的載體系統(tǒng)進(jìn)行。也可以使用cmv和其他含有啟動(dòng)子的、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的載體系統(tǒng)

26、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的細(xì)胞膜(cm)，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從同種異體癌細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

27、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的死亡細(xì)胞(whc)，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從同種異體癌細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

28、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的whc(活的)，在其膜(whc-s)中呈遞從同種異體原代組織細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

29、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的cm，在其結(jié)構(gòu)(cm-s)中呈遞從同種異體原代組織細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

30、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的cm-s，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從原代永生化同種異體細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

31、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有在受體中產(chǎn)生同種異體免疫應(yīng)答的mhc抗原的活細(xì)胞，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從原代永生化同種異體細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

32、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的whc(活的)，在其膜中呈遞從同種異體干細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗，該同種異體干細(xì)胞系包括胚胎干細(xì)胞系、間充質(zhì)干細(xì)胞系、胎兒干細(xì)胞系、成體干細(xì)胞系、羊膜干細(xì)胞系。

33、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的具有在受體中產(chǎn)生同種異體免疫應(yīng)答的mhc抗原的whc(活的)，在其膜中呈遞從同種異體干細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗，該同種異體干細(xì)胞系包括胚胎干細(xì)胞系、間充質(zhì)干細(xì)胞系、胎兒干細(xì)胞系、成體干細(xì)胞系、羊膜干細(xì)胞系。

34、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的cm-s，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從同種異體干細(xì)胞獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗，該同種異體干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞系、間充質(zhì)干細(xì)胞系、胎兒干細(xì)胞系、成體干細(xì)胞系、羊膜干細(xì)胞系。

35、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用抗原呈遞細(xì)胞(apc)的活細(xì)胞(同種異體的、原代的、永生的)在其結(jié)構(gòu)中呈遞sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗，該抗原呈遞細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞，尤其是如本發(fā)明所述制備的樹突細(xì)胞。其中將選擇apc細(xì)胞，以由于它們攜帶的mhc抗原而在受體中引發(fā)免疫應(yīng)答。

36、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的cm-s(同種異體的、繼發(fā)的、癌癥的、永生的)，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從apc獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

37、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的whc(活的)，在其膜中呈遞從自體干細(xì)胞、原代組織細(xì)胞(永生化)系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

38、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的cm-s，在其結(jié)構(gòu)中呈遞從自體干細(xì)胞、原代組織細(xì)胞系獲得的sars-cov2-sδ21作為sars-cov2疫苗。

39、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了sars-cov2-s蛋白在cm上的表達(dá)導(dǎo)致其他cm蛋白的置換并在cm中減少它們，這最終阻止了不需要的背景抗體的形成。

40、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用表達(dá)sars-cov2-s蛋白的cm-s作為疫苗將阻止形成不需要的背景抗體。

41、本發(fā)明在膜中具有sars-cov2-s的自體或同種異體細(xì)胞中用于免疫的用途，將阻止不需要的背景抗體的形成，并將確保獲得靶sars-cov2-s特異性純抗體。

42、在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)針對(duì)sars-cov-2的sars-cov-2-s蛋白的抗體的方法。

43、在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定作為疾病標(biāo)志物的抗體和/或抗原的免疫診斷檢測(cè)試劑盒的方法。例如，通過(guò)elisa搜索covid-19?s-特異性抗體，其中孔用通過(guò)本發(fā)明方法獲得的呈遞sars-cov2-s蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞膜包被。

44、在其中獲得蛋白質(zhì)(抗原)然后獲得特異性抗體的本發(fā)明方法中，可使用多種測(cè)定。例如，各種免疫測(cè)定可用于檢測(cè)本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)(抗原)。這種免疫測(cè)定通常涉及測(cè)量蛋白質(zhì)或肽(即抗原)與其特異性抗體之間的抗原/抗體復(fù)合物形成。

45、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了使用在細(xì)胞培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的、在其膜中表達(dá)sars-cov2-s蛋白的細(xì)胞進(jìn)行elisa試驗(yàn)的機(jī)會(huì)。在該試驗(yàn)中，透化將是不必要的，因?yàn)閟ars-cov2-s蛋白在細(xì)胞膜中強(qiáng)烈且天然地存在(圖3a至圖3d)。

46、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在開發(fā)elisa系統(tǒng)或其他抗體篩選試驗(yàn)中使用含有sars-cov2-sδ21的細(xì)胞膜的機(jī)會(huì)。在該試驗(yàn)中，使用在其天然結(jié)構(gòu)中含有大量sars-cov2-s蛋白的細(xì)胞膜包被elisa板。

47、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了使用含有sars-cov2-s蛋白的細(xì)胞膜來(lái)生產(chǎn)針對(duì)s蛋白的抗體的機(jī)會(huì)。其中在其膜中呈遞sars-cov2-s蛋白的細(xì)胞可以是同種異體的。

48、在本發(fā)明的另一方面，提供了使用如本發(fā)明所述制備的完整同種異體癌細(xì)胞、原代細(xì)胞、干細(xì)胞的機(jī)會(huì)，在其膜中以其天然結(jié)構(gòu)呈遞大量sars-cov2-s蛋白將用于生產(chǎn)針對(duì)s蛋白的抗體。

49、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的同種異體細(xì)胞(癌細(xì)胞、原代細(xì)胞、干細(xì)胞)的活細(xì)胞，在其結(jié)構(gòu)中含有sars-cov2-sδ21，用于生產(chǎn)針對(duì)s蛋白的抗體。其中將選擇細(xì)胞，以由于它們攜帶的mhc抗原而在受體中引發(fā)免疫應(yīng)答。

50、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用如本發(fā)明所述制備的apc的活細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞，尤其是樹突細(xì)胞，在其膜中含有sars-cov2-sδ21，用于生產(chǎn)針對(duì)s蛋白的抗體。其中將選擇apc細(xì)胞，以由于它們攜帶的mhc抗原而在受體中引發(fā)免疫應(yīng)答。

51、本發(fā)明的范圍還包括由于密碼子優(yōu)化算法而可能在s1或s2中發(fā)生的所有核苷酸變化。本發(fā)明的核酸序列衍生物與天然核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。

52、本發(fā)明的范圍還包括以下內(nèi)容；

53、也可以通過(guò)融合s1至s2的不同表位的編碼序列以在細(xì)胞膜上呈遞，來(lái)呈遞sars-cov2-s1的不同表位，包括rbd或rbd的部分或衣殼蛋白。

54、本發(fā)明的范圍不旨在限于sars-cov2相關(guān)疫苗接種程序、抗體生產(chǎn)、elisa系統(tǒng)的開發(fā)或其他抗體篩選試驗(yàn)。本發(fā)明提供了疫苗接種程序、抗體生產(chǎn)、elisa系統(tǒng)的開發(fā)或其他抗體篩選試驗(yàn)程序，因?yàn)檫@能夠使所有病毒的抗原表位通過(guò)sars-cov2-s2蛋白呈遞到細(xì)胞膜上。

55、因此，由于將任何具有抗原特性的病毒蛋白與sars-cov2-s2蛋白融合，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在sars-cov2-s2的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜且在那里集中呈遞，本發(fā)明涵蓋了包括hiv在內(nèi)的所有病毒。

56、在另一個(gè)實(shí)施方案中，由于將任何具有抗原特性的細(xì)菌蛋白與s2蛋白融合，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在s2的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜且在那里集中呈遞，本發(fā)明提供了疫苗接種程序、抗體生產(chǎn)、elisa系統(tǒng)的開發(fā)或其他抗體篩選試驗(yàn)程序。

57、因此，由于將任何具有抗原特性的細(xì)菌蛋白與sars-cov2-s2蛋白融合，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在sars-cov2-s2的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜且在那里集中呈遞，本發(fā)明涵蓋了所有細(xì)菌的疫苗接種方案。

58、在另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防病毒感染的方法，由于融合多種病毒蛋白(在同一細(xì)胞膜中多于一種)顯示出與sars-cov2-s2蛋白不同的抗原結(jié)構(gòu)，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在sars-cov2-s2蛋白的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜且在那里集中呈遞給免疫系統(tǒng)，得到了疫苗接種方案。

59、在另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防細(xì)菌感染的方法，由于將顯示不同抗原結(jié)構(gòu)的多種細(xì)菌蛋白與s2蛋白融合，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在s2的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜且在那里將其自身集中呈遞給免疫系統(tǒng)，得到了疫苗接種方案。

60、當(dāng)細(xì)菌或病毒相關(guān)蛋白不需要完整的情況下，有可能通過(guò)結(jié)合sars-cov2-s的s2亞單位來(lái)呈遞顯示抗原特性的較小表位。

61、因此，在另一方面，本發(fā)明還提供了一種方法，其中有可能通過(guò)使用sars-cov2-s的s2亞單位來(lái)呈遞病毒或細(xì)菌的多于一種抗原結(jié)構(gòu)。這自然會(huì)得到強(qiáng)得多的疫苗接種方案。

62、在另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防癌癥的方法，由于將腫瘤相關(guān)蛋白與s2蛋白融合，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在s2的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜因而在那里將其自身集中呈遞給免疫系統(tǒng)，得到了疫苗接種方案。在此，腫瘤抗原表達(dá)的細(xì)胞可以是來(lái)自供體的具有不同mhc抗原的活的自體原代干細(xì)胞、同種異體原代干細(xì)胞和癌細(xì)胞系。此外，所有細(xì)胞類型均可用于異位表達(dá)腫瘤相關(guān)蛋白并在s2蛋白的幫助下將其轉(zhuǎn)運(yùn)并摻入cm中，然后將cm用作天然載體。

63、在另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防癌癥的方法，由于將顯示不同抗原結(jié)構(gòu)的多種腫瘤相關(guān)蛋白(或表位)與sars-cov2-s2蛋白融合，確保它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，并在s2的幫助下將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜因而在那里將其自身集中呈遞給免疫系統(tǒng)，得到了強(qiáng)得多的疫苗接種方案。

64、盡管本發(fā)明將sars-cov2-s蛋白的s2亞單位描述為抗原蛋白載體，但是質(zhì)膜蛋白諸如水泡性口炎病毒g(vsv-g)的不同dna序列也可執(zhí)行相同的功能，該水泡性口炎病毒g是充分研究的質(zhì)膜蛋白(miyanohara，2012)。因此，本發(fā)明的范圍不限于使用sars-cov2-s蛋白的s2亞單位作為抗原表位載體，攜帶蛋白質(zhì)到細(xì)胞中細(xì)胞膜的一個(gè)或多個(gè)其他蛋白質(zhì)分子也可用于相同的目的。