本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及一種糖基轉移酶ugt76g4突變體及其應用。

背景技術：

1、甜菊醇糖苷是一類從甜葉菊中提取的天然產物，具有高甜度、低熱量等特點，被稱為繼蔗糖、甜菜糖外的“世界第三糖源”，并且還具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抑菌以及降血糖等。由于甜菊醇糖苷及其衍生物價格相對低廉且易于大量提取制備，已被廣泛應用于食品飲料、醫(yī)藥和有機化學等領域。其中的萊鮑迪苷a、萊鮑迪苷d的甜度約為蔗糖的200-300倍，且口感較好，但在甜葉菊中的含量較少，分離提取成本較高，無法滿足市場需求。

2、糖基轉移酶ugt76g1能夠將葡萄糖基團轉移到甜菊醇糖苷的c-13位，形成β-1,3糖苷鍵從而對于生成高甜度、低熱量的甜菊醇糖苷，但野生型的糖基轉移酶ugt76g1的酶活較低。在專利cn?115094074?b中公開了一種糖基轉移酶ugt76g1的突變體：糖基轉移酶ugt76g4，然而其對甜菊醇糖苷c-13位的催化活性較低。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種糖基轉移酶ugt76g4突變體及其應用，用于克服現(xiàn)有技術中糖基轉移酶ugt76g4?c13位的催化活性較低的問題。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種糖基轉移酶ugt76g4突變體，突變體的氨基酸序列與seq?id?no:1所示的序列具有至少90％的同一性，且與seq?id?no:1相比在第90位、或第90位和第88位上的氨基酸發(fā)生突變。

3、上述突變?yōu)椋旱?0位氨基酸由i突變?yōu)間，第88位氨基酸由m突變?yōu)閞或g。

4、上述突變體具有如seq?id?no:2至seq?id?no:4任一所示的氨基酸序列。

5、與現(xiàn)有技術中的糖基轉移酶ugt76g4（seq?id?no:1）相比，本發(fā)明提供的糖基轉移酶ugt76g4突變體的酶活顯著提高，是糖基轉移酶ugt76g4的1.5~2倍。

6、第二方面，本發(fā)明提供編碼上述突變體的核酸。

7、上述技術方案中核酸的核苷酸序列如seq?id?no:6~seq?id?no:8所示。

8、第三方面，本發(fā)明提供含有上述核酸的重組表達載體或重組菌株。

9、第四方面，本發(fā)明提供一種糖基轉移酶ugt76g4突變體的應用，糖基轉移酶ugt76g4突變體催化甜菊醇糖苷在c13位形成β-1,3糖苷鍵。

10、與現(xiàn)有技術中的糖基轉移酶ugt76g4相比，本發(fā)明中的糖基轉移酶ugt76g4突變體具有c13位偏好性，具有催化多種甜菊醇糖苷在c13位形成β-1,3糖苷鍵的功能，可用于制備多種甜菊醇糖苷。

11、進一步地，甜菊醇糖苷為stv，糖基轉移酶ugt76g4突變體以stv和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷a和udp。

12、進一步地，甜菊醇糖苷為萊鮑迪苷e，糖基轉移酶ugt76g4突變體以萊鮑迪苷e和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷d和udp。

13、進一步地，將上述糖基轉移酶ugt76g4突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以stv、udpg、蔗糖為底物進行催化反應制備萊鮑迪苷a。

14、上述技術方案將糖基轉移酶ugt76g4突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，轉移酶ugt76g4突變體以stv和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷a和副產物udp，蔗糖合酶能夠以副產物udp和蔗糖為底物重新合成udpg，從而建立了udpg循環(huán)再生體系，避免了udpg的額外添加，節(jié)約了生產成本。

15、進一步地，催化反應的反應體系中各組分的終濃度為：糖基轉移酶ugt76g4突變體酶液10~20od，蔗糖合酶酶液10~30od，蔗糖300~500mm，udpg1~1.5mm，stv30~50mm；和/或，催化反應的反應條件為：ph值為7~7.5，溫度為35~40℃。

16、上述技術方案優(yōu)化了催化反應的反應體系中各組分的終濃度和反應條件，進一步提高了反應產物萊鮑迪苷a的轉化量。

17、進一步地，將上述糖基轉移酶ugt76g4突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以萊鮑迪苷e、udpg、蔗糖為底物進行催化反應制備萊鮑迪苷d。

18、上述技術方案將糖基轉移酶ugt76g4突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，轉移酶ugt76g4突變體以萊鮑迪苷e和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷d和副產物udp，蔗糖合酶能夠以副產物udp和蔗糖為底物重新合成udpg，從而建立了udpg循環(huán)再生體系，避免了udpg的額外添加，節(jié)約了生產成本。

19、進一步地，催化反應的反應體系中各組分的終濃度為：糖基轉移酶ugt76g4突變體酶液10~20od，蔗糖合酶酶液10~30od，蔗糖300~500mm，udpg?1~1.5mm，萊鮑迪苷e?30~50mm；和/或，催化反應的反應條件為：ph值為7~7.5，溫度為35~40℃。

20、上述技術方案優(yōu)化了催化反應的反應體系中各組分的終濃度和反應條件，進一步提高了反應產物萊鮑迪苷d的轉化量。

技術特征：

1.一種糖基轉移酶ugt76g4突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列與seq?idno:1所示的序列具有至少90％的同一性，且與seq?id?no:1相比在第90位、或第90位和第88位上的氨基酸發(fā)生突變；

2.一種糖基轉移酶ugt76g4突變體的應用，其特征在于，權利要求1所述的糖基轉移酶ugt76g4突變體催化甜菊醇糖苷在c13位形成β-1?,3糖苷鍵。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述甜菊醇糖苷為stv，糖基轉移酶ugt76g4突變體以stv和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷a和udp。

4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述甜菊醇糖苷為萊鮑迪苷e，糖基轉移酶ugt76g4突變體以萊鮑迪苷e和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷d和udp。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，將權利要求1所述的糖基轉移酶ugt76g4突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以stv、udpg、蔗糖為底物進行催化反應制備萊鮑迪苷a。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述催化反應的反應體系中各組分的濃度為：糖基轉移酶ugt76g4突變體酶液10~20od，蔗糖合酶酶液10~30od，蔗糖300~500mm，udpg1~1.5mm，stv?30~50mm；和/或，

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，將權利要求1所述的糖基轉移酶ugt76g4突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以萊鮑迪苷e、udpg、蔗糖為底物進行催化反應制備萊鮑迪苷d。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述催化反應的反應體系中各組分的終濃度為：糖基轉移酶ugt76g4突變體酶液10~20od，蔗糖合酶酶液10~30od，蔗糖300~500mm，udpg?1~1.5mm，萊鮑迪苷e?30~50mm；和/或，

技術總結
本發(fā)明公開一種糖基轉移酶UGT76G4突變體及其應用，屬于基因工程技術領域。該糖基轉移酶UGT76G4突變體的氨基酸序列與SEQ?ID?NO:1所示的序列具有至少90％的同一性，且與SEQ?ID?NO:1相比在第90位、或第90位和第88位上的氨基酸發(fā)生突變。本發(fā)明提供的糖基轉移酶UGT76G4突變體的酶活顯著提高，是糖基轉移酶UGT76G4的1.5~2倍。

技術研發(fā)人員：朱理平,王濱,徐良平,宋維才,杜萌萌,劉歡,邵金慧
受保護的技術使用者：諸城市浩天藥業(yè)有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/9