本發(fā)明涉及一種可用于檢測的熒光傳感器的制備和應(yīng)用，具體來說，涉及可比率檢測半胱氨酸的水溶性熒光傳感器的制備及其應(yīng)用，屬于化學(xué)材料制備及分析檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

半胱氨酸(cys)是廣泛存在于生物細(xì)胞中一種非常重要的還原性物種，也是人體的必須具有生理功能氨基酸之一，同時也是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中具有還原性基團(tuán)巰基(-sh)的氨基酸之一，在維持細(xì)胞的氧化還原進(jìn)程中起著重要的作用，且水平異常的生物硫醇會導(dǎo)致各種各樣的疾病，例如發(fā)育緩慢、頭發(fā)退色、水腫、精神萎靡、肝臟疾病、皮膚損傷、低血糖腦損傷及瘦弱等。此外，cys已在醫(yī)藥、食品添加劑和化妝品中廣泛應(yīng)用，可見其在生物世界起相當(dāng)重要的作用。

目前，已經(jīng)發(fā)展起來的檢測半胱氨酸的方法很多，但是主要以小分子傳感器為主。然而，涉及到小分子傳感器，便不能忽視其所特有的缺陷，首先是小分子傳感器大多數(shù)在純有機(jī)溶劑或者混合溶劑中工作，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑的生物毒性限制了它的可應(yīng)用性；其次是小分子傳感器在水中會因?yàn)楸舜酥g的π-π相互作用導(dǎo)致聚集，進(jìn)一步限制了可應(yīng)用性。這也導(dǎo)致這類傳感器在實(shí)際檢測中運(yùn)用的可行性降低。此外，目前的傳感器主要是利用單波長發(fā)射來檢測半胱氨酸，相比于單波長發(fā)射容易受到儀器波動，樣品濃度，環(huán)境等因素的影響，雙波長比率熒光探針因其雙波長比率檢測的有點(diǎn)可以有效的避免單波長所面臨的缺陷。除此之外，水溶性熒光傳感器因其優(yōu)異的水溶性、低細(xì)胞毒性、無有機(jī)溶劑殘留、可設(shè)計(jì)性強(qiáng)、高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，受到了越來越多的關(guān)注，在化學(xué)、醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域顯示了極其廣闊的應(yīng)用前景。

此外，目前針對于半胱氨酸（cys），高半胱氨酸（hcy）和谷胱甘肽（gsh）的熒光傳感器已經(jīng)有很多被制備，但是仍然存在著幾個問題，首先是已經(jīng)報(bào)道的很多熒光傳感器不能夠很好的區(qū)分這三種具有還原性基團(tuán)巰基(-sh)的氨基酸(chen.w,etal.anal.chem2016,88(7),3638-3646;wang.p,etal.sensactuatorsb2017,245,297-304;li.y,etal.biosensbioelectron2017,90,117-124;chen.z,etal.biosensbioelectron2017,91,553-559;gao.q,etal.analchem2017,89(8),4517-4524.)。其次是水溶性和生物毒性。雖然已經(jīng)有利用異硫氰酸熒光素和丙烯酰氯結(jié)合特異性識別cys(ma.d,etal.chemasianj2015,10(4),894-902)，但是這個探針要有乙腈（體積含量大約為30%）作為助溶劑，除此之外也有一些針對于區(qū)分這三種氨基酸的熒光探針(li.r,etal.jmolstruct2017,1136,1-6;ma.d,etal.chemasianj2015,10(4),894-902;song.x,etal.analmethods2017,9(12),1891-1896;han.c,etal.acsapplmaterinterfaces2015,7(50),27968-27975.)，然而這些探針都面臨著一個突出的缺陷，就是需要在有機(jī)溶劑和水的混合溶劑中工作。眾所周知，有機(jī)溶劑的細(xì)胞毒性是一個很大的問題，并且小分子熒光探針本身也有很大的生物毒性，這在很大程度上限制了在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

因此，發(fā)明一種簡單、低成本、優(yōu)良的水溶性、生物毒性低、且高效的可比率檢測半胱氨酸的水溶性熒光傳感器具有相當(dāng)重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可比率檢測半胱氨酸的水溶性熒光傳感器的制備方法及應(yīng)用，該熒光傳感器以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備的碳量子點(diǎn)（cn104357048b），異硫氰酸熒光素和丙烯酰氯為原料制備。進(jìn)一步應(yīng)用研究表明，該熒光傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對水中半胱氨酸的高靈敏度、高選擇性的比率檢測。

本發(fā)明的目的是通過下述方式實(shí)現(xiàn)的：

一種可比率檢測半胱氨酸的聚合物熒光傳感器的制備，包括以下步驟：

（1）將一定的異硫氰酸熒光素、三乙胺和丙烯酰氯溶解于二氯甲烷中，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完成之后除去溶劑，用硅膠柱純化，得到產(chǎn)物1；

（2）取一定量的產(chǎn)物1和根據(jù)專利（cn104357048b）制備的碳量子點(diǎn)溶解于二甲基亞砜，將混合溶液置于避光和n2保護(hù)的條件下室溫?cái)嚢?，反?yīng)結(jié)束后用乙醚沉淀，離心，真空干燥，得到產(chǎn)物2，即一種可比率檢測半胱氨酸的水溶性熒光傳感器。

根據(jù)上述制備方法制備的熒光傳感器，其具體的反應(yīng)過程如下：

步驟（2）中，碳量子點(diǎn)和產(chǎn)物1的質(zhì)量比為1:1~5，保持碳量子點(diǎn)在二甲基亞砜的濃度為5~20g/l。

作為進(jìn)一步優(yōu)選，碳量子點(diǎn)和產(chǎn)物1的質(zhì)量比為1:2~3；保持碳量子點(diǎn)在二甲基亞砜的濃度為10~15g/l。

根據(jù)上述的制備方法制備的水溶性熒光傳感器在比率檢測半胱氨酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明以檸檬酸，乙二胺，異硫氰酸熒光素和丙烯酰氯為原料來制備所需要的水溶性熒光傳感器，該聚合物熒光傳感器在的ph為7.4的緩沖溶液稀釋之后，在有半胱氨酸存在時，在516nm處會隨著半胱氨酸濃度的增加出現(xiàn)顯著的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，而在455nm處，隨著半胱氨酸濃度的增加熒光強(qiáng)度只有微小的變化，進(jìn)而表現(xiàn)出優(yōu)良的比率檢測效果。并且隨著半胱氨酸濃度的增加，可見光下溶液逐漸由淺綠色變?yōu)槊髁恋木G色，而在紫外光下，溶液由明亮的藍(lán)色熒光逐漸變?yōu)槊髁恋木G色熒光。而且該熒光傳感器對半胱氨酸的檢測具有明顯的高選擇性，并且能達(dá)到高靈敏度檢測的效果。相比于現(xiàn)有的一些檢測技術(shù)，本發(fā)明中的熒光化學(xué)傳感器克服了傳統(tǒng)小分子傳感器水溶性差、細(xì)胞毒性大的缺點(diǎn)，成本投入較少，合成路線簡單、后處理方便、可直接對半胱氨酸實(shí)現(xiàn)快速特異性識別，尤其是在生理環(huán)境ph為7左右的生物體內(nèi)環(huán)境的應(yīng)用有著極其重要的意義。

總而言之，本發(fā)明提供了一種可比率檢測半胱氨酸的水溶性熒光傳感器的制備及其應(yīng)用，該聚合物熒光傳感器制備簡單，靈敏度高，有望在生物材料科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

附圖說明

圖1為制備的熒光傳感器的核磁共振氫譜圖。

圖2為制備的熒光傳感器的粒徑圖。

圖3為制備的熒光傳感器對半胱氨酸的識別示意圖。

圖4為不同半胱氨酸(cys)濃度時，熒光傳感器的熒光發(fā)射光譜變化圖（激發(fā)波長：360nm），[cys]=0mol/l（a），1.0×10^-6mol/l（b）,3.0×10^-6mol/l（c）,5.0×10^-6mol/l（d），7×10^-6mol/l（e），1.0×10^-5mol/l（f）,1.5×10^-5mol/l（g）,2×10^-5mol/l（h），3.0×10^-5mol/l（i）,4.0×10^-5mol/l（j）。

圖5為熒光傳感器隨cys濃度變化的熒光強(qiáng)度變化值對應(yīng)的擬合曲線和該曲線所對應(yīng)的函數(shù)圖。

圖6為各種離子對該熒光傳感器熒光比率強(qiáng)度的選擇性對比數(shù)據(jù)圖，加入后的離子的濃度均為5.0×10^-4mol/l，cys濃度為5.0×10^-5mol/l，i455和i516為各離子加入前后的熒光傳感器在以360nm為激發(fā)波長，455nm和516nm為發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度變化值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：一種可比率檢測半胱氨酸的熒光傳感器的制備，具體步驟以下：

（1）取異硫氰酸熒光素（100mg）和三乙胺（100mg）溶解于40ml的二氯甲烷，然后將丙烯酰氯(231mg)溶解到5ml的二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分（85~95%）二氯甲烷，過柱提純產(chǎn)物，真空干燥，得到產(chǎn)物1；

（2）將步驟（1）合成的產(chǎn)物1（50mg）和根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備的碳量子點(diǎn)（50mg）溶解于二甲基亞砜（5ml）溶液中，室溫反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后先用乙醚沉淀，然后用甲醇沉淀，離心，真空干燥，得產(chǎn)物2。

實(shí)施例2：一種可比率檢測半胱氨酸的熒光傳感器的制備，具體步驟以下：

（1）取異硫氰酸熒光素（100mg）和三乙胺（100mg）溶解于40ml的二氯甲烷，然后將丙烯酰氯(231mg)溶解到5ml的二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分（85~95%）二氯甲烷，過柱提純產(chǎn)物，真空干燥，得到產(chǎn)物1；

（2）將步驟（1）合成的產(chǎn)物1（250mg）和根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備的碳量子點(diǎn)（50mg）溶解于二甲基亞砜（8ml）溶液中，室溫反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后先用乙醚沉淀，然后用甲醇沉淀，離心，真空干燥，得產(chǎn)物2。

實(shí)施例3：一種可比率檢測半胱氨酸的熒光傳感器的制備，具體步驟以下：

（1）取異硫氰酸熒光素（100mg）和三乙胺（100mg）溶解于40ml的二氯甲烷，然后將丙烯酰氯(231mg)溶解到5ml的二氯甲烷中，然后滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分（85~95%）二氯甲烷，過柱提純產(chǎn)物，真空干燥，得到產(chǎn)物1；

（2）將步驟（1）合成的產(chǎn)物1（150mg）和根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備的碳量子點(diǎn)（50mg）溶解于二甲基亞砜（10ml）溶液中，室溫反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后先用乙醚沉淀，然后用甲醇沉淀，離心，真空干燥，得產(chǎn)物2。然后將產(chǎn)物2溶解到水中，最終濃度為1mg/ml。即一種可比率檢測半胱氨酸的熒光傳感器。該熒光傳感器以納米粒子的形式存在，其粒徑數(shù)據(jù)如圖1所示。

實(shí)施例4：半胱氨酸的檢測實(shí)驗(yàn)。

取10個5ml樣品瓶，分別加入實(shí)施例3中所得的熒光傳感器溶液15μl（該熒光傳感器原溶液的濃度為1mg/ml），依次加入2.985ml的ph為7.4的緩沖溶液溶液，攪拌1min之后分別將濃度為[cys]=0mol/l（a），1.0×10^-4mol/l（b），3.0×10^-4mol/l（c），5.0×10^-4mol/l（d），7×10^-4mol/l（e），1.0×10^-3mol/l（f），1.5×10^-3mol/l（g），2×10^-3mol/l（h），3.0×10^-3mol/l（i）,4.0×10^-3mol/l（j）的3μl半胱氨酸溶液加入9個樣品瓶中，常溫下攪拌10min后，以360nm為激發(fā)波長，分別測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，得9個樣品的熒光發(fā)射光譜變化圖，見圖4。測定結(jié)果表明：該聚合物熒光傳感器在455nm處的熒光強(qiáng)度隨著半胱氨酸濃度的逐漸增加而保持不變，而在516nm處的熒光強(qiáng)度明顯上升。根據(jù)圖4中455nm和516nm處熒光強(qiáng)度比率變化值與濃度的變化關(guān)系可作出對應(yīng)的擬合后的比較理想的函數(shù)曲線圖和該曲線所對應(yīng)的函數(shù)圖（y=a+b×x，a=0.8498，b=0.01944，r²=0.9751），見圖5。

實(shí)施例5：其它離子影響的對比檢測實(shí)驗(yàn)。

取12個5ml樣品瓶，分別裝入實(shí)施例1中所得的熒光傳感器溶液15μl（該熒光傳感器濃度為0.02mg/ml），然后依次加入2.985ml的ph為7.4的緩沖溶液，攪拌1min之后分別將濃度為0.1mol/l的na⁺、k⁺、s^2-、bsa（牛血清白蛋白）、gln（谷氨酸）、ser（絲氨酸）、asn（天冬酰胺）、thr（蘇氨酸）、hcy（高半胱氨酸）、gsh（谷胱甘肽）溶液和濃度為8.0×10^-3mol/l的半胱氨酸溶液各取15μl加入另外前11個樣品瓶中，12號樣品為空白樣。然后分別測定12個樣品在360nm波長激發(fā)下的熒光光譜數(shù)據(jù)，得到在455nm和516nm波長發(fā)射處的熒光比率變化值，結(jié)果見圖6。測定結(jié)果表明：除了半胱氨酸外，其它上述各種離子和氨基酸對所制備的熒光傳感器的熒光比率強(qiáng)度沒有明顯影響。

上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明所作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。