本發(fā)明涉及cxcr1基因編碼區(qū)980突變點作為分子標記的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

牛白血病是由牛白血病病毒(bovineleukosisvirus，blv)引起的一種牛慢性腫瘤性疾病，有多種病理類型，主要病理特征為淋巴樣細胞惡性增生、進行性惡病質(zhì)以及發(fā)病后的高死亡率^[1]。國際獸醫(yī)局(oie)將之列為動物b類傳染病，在我國進口動物檢疫中屬于二類傳染病。根據(jù)其流行狀況和疾病的表現(xiàn)形式可分為地方流行性牛白血病(enzooticbovineleukosis,ebl)和散發(fā)性牛白血病(sporadicbovineleukosis,sbl)

牛白血病病毒屬c型致瘤病毒群、反轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae)、致瘤病毒亞科(oncoviridae)的rna病毒^[2]。blv呈c型病毒粒子的典型形態(tài)^[3],blv粒子基本呈球型，直徑80-120nm，芯髓直徑60-90nm，芯髓由核芯和芯殼組成。病毒外部有雙層囊膜，膜表面附有纖突，長約10-15nm，膜內(nèi)含有絲狀和點狀結(jié)構(gòu)。核衣殼呈20面體對稱，沒有感染性，呈螺旋狀卷曲，中心是由兩條35srna組成的倒置二聚體，能產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)，病毒粒子中的反轉(zhuǎn)錄酶分子量為70kd^[4]，與其他病毒的反轉(zhuǎn)錄酶需有錳離子才有最高活性不同，blv有鎂離子存在時活性才最高^[5]。

blv粒子大約由60-70％的蛋白質(zhì)，20-30％的類脂，2％的蔗糖，此外還含有1％的rna組成。由于迄今尚未發(fā)現(xiàn)分離株間有很大的差異^[6]，說明blv的遺傳性比較穩(wěn)定。blv的結(jié)構(gòu)組成為：5'ltr-gag-pol-env-pxbl-3'ltr，為長末端重復(fù)序列，包括群特異性抗原基因(gag)、聚合基因(pol)、囊膜基因(env)，除基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)外還含有tsx和rex兩個輔助調(diào)控基因^[7]。

blv與其它有囊膜病毒一樣，對外界環(huán)境的抵抗力不強，對去污劑等脂溶劑比較敏感，福爾馬林、乙醚、銨離子等能迅速破壞其傳染性。低ph、加熱、干燥和非等滲的條件可使病毒失活。反復(fù)凍融、紫外線照射等多種方式均可殺滅該病毒。各種消毒藥物能很快殺死病毒，殺死的最低濃度分別為苯酚2％、福爾馬林4％、高錳酸鉀0.02％、消毒靈0.01％、漂白粉05％、氫氧化鈉1％、新潔爾滅0.05％等。

牛白血病病自然條件下主要以牛為感染對象，以4～8歲的牛發(fā)病為多，2歲以下的牛發(fā)病率很低。感染牛潛伏期平均為4年，大多呈無癥狀終生帶毒。所有品種的牛均有易感性，且該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，奶牛發(fā)病率高于肉用牛。一般來說，ebl的發(fā)病高峰在6-8歲，一般測定公牛的感染率為10.4％，母牛為13.5％。感染牛中30％表現(xiàn)為持續(xù)性淋巴細胞增多癥(pl)，可能發(fā)展至致死性淋巴肉瘤的概率僅有0.6％-5％。飼養(yǎng)管理不當、環(huán)境條件太差、營養(yǎng)不良及強應(yīng)激都會使該病的發(fā)病率和死亡率明顯增高。除此之外，過多攝入某些微量元素也會增加牛對blv誘癌的敏感性^[8]。

牛白血病的診斷方法有很多，可以進行病理學(xué)檢查、血液學(xué)檢查、電子顯微鏡檢測、合胞體感染性測定、動物試驗、血清學(xué)試驗等。雖然該病的檢測方法已經(jīng)較為成熟，但是該病尚無特效療法只能加以控制。想要達到對本病的控制平時應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，嚴格控制環(huán)境衛(wèi)生等方面，再采取檢疫、淘汰、隔離等綜合性預(yù)防措施。

雖然牛白血病的控制技術(shù)國內(nèi)外取了一些進展，但生產(chǎn)上收效并不理想，也沒有對牛白血病易感性進行系統(tǒng)的選育。目前，奶牛群體牛白血病感染率仍維持較高水平，某些養(yǎng)牛國家牛白血病患病率高達60％。因此，急需一種能用于奶牛白血病輔助選擇的分子標記及其檢測方法，并結(jié)合傳統(tǒng)的奶牛育種、人工授精等技術(shù)，從而降低我國奶牛白血病的感染率，提高奶牛養(yǎng)殖的終生產(chǎn)值和牛場的經(jīng)濟效益。

有研究表明趨化因子受體(chemokine(c-x-cmotif)receptor)及其配體在多種類型腫瘤組織中呈高表達的狀態(tài)，影響腫瘤微環(huán)境，參與腫瘤細胞生存生長的調(diào)節(jié)、血管新生、侵襲及轉(zhuǎn)移^[9-11]。對趨化因子受體家族在腫瘤中的深入研究不但能增加我們對腫瘤發(fā)病機制的認識，還有助于發(fā)展腫瘤治療的新靶標。cxcr1作為趨化因子受體家族中的成員，研究顯示其表達與數(shù)種腫瘤(比如乳腺癌^[12]，黑色素瘤^[13]，胰腺癌等)的生長、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、血管新生以及耐藥性等有密切關(guān)系。而牛白血病與cxcr1基因是否有關(guān)聯(lián)，尚未有的報道。如何通過育種選育奶牛白血病易感性低的品種仍是有待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于降低奶牛白血病易感性輔助選擇的分子標記及應(yīng)用。

本發(fā)明對奶牛大樣本群體cxcr1基因編碼區(qū)進行了測序，結(jié)合其牛白血病易感性等信息，篩選到一個與牛白血病易感性有顯著相關(guān)的snp突變。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在cds區(qū)980bp處發(fā)現(xiàn)一個堿基g→a的突變(g980a)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈中賴氨酸(lysine)突變?yōu)榫彼?arginine)，并有3種基因型序(圖1)，分別命名為aa、ga和gg基因型。以866頭中國荷斯坦母牛為基礎(chǔ)進行統(tǒng)計分析，aa、ga和gg型，基因型頻率分別為0.60、0.353和0.047，優(yōu)勢基因為a，頻率為0.78。該突變與牛白血病易感性顯著相關(guān)。

基于此，本發(fā)明公開了cxcr1基因980位點作為降低牛白血病易感性輔助選擇分子標記的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了cxcr1基因980位點在奶牛育種中的應(yīng)用。即在選育牛白血病低易感性的奶牛品系中的應(yīng)用。

具體是：在奶牛育種中利用cxcr1基因g980a檢測，篩選其中aa型個體公牛，并與其它母牛進行配種，增加其后代母牛cxcr1基因g980aaa和ga型個體比例。

利用本發(fā)明可以達到降低牛場牛白血病的發(fā)病率目的，同時可減少因淘汰奶牛而購買其他奶牛所產(chǎn)生的費用。

附圖說明

圖1是cxcr1-980g>a突變測序圖。

圖2是cxcr1-980aa基因型熒光定量檢測圖。

圖3是cxcr1-980gg基因型熒光定量檢測圖。

圖4是cxcr1-980ag基因型熒光定量檢測圖。

具體實施方式

實施例

(1)樣品采集：從奶牛靜脈采抗凝血10ml，分離血清，并用常規(guī)方法提取其dna；

(2)牛白血病檢測

對分離出的血清樣，用愛德士公司(idexx)市售牛白血病血清抗體x2檢測試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品說明書用酶聯(lián)免疫法進行測定。

(3)cxcr1-980突變位點檢測

根據(jù)genbank上公布的牛cxcr1基因mrna序列(ef597244)與?；蚪M比對，找到5'側(cè)翼區(qū)和編碼區(qū)，用primer5.0軟件設(shè)計引物(表1)。

表1cxcr1基因pcr擴增的引物序列、目的片段長度及退火溫度

pcr擴增體系如下：總體積20μl，其中包括10×緩沖液2.0μl，25mmol/l鎂離子1.5μl、taqdna聚合酶(5u/μl)0.3μl、dntp(10mmol/l)0.5μl，上下游引物各(10pmol/μl)1.0μl,模板dna(100ng/μl)1.0μl、ddh2o12.7μl。

pcr擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃復(fù)性40s，72℃延伸10min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

對pcr產(chǎn)物，直接用abi9700型測序儀進行測序。對測序所得結(jié)果，用dnaman和chromas軟件，與參考序列(登錄號：ef597244)進行比對，并判定其基因型(圖1)。

同時也可采用taqman探針法進行快速大批量檢測，且價格便宜。采用taqman探針法對以上snp進行檢測，方法如下：

使用軟件primer5.0設(shè)計引物和探針，引物及探針序列如下：

上游引物：gccagaagtttcgccacg(seqidno.3)

下游引物：ctgaagaagagccaacaaagga(seqidno.4)

hp型探針：ctcctcaagatcatggc(seqidno.5)，用藍色熒光fam標記

fp型探針：tcctcaggatcatggc(seqidno.6)，用綠色熒光hex標記

pcr體系如下：總體積20μl，其中包括2хhotstartfluo-pcrmix10μl，上下游引物各0.5μl，探針0.8μl，待測樣品dna2.0μl，ddh2o6.2μl。

完成上述步驟后，把加好樣品的384孔板放在lightcycler480softwaresetup(roche羅氏)熒光定量pcr儀進行反應(yīng)。反應(yīng)程序如下：初始步驟為95℃保存4min，然后進入熱循環(huán)：95℃變性15秒，60℃退火/延伸60秒，共40個循環(huán)。

試驗結(jié)束后對熒光定量檢測結(jié)果進行分析，如圖2-4所示，橫坐標表示fam信號強度值，縱坐標表示vic信號強度值。圖中每一個點代表一個個體，不同顏色和信號強度值的熒光代表其不同的基因型，因此點分布的密集程度表明不同基因型之間比例。圖2和圖3所示分別為fp型探針標記的aa基因型個體和hp型探針標記的gg基因型個體的分布圖，二者熒光顯色分別為藍色和綠色。圖4為雜合a/g基因型個體的分布圖，熒光顯色為紅色熒光。

(4)通過logistic回歸分析得出表2所示結(jié)果：

表2奶牛cxcr1位點不同基因型牛白血病感染情況對照表

具體實施方式

在全國各種公牛站進行常規(guī)奶牛育種工作中，增加本研究發(fā)現(xiàn)的分子標記篩選其中aa型個體公牛，并與母牛進行配種，可增加其后代母牛cxcr1基因g980aaa和ga型個體比例，逐漸淘汰gg型母牛個體。本發(fā)明首次披露了cxcr1基因g980a的snp突變位點的基因型在對奶牛白血病進行輔助選擇方面的應(yīng)用。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明設(shè)計分子標記引物時使用的cxcr1基因與奶牛生產(chǎn)性能、免疫等性狀密切相關(guān)，其snp突變標記點與奶牛白血病的感染顯著相關(guān)，具有更高的準確性和可信度，因而可以有效地針對奶牛白血病的易感性對種牛進行輔助選擇，以降低后代奶牛的發(fā)病率，并間接提高產(chǎn)值。

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sequencelisting

<110>揚州大學(xué)

<120>一種用于降低牛白血病易感性輔助選擇的分子標記及應(yīng)用

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