本發(fā)明涉及基因技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用erecta基因調(diào)控種子大小的方法。

技術(shù)背景

植物的種子主要由胚胎、胚乳和種皮三部分結(jié)構(gòu)構(gòu)成，因此種子大小受胚胎、胚乳和珠被共同調(diào)節(jié)。種子大小的調(diào)控是一個(gè)重要的發(fā)育生物學(xué)問題，在進(jìn)化上，種子大小是一項(xiàng)重要的選擇性狀，同時(shí)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子大小又是一項(xiàng)重要的農(nóng)藝性狀，可以為農(nóng)作物的分子育種和改良品種提供理論依據(jù)。近年來國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了一些參與種子大小的調(diào)控基因，但是對(duì)于種子大小的決定機(jī)制還不是很清楚，因此，對(duì)植物種子大小的調(diào)控進(jìn)行研究具有重要的理論和應(yīng)用意義。

erecta基因是一個(gè)類受體激酶基因，廣泛存在于各種植物中，可改良不同作物如水稻、玉米、大豆等農(nóng)作物的抗熱性，還參與調(diào)控植物的生物學(xué)過程，如氣孔、花序發(fā)育等。然而，現(xiàn)有的對(duì)erecta基因的研究中尚未發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控種子大小。因此，對(duì)于利用erecta基因調(diào)控種子大小的方法進(jìn)行研究具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用erecta基因調(diào)控種子大小的方法，通過對(duì)erecta基因進(jìn)行過表達(dá)可有效調(diào)節(jié)植物種子大小。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案是：

一種利用erecta基因調(diào)控種子大小的方法，其特征在于：通過對(duì)erecta基因進(jìn)行過量表達(dá)以調(diào)控植物種子大小。

進(jìn)一步地，上述方法包括以下步驟：

(1)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建：以提取的植物dna為模板，根據(jù)erecta基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得gerecta片段；再通過gateway方法將gerecta片段克隆到目的載體上，獲得重組載體；

(2)轉(zhuǎn)化：將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，得到含有重組質(zhì)粒的gv3101；利用含有重組質(zhì)粒的gv3101對(duì)植物進(jìn)行花序浸染轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化得到的植株培養(yǎng)至種子成熟，收取t1代轉(zhuǎn)基因種子；

(3)陽性苗的篩選：對(duì)收取的t1代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行抗性培養(yǎng)，篩選有目的蛋白表達(dá)的陽性苗，培養(yǎng)收取t2代轉(zhuǎn)基因種子，在t2代中挑選陽性苗與非陽性苗分離比3:1的植株繼續(xù)篩選，直到t3代純合。

進(jìn)一步地，步驟(1)中所述引物如下：

正向引物seqidno.2：5’-caccattcaaaaatccctctccaacatcataa-3’；

反向引物seqidno.3：5’-ctcactgttctgagaaataacttgtcca-3’。

進(jìn)一步地，步驟(1)中所述gerecta片段大小為7563bp，包括erecta基因atg上游2037bp的啟動(dòng)子和5526bperecta基因。

進(jìn)一步地，步驟(1)中所述gateway方法具體為：將獲得的gerecta片段連入pcr8/gw/topota載體中，得到pcr8-gerecta入門載體；并且利用lr重組酶對(duì)pcr8-gerecta和雙元載體pgwb4進(jìn)行重組反應(yīng)，得到pgwb4-gerecta重組載體。

進(jìn)一步地，所述雙元載體pgwb4的c端含有g(shù)fp標(biāo)簽；所述pgwb4-gerecta重組載體轉(zhuǎn)化表達(dá)得到gerecta-gfp融合蛋白。

進(jìn)一步地，步驟(3)中所述抗性為50μg/ml潮霉素。

進(jìn)一步地，步驟(3)中通過westernblot利用anti-gfp檢測(cè)gerecta-gfp融合蛋白的表達(dá)。

有益效果：本發(fā)明公開了一種利用erecta基因調(diào)控種子大小的方法，通過對(duì)erecta基因進(jìn)行過量表達(dá)以調(diào)控植物種子大小。本發(fā)明對(duì)erecta基因atg上游2037bp的啟動(dòng)子以及5526bperecta基因進(jìn)行克隆，通過gateway方法進(jìn)行重組載體的構(gòu)建，高效、快速地將gerecta克隆到雙元載體pgwb4上；通過westernblot利用anti-gfp檢測(cè)gerecta-gfp融合蛋白的表達(dá)，保證表達(dá)產(chǎn)物的快速、準(zhǔn)確檢出，陽性苗篩選到t3代純合，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免假陽性的干擾。

綜上所述，本發(fā)明調(diào)控效果顯著，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，調(diào)控方法操作簡(jiǎn)單、方便，可公式化，易于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例col-0、er-105、er-ox的種子表型對(duì)比；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例col-0、er-105、er-ox種子面積和種子質(zhì)量對(duì)比統(tǒng)計(jì)；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述：

實(shí)施例

本發(fā)明以擬南芥為例，進(jìn)行erecta基因在擬南芥中的過量表達(dá)。

1.轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

首先，根據(jù)擬南芥erecta基因(基因號(hào)at2g26330，見序列表seqidno.1)設(shè)計(jì)如下引物：

正向引物seqidno.2：5’-caccattcaaaaatccctctccaacatcataa-3’；

反向引物seqidno.3：5’-ctcactgttctgagaaataacttgtcca-3’。

提取擬南芥col-0葉片中的dna作為模板，利用上述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；擴(kuò)增采用高保真性酶phusiondnapolymerase(thermolot00242505)，反應(yīng)體系(50μl)如下：

循環(huán)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性1min；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸5min30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

擴(kuò)增得到的gerecta片段大小為7563bp，包括erecta基因atg上游2037bp的啟動(dòng)子和5526bperecta基因，不包括終止密碼子。

進(jìn)一步地，利用gateway方法將gerecta片段連入pcr8/gw/topota載體中，得到pcr8-gerecta入門載體。具體步驟如下：

1)對(duì)得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行末端加“a”反應(yīng)，即在pcr產(chǎn)物中按照每50μl體系加入0.4μleasytaqdnapolymerase，于pcr儀中72℃反應(yīng)30min。

2)將加“a”后pcr產(chǎn)物連入pcr8/gw/topota載體中，所使用的pcr8/gw/topota載體為pcr^tm8/gw/topotacloningkit。

反應(yīng)體系(1.5μl)如下：

加“a”后pcr產(chǎn)物1μl；

saltsolution0.25μl；

pcr8/gw/topota載體0.25μl；

于22℃下，過夜連接。

3)第二天，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化trans5α大腸桿菌感受態(tài)；轉(zhuǎn)化的具體步驟如下：

取trans5α大腸桿菌感受態(tài)在冰上化凍；將感受態(tài)加入到過夜連接的反應(yīng)產(chǎn)物中，輕輕的攪拌均勻，放在冰上，冰浴30min；置于金屬浴上，42℃，熱激90s，冰浴2min；于超凈環(huán)境下，向熱激后的感受態(tài)中加入400μl無抗lb溶液，將ep管置于37℃搖床，150rpm/min慢搖1h；將培養(yǎng)得到的感受態(tài)lb混合液體涂在含有相應(yīng)抗性(spec抗性)的lb固體培養(yǎng)基平板上，密封后置于37℃培養(yǎng)箱，過夜倒置培養(yǎng)。

得到pcr8-gerecta入門載體后，利用lr重組酶對(duì)pcr8-gerecta和c端含有g(shù)fp標(biāo)簽的雙元載體pgwb4進(jìn)行重組反應(yīng)，得到pgwb4-gerecta重組載體，pcr8-gerecta入門載體和pgwb4-gerecta重組載體均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

lr重組使用invitrogen公司的gatewaylrclonaseiienzymemix，反應(yīng)體系如下：

22℃下，過夜連接；第二天，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化trans5α大腸桿菌感受態(tài)。

2.轉(zhuǎn)化

將pgwb4-gerecta重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，具體操作過程如下：

用無水乙醇沖洗電擊杯，在超凈工作臺(tái)吹干后放在冰上冰浴30min；將農(nóng)桿菌置于冰上化凍，吸取50μl農(nóng)桿菌加入0.5μlpgwb4-gerecta重組質(zhì)粒，冰浴30min；如質(zhì)粒濃度小于100ng/μl，則添加質(zhì)粒1μl。進(jìn)一步地，將農(nóng)桿菌與質(zhì)粒的混合液加入電擊杯，并將電擊杯放入電擊儀，調(diào)至bacteria-agro模式，電壓2.2kv，電流6.1ms；電擊后，將電擊杯放回冰上，吸出電擊杯中的液體置于ep管中，加入400μllb液體培養(yǎng)基，于30℃搖床150rpm/min慢搖1h。將培養(yǎng)得到的感受態(tài)lb混合溶液涂在含有相應(yīng)抗性(kana&rif)的lb固體培養(yǎng)基平板上，密封后置于30℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)3-4天，得到含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行收集，洗滌。

進(jìn)一步地，配置轉(zhuǎn)化介質(zhì)，稱取ms2.165g，濃度為5％的蔗糖50g，mes0.5g，濃度為1mg/ml的6-ba10μl，用koh調(diào)ph至5.7—5.8，然后定容到1l，加入silwet100μl。使用配置好的轉(zhuǎn)化介質(zhì)將農(nóng)桿菌重懸，倒入大小合適的燒杯中，將處于開花期的6周左右的擬南芥col-0花序浸入轉(zhuǎn)化介質(zhì)中5min；然后將農(nóng)桿菌浸染過的擬南芥橫躺放置在22℃培養(yǎng)室中，并用黑袋子遮光進(jìn)行暗處理；暗處理1-2d后將其正常豎直放置于22℃光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待種子成熟后，收取t1代轉(zhuǎn)基因種子，進(jìn)行后續(xù)的篩選。

3.陽性苗的篩選

將收取的t1代轉(zhuǎn)基因的種子干燥后熟1周左右，對(duì)其進(jìn)行消毒，并撒于添加有50μg/ml潮霉素的1/2ms培養(yǎng)基中，4℃純化2-3d，潮霉素可以抑制非陽性苗的根的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)陽性苗進(jìn)行初步篩選。將生根的陽性苗轉(zhuǎn)移至22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d左右，挑選長(zhǎng)根的小苗移到營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)4周左右提取葉片中的蛋白，通過westernblot利用綠色熒光蛋白抗體anti-gfp檢測(cè)gerecta-gfp融合蛋白的表達(dá)。

選取有g(shù)erecta-gfp融合蛋白表達(dá)的陽性苗繼續(xù)篩選，在t2代中挑選陽性苗和非陽性苗的分離比符合3：1的植物繼續(xù)篩選，直到t3代純合，選取表達(dá)量合適的并且gerecta基因是單拷貝插入的植物進(jìn)行后續(xù)的表型觀察和統(tǒng)計(jì)。

將篩選得到的t3代gerecta-gfp轉(zhuǎn)基因陽性純合植株er-ox分別與擬南芥生態(tài)型col-0以及擬南芥生態(tài)型col-0中的erecta缺失突變體er-105同時(shí)種下，在22℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，光周期16l/8d，期間不受干旱、蟲害等任何脅迫，直到種子成熟。收取成熟的種子后熟干燥一周左右，進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

如圖1、2所示，er-105的種子明顯小于野生型col-0，其中er-105種子面積相比于col-0減小10％，種子重量減小12％，由此可見，erecta基因缺失之后會(huì)導(dǎo)致植物種子變小。相反，當(dāng)過量表達(dá)erecta時(shí)，種子明顯變大，er-ox與col-0相比種子面積增加了16％，種子重量增加了48％。綜上所述，erecta基因的缺失和過表達(dá)直接影響種子大小，通過erecta基因的過量表達(dá)可增加種子的面積和重量，進(jìn)而為改良農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

進(jìn)一步地，erecta基因的過量表達(dá)可以應(yīng)用于水稻、玉米、大豆等農(nóng)作物種子大小的調(diào)控。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限制于本文所示的實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干修改和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>河北師范大學(xué)

<120>一種利用erecta基因調(diào)控種子大小的方法

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>7563

<212>dna

<213>arabidopsisthaliala

<400>1

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