本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及pabpc1基因在定量檢測稻螟赤眼蜂基因表達量中作為內(nèi)參基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

稻螟赤眼蜂trichogrammajaponicunashmead屬于膜翅目赤眼蜂科，是一種重要的害蟲天敵。其成蟲將卵產(chǎn)在寄主卵內(nèi)，在寄主卵內(nèi)取食、發(fā)育致使寄主卵死亡，從而達到將害蟲消滅在危害之前的目的。雖然在生態(tài)上對稻螟赤眼蜂的研究較多，但對分子機理上的研究非常少。如已經(jīng)有研究顯示不同地理種群對稻螟赤眼蜂耐高溫或耐低溫的能力有所不同，但是稻螟赤眼蜂如何應(yīng)對高溫低溫的機理還有待進一步開展研究。若能明確稻螟赤眼蜂耐高低溫的機制，將對種群的篩選、放蜂效果的提高都能帶來突破。

研究稻螟赤眼蜂不同溫度脅迫后體內(nèi)相關(guān)基因的功能，其中最基本的技術(shù)方法就是對功能基因進行簡單、快速、準(zhǔn)確的表達定量分析。與傳統(tǒng)的印跡雜交，半定量rt-pcr等定量分析方法比較，實時熒光定量pcr具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、線性關(guān)系好、成本低等優(yōu)點，是近年來最受科研工作者青睞的基因表達定量的方法。然而，實時熒光定量pcr檢測的準(zhǔn)確性很大程度上取決于內(nèi)參基因的選擇，其作用是校正樣品量以及實驗過程中存在的誤差，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正樣品量之間的誤差，這樣獲得的實驗結(jié)果才更為可信。昆蟲中常用的內(nèi)參基因有rps3、actin、gapdh、tublin、rpl10、18srrna、28srrna等，但實際上沒有任何一個內(nèi)參基因mrna表達水平在所有外在或內(nèi)在的條件下都是恒定的，理想的內(nèi)參基因是不存在的，不同物種之間差異更是巨大。所以，一般要選擇一個在處理因素作用的條件下表達相對穩(wěn)定的基因作內(nèi)參基因或內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，這是實時熒光定量pcr成功與否的關(guān)鍵所在。

因此，要對稻螟赤眼蜂進行相關(guān)的耐高溫耐低溫機制研究，明確與耐高溫耐低溫相關(guān)的基因，就必須先篩選出合適的內(nèi)參基因。昆蟲體內(nèi)的熱激蛋白基因是與溫度脅迫相關(guān)的重要基因，包括熱激蛋白基因hsp20，hsp40，hsp70及hsp90，但這些基因在稻螟赤眼蜂體內(nèi)對溫度脅迫的反應(yīng)尚未見報道，也無研究關(guān)于溫度脅迫下稻螟赤眼蜂體內(nèi)穩(wěn)定的內(nèi)參基因的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了pabpc1基因作為內(nèi)參基因在定量檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量的應(yīng)用，為稻螟赤眼蜂在不同溫度脅迫下進行實時熒光定量pcr反應(yīng)時選擇合適內(nèi)參基因提供依據(jù)。

一方面，pabpc1基因作為內(nèi)參基因在定量檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量的應(yīng)用。

優(yōu)選的，pabpc1基因作為內(nèi)參基因在定量檢測溫度脅迫下稻螟赤眼蜂體內(nèi)與適應(yīng)溫度調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量的用途。

其中，所述定量檢測的方法優(yōu)選為實時熒光定量pcr。

本發(fā)明中，所述pabpc1基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

優(yōu)選的，在對稻螟赤眼蜂體內(nèi)與適應(yīng)溫度調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達量進行定量檢測時，擴增所述pabpc1基因的引物序列如seqidno:12和seqidno:13所示。

本發(fā)明中，所述與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)的基因優(yōu)選為熱激蛋白基因。進一步優(yōu)選的，所述熱激蛋白基因為hsp70，所述hsp70的基因序列如seqidno:11所示。

優(yōu)選的，在對稻螟赤眼蜂體內(nèi)hsp70基因進行定量檢測時，擴增所述hsp70基因的引物序列如seqidno:32和seqidno:33所示。

另一方面，本發(fā)明提供一種定量檢測熱激蛋白hsp70基因在稻螟赤眼蜂被溫度脅迫后的表達量的方法，該方法包括：以pabpc1基因為內(nèi)參基因，檢測hsp70基因在稻螟赤眼蜂被溫度脅迫后的定量表達量，其中所述定量檢測表達量的方法為實時熒光定量pcr。

其中，所述溫度脅迫包括高溫脅迫和低溫脅迫，所述高溫脅迫的溫度優(yōu)選為30℃～40℃，所述低溫脅迫的溫度優(yōu)選為4℃～10℃。所述溫度脅迫的時間優(yōu)選為0.5～4小時。

優(yōu)選的，所述pabpc1基因的基因序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明在對稻螟赤眼蜂體內(nèi)hsp70基因表達量進行定量檢測時，擴增所述pabpc1基因的引物序列優(yōu)選為seqidno:12和seqidno:13所示序列。擴增所述hsp70基因的引物序列優(yōu)選為：seqidno:32和seqidno:33所示序列。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明為稻螟赤眼蜂體內(nèi)基因表達譜分析提供了穩(wěn)定的內(nèi)參基因參考，為其他物種在特定實驗條件下實時熒光定量pcr內(nèi)參基因的篩選提供了借鑒。應(yīng)用本發(fā)明可建立在不同溫度脅迫下，利用實時熒光定量pcr檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)各基因的方法，減少檢測誤差，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

附圖說明

圖1：reffinder軟件分析不同溫度脅迫下稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性，平均穩(wěn)定值越小越穩(wěn)定。

圖2：以pabpc1為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量pcr方法分析不同溫度脅迫后稻螟赤眼蜂體內(nèi)hsp70基因的相對定量表達水平。

具體實施方式

本發(fā)明采用下述方法篩選定量檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達量的內(nèi)參基因。采用該方法可以篩選出合適的內(nèi)參基因，并且可以作為溫度脅迫下稻螟赤眼蜂體內(nèi)相關(guān)功能基因表達量的研究。

該方法包括：提供備選的內(nèi)參基因；以未處理的稻螟赤眼蜂為對照，采用低溫和高溫對稻螟赤眼蜂成蟲進行脅迫處理，處理后收集稻螟赤眼蜂樣品，立即提取總rna，測定rna濃度，將rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna，然后以各樣品cdna為模板，利用實時熒光定量pcr對備選內(nèi)參基因進行驗證，采用reffinder軟件進行數(shù)據(jù)分析，從而篩選出稻螟赤眼蜂在溫度脅迫條件下最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。

本發(fā)明中，稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度相關(guān)的功能基因優(yōu)選為熱激蛋白基因，如熱激蛋白基因hsp20，hsp40，hsp70及hsp90等。在本發(fā)明具體實施例中優(yōu)選功能目的基因為hsp70基因，其核苷酸序列如seqidno:11所示。

本發(fā)明對內(nèi)參基因的篩選過程中，備選的內(nèi)參基因為以下10種：

多聚腺苷酸結(jié)合蛋白(polyadenylatebindingprotein1，pabpc1)，其核苷酸序列如seqidno:1所示；

剪切因子(splicingfactor，sf)，其核苷酸序列如seqidno:2所示；

延伸因子1(elonggationfactor1,ef1)，其核苷酸序列如seqidno:3所示；

酪蛋白激酶(caseinkinase1alpha，ck1a)，其核苷酸序列如seqidno:4所示；

延伸因子1delta(elonggationfactor1deta，ef1d)，其核苷酸序列如seqidno:5所示；

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdh)，其核苷酸序列如seqidno:6所示；

肌動蛋白11(actinrelatedprotein2,arp2)，其核苷酸序列如seqidno:7所示；

跨膜蛋白(transmembraneprotein209，tmem209)，其核苷酸序列如seqidno:8所示；

肌動蛋白213(actinrelatedprotein213,arp213)，其核苷酸序列如seqidno:9所示；

atp合成酶(atpsynthase)，其核苷酸序列如seqidno:10所示。

本發(fā)明選用的稻螟赤眼蜂優(yōu)選為同一生理狀態(tài)下的稻螟赤眼蜂。在本發(fā)明的具體實施例中，采用在同一條件下室內(nèi)飼養(yǎng)的稻螟赤眼蜂，飼養(yǎng)條件如下：稻螟赤眼蜂的室內(nèi)種群在人工氣候室：溫度25℃，濕度75％，光照：黑暗＝14小時：10小時的條件下，用米蛾卵進行擴繁，利用初羽化的成蜂進行溫度脅迫處理。

本發(fā)明中，不同溫度對稻螟赤眼蜂進行脅迫處理的方法為：分別選取低溫脅迫、高溫脅迫以及常溫條件下處理的稻螟赤眼蜂為實驗材料，所述低溫脅迫的溫度優(yōu)選為4℃～10℃，更優(yōu)選為5～7℃；所述高溫脅迫的溫度優(yōu)選為30℃～40℃，更優(yōu)選為35～38℃。本發(fā)明中，對稻螟赤眼蜂進行低溫或高溫脅迫的時間至少為0.5小時，作為優(yōu)選的，低溫或高溫脅迫的時間為0.5～4小時，進一步優(yōu)選為1～2小時。本發(fā)明中，常溫處理的稻螟赤眼蜂溫度為24～26℃，優(yōu)選為25℃。本發(fā)明對溫度脅迫的裝置沒有特殊的限定，在本發(fā)明具體實施例中采用光照培養(yǎng)箱和冰箱分別對稻螟赤眼蜂進行高溫和低溫脅迫處理。本發(fā)明對溫度脅迫操作方式?jīng)]有特殊的限定，可以將稻螟赤眼蜂置于容器中進行溫度脅迫。優(yōu)選采用將稻螟赤眼蜂置于玻璃管中，用棉塞封口，置于脅迫溫度下進行處理。為了保證篩選試驗的準(zhǔn)確性，本發(fā)明優(yōu)選每個處理設(shè)置至少3個生物學(xué)重復(fù)。

收集溫度脅迫的稻螟赤眼蜂，并提取其總rna，測rna濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cdna。本發(fā)明對此步驟沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域中的常規(guī)步驟進行操作即可。

以各樣品的cdna為模板，利用實時熒光定量pcr對備選內(nèi)參基因進行驗證。

進行實時熒光定量pcr方法對備選的10個內(nèi)參基因所對應(yīng)的引物為：

polyadenylatebindingprotein1(pabpc1)：

正:gcgacaacatcaccaggaga，反：gaagagatggatcgcgctga；

splicingfactor(sf)：

正：ttatgttcgggagcgtggag，反：tcaggtctgcttctcgatcac；

elonggationfactor1(ef1)：

正：gccatggttcaagggatgga，反：accgttccaataccgccaat；

caseinkinase1alpha(ck1a)：

正：ggcagacctttggaactcgt，反：acatgacctccaccgttcac；

elonggationfactor1deta(ef1d)：

正：aacttacgacagggctgagc，反：caagagctgcaatgccatcc；

glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(gapdh)：

正：caccaccatcgagaaggctt，反：tgggtcgtacgagtcgagat；

actinrelatedprotein2(arp2)：

正：tccgctgactttgaaaccgt，反：gagcagcaaacctttcaccg；

transmembraneprotein209(tmem209)：

正：actcacagccaggatcagtg，反：tggggcttcaagttgtgtgt；

actinrelatedprotein213(arp213)：

正：gaccatccgctcttagtgca，反：cagtggaaggttcagcgtct；

atpsynthase：

正：acagacagcggtgccattaa；反：gaattcacccatggcgcatc。

本發(fā)明中，hsp70基因的引物序列為：正：aacgtagtgagcgatggtgg，反：cattgaagtaagccggcacg。

優(yōu)選的，實時熒光定量pcr的體系和條件分別為：實時熒光定量pcr的反應(yīng)體系：定量pcr反應(yīng)體系共20μl，包含1μl的cdna(含有總rna3μg)，10μlsybr熒光試劑(itaquniversalsybrgreensupermix)，正/反向引物各1μl，雙蒸水7μl；實時熒光定量pcr的反應(yīng)條件：95℃30s，95℃10s，55℃30s共40個循環(huán)。融解曲線：55℃到95℃，每0.5℃收集一次熒光信號。在本發(fā)明中，優(yōu)選每個樣本設(shè)置2個技術(shù)重復(fù)。

將實時熒光定量pcr獲得的ct值，利用reffinder軟件進行分析，篩選得到表達量最穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為定量檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達量的合適內(nèi)參基因。

reffinder(http://http://fulxie.0fees.us/？type＝reference&i＝1)是一個免費的網(wǎng)絡(luò)綜合評價內(nèi)參基因穩(wěn)定性的工具，可從大量的實驗數(shù)據(jù)集評估和篩選內(nèi)參基因。它能綜合bestkeeper，genorm，normfinder和△ct四種方法的結(jié)果來對候選內(nèi)參基因作出最終的穩(wěn)定性排序。其中，△ct法較為簡單，通過比較每一對持家基因在每個樣品的相對表達來確定適合的內(nèi)參基因。bestkeeper通過原始ct值和引物擴增效率(e)決定出最適內(nèi)參基因，并依次排序。genorm程序可用于篩選任何條件下任意數(shù)量內(nèi)參基因，選擇出兩個以上內(nèi)參基因，而不是傳統(tǒng)地使用單一內(nèi)參基因。normfinder程序運行原理與genorm程序類似，可直接運算出各基因的表達穩(wěn)定值(m)，然后根據(jù)m值的大小排序，m值越小，穩(wěn)定性越高。其缺點是只能選擇1個合適的內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)。reffinder是整合bestkeeper，genorm，normfinder和△ct四種方法，對每個候選內(nèi)參基因單獨用4種分析方法評價時的排名求幾何平均值，得到綜合排名指數(shù)，該指數(shù)越小，說明內(nèi)參基因表達越穩(wěn)定；反之，則越不穩(wěn)定。

結(jié)果得到pabpc1基因在稻螟赤眼蜂不同溫度脅迫下表達量最穩(wěn)定，因此將pabpc1基因作為在定量檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達量的內(nèi)參基因。

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。其中內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析reffinder軟件的使用按其使用說明進行。

實施例1內(nèi)參基因的篩選

一、稻螟赤眼蜂的飼養(yǎng)。

稻螟赤眼蜂實驗室種群，在人工氣候室：溫度25℃，濕度75％，光照：黑暗＝14小時：10小時的條件下，利用米蛾卵擴繁，初羽化的成蜂進行溫度脅迫處理。

二、溫度脅迫處理

設(shè)置光照培養(yǎng)箱的溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃，設(shè)置冰箱的溫度為4℃和10℃。將稻螟赤眼蜂成蜂放置在玻璃管中，用棉塞封口，分別在上述溫度下處理1小時。收集樣品提取總rna；每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

三、實時熒光定量pcr分析所有基因的引物設(shè)計及擴增效率。

1.引物設(shè)計

選擇10種備選內(nèi)參基因和1種與適應(yīng)溫度調(diào)節(jié)相關(guān)的基因作為目的基因，利用primer3.0軟件設(shè)計特異性擴增引物(表1)。

2.rna提取過程

取200頭稻螟赤眼蜂放入2.0ml玻璃勻漿器中，加入500μltrizol試劑，手動勻漿5min，此后步驟參照trizol試劑(invitrogen，批號：15596026)說明書完成。rna質(zhì)量和濃度檢測：取1μlrna樣品，利用nanodrop2000檢測od260/280和濃度，od260/280值介于1.8～2.2為合格樣品。第一鏈cdna的合成：利用3μgrna進行反轉(zhuǎn)錄，步驟參照thermofisher反轉(zhuǎn)錄試劑盒(themofisher，批號：k1622)說明書進行。

表1備選內(nèi)參基因及目的基因的引物序列及擴增效率。

3.反轉(zhuǎn)錄合成的cdna的擴增

以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cdna為模板，利用設(shè)計合成的特異性引物(表1)pcr擴增備選內(nèi)參基因和目的基因，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段長度是否與選取的目的片段一致，然后回收pcr產(chǎn)物并測序進行驗證。發(fā)現(xiàn)利用以上設(shè)計的引物可以有效擴增出目的片段，與我們設(shè)計的目的片段大小一致，條帶單一，無特異性擴增。pcr擴增體系：20μl反應(yīng)體系包含10μl2×pcrbuffermix，正/反向引物各1μl，cdna模板1μl，滅菌水7μl。

4.引物擴增效率的考察

以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cdna按5倍等比稀釋成5個不同濃度的cdna為模板，利用設(shè)計合成的特異性引物(表1)進行熒光定量pcr擴增備選內(nèi)參基因和目的基因。實時熒光定量pcr的反應(yīng)體系共20μl，包含1μl的cdna(含有總rna3μg)，10μl2×itaqsybrgreen熒光試劑(2×itaquniversalsybrgreensupermix)，正/反向引物各1μl，雙蒸水7μl，其中sybrgreen熒光試劑購于bio-rad公司；反應(yīng)條件：95℃30s，95℃10s，55℃30s共40個循環(huán)。融解曲線：55℃到95℃，每0.5℃收集一次熒光信號。引物擴增效率由實時熒光定量pcr儀自帶軟件給出，以擴增效率e(％)是否在90％～110％之間判斷引物是否合適(表1)。熒光定量pcr儀為cfx96，bio-rad公司。

5.實時熒光定量pcr

以上述cdna為模板，對備選內(nèi)參基因和目的基因進行熒光定量pcr擴增(表1)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照【4.引物擴增效率的考察】一節(jié)。實時熒光定量pcr的反應(yīng)體系共20μl，包含1μl的cdna(含有總rna3μg)，10μl2×itaq熒光試劑，正/反向引物各1μl，雙蒸水7μl，其中sybrgreen熒光試劑購于bio-rad公司；反應(yīng)條件：95℃30s，95℃10s，55℃30s共40個循環(huán)。融解曲線：55℃到95℃，每0.5℃收集一次熒光信號。

將實時熒光定量pcr獲得的ct值，按照分析軟件格式要求輸入reffinder軟件進行分析。內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，10種不同備選基因的穩(wěn)定性為：pabpc1>ef1>ef1d>tmem209>sf>arp2>arp213>ck1a>atpsynthase>gapdh，其中pabpc1最穩(wěn)定。

傳統(tǒng)來講，實時熒光定量pcr開展時一般采用單一常見的內(nèi)參基因，事實證明，這種操作方法是不可取的，任何外在條件或者內(nèi)在條件的改變都會影響內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性。此外，利用不同的內(nèi)參基因分析同一目的基因的表達量變化差異非常顯著，有的甚至可以達到幾十倍的差異，嚴(yán)重影響實驗結(jié)果的可靠性。因此，本發(fā)明提供的不同溫度脅迫下稻螟赤眼蜂內(nèi)參基因的篩選方法，篩選出表達量最穩(wěn)定的pabpc1作為在定量檢測稻螟赤眼蜂體內(nèi)與溫度調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達量的內(nèi)參基因。

實施例2pabpc1作為內(nèi)參基因的應(yīng)用

1.溫度脅迫

以不同溫度脅迫1小時的稻螟赤眼蜂為實驗樣本，25℃的稻螟赤眼蜂試蟲為對照樣本，pabpc1為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量pcr檢測稻螟赤眼蜂hsp70基因的表達水平。溫度脅迫方法、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照實施例1中的低溫和高溫脅迫、實時熒光定量pcr的操作過程、條件和體系。每個處理設(shè)置2個技術(shù)重復(fù)，3個生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)處理采用2-△△ct方法處理，△△ct＝△ct處理樣本-△ct對照樣本，△ct＝△ct目的基因-△ct內(nèi)參基因。各處理間差異顯著性采用dps軟件進行統(tǒng)計分析。

結(jié)果顯示：低溫處理對稻螟赤眼蜂hsp70基因的表達量無顯著影響；高溫處理中30℃對其表達量亦無顯著影響，但隨著溫度升高到35℃和40℃，hsp70的表達量顯著上調(diào)，與對照樣本相比，分別上調(diào)了2.8倍和5.4倍。

本發(fā)明利用實時熒光定量pcr對不同溫度脅迫條件下稻螟赤眼蜂體內(nèi)10種備選內(nèi)參基因和1種目的基因進行了定量擴增，并采用reffinder軟件分析了內(nèi)參基因穩(wěn)定性，篩選出不同溫度脅迫條件下稻螟赤眼蜂體內(nèi)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因pabpc1。在此基礎(chǔ)上，以稻螟赤眼蜂熱激蛋白基因hsp70為目的基因，pabpc1為內(nèi)參基因，明確了在不同溫度脅迫條件下稻螟赤眼蜂hsp70基因的表達規(guī)律。此發(fā)明篩選出的內(nèi)參基因pabpc1適合不同溫度條件脅迫下稻螟赤眼蜂體內(nèi)目的基因的表達譜分析，為以后溫度脅迫條件下稻螟赤眼蜂基因的定量pcr實驗提供了參考。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>pabpc1基因作為內(nèi)參基因在定量檢測稻螟赤眼蜂基因表達量中的應(yīng)用

<130>gw2017i0812

<160>33

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>361

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcgacaacatcaccaggagatcgctcggatatgcctacgtgaattttcaacaaccggctg60

atgccgaaagagctttggataccatgaactttgacatgatcaaaggcagacctattagaa120

taatgtggtctcagcgcgatccatctcttcgccgctcaggcgttggaaatgttttcatca180

ggaacttggacaaaaacattgataacaaggccatgtatgatactttctcagcttttggca240

acattcttagttgcaaagttgctcaggatgagaaaggttcctccaaagggtacggattcg300

ttcattttgaaaccgaagaagctgccaacaagtccatcgacaaggtcaatggtatgctgc360

t361

<210>2

<211>285

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgtttcagctttgttttatatcagtatgtcatcttaaacaagttataaccagacgtttt60

atcgtgccgttttcgcttatgttcgggagcgtggagttccagacctggatctgcgtggtg120

tgcggcttcttggggatctggacttgcttaacgtccttgggcgaccattacggctacgtg180

aacggctgcgagataaagatcgtgagtaggaacgcctggctccagtggctccacgggccc240

gtgaacgagatcgtgagcgtgatcgtgatcgagaagcagacctga285

<210>3

<211>294

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atgggaaaggaaaagatccatattaacatcgtcgtcattggacacgtagattcaggagcc60

atggttcaagggatggaacgttgagcgcaaagaaggcaaagctgacggcaaatgcctcat120

cgaagccctcgatgccatcctcccaccatccaggccaaccgacaaagccctccgtctccc180

actccaggacgtctacaaaattggcggtattggaacggtaccagtcggtcgtgtcgaaac240

tggtgtgttgaaaccaggtatggttgtcaccttcgccccagctggtttgaccac294

<210>4

<211>453

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<213>人工序列

<400>4

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