本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域，具體涉及一株從百香果根際土壤中篩選的具有強(qiáng)抑草作用真菌。

背景技術(shù)：

百香果(passifloraedulis)又名西番蓮、雞蛋果，是一種種植在熱帶、亞熱帶的藤本植物，其果汁具有助消化和滋補(bǔ)作用備受人們喜愛。據(jù)估計(jì)，目前世界百香果的種植面積已經(jīng)達(dá)到2萬多公頃，但是由于百香果越來越受歡迎，市場(chǎng)的需求量在不斷的增加，百香果的種植面積也在不斷的增加。有統(tǒng)計(jì)表明，80年代初世界對(duì)百香果的需求已經(jīng)超過25萬噸，但生產(chǎn)量也僅為12萬噸，需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于供給。在我國最初是20世紀(jì)初引進(jìn)，主要的種植地有福建、臺(tái)灣、海南、廣東、云南等地。但由于長期的百香果種植，導(dǎo)致百香果種植土壤理化性質(zhì)以及土壤微生態(tài)發(fā)生變化，從而致使百香果的幼苗和成株容易受到根腐病的危害。目前對(duì)于根腐病的研究認(rèn)為其致病菌主要包括鐮刀菌和腐霉菌等病原菌。根際微生物種類豐富、數(shù)量龐大，并且，根與土壤微生物之間基于共同進(jìn)化的壓力，通常它們之間具有專性。此外，根系分泌物的種類會(huì)影響到根際微生物群落結(jié)構(gòu)。

雜草是影響作物產(chǎn)量提高的重要因素，現(xiàn)在已經(jīng)成為世界性的難題。目前主要的除草方式是利用化學(xué)除草劑來進(jìn)行農(nóng)田的雜草防治。但長期、大量、非選擇性的施用化學(xué)除草劑會(huì)導(dǎo)致土壤和地下水污染，雜草也會(huì)產(chǎn)生抗性。高濃度的化學(xué)除草劑也會(huì)增加農(nóng)作物中有害物質(zhì)的殘留。因此，我們需要一種更為生態(tài)友好的方法來進(jìn)行雜草的防治。生物除草劑是用于生物除草的植物病原微生物或微生物植物毒素，它具有環(huán)境安全、相容性好、在土壤中無殘留等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)在的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

化感作用是指植物、藻類、細(xì)菌、真菌、放線菌產(chǎn)生并釋放次生代謝產(chǎn)物來影響周圍其他植物的生長發(fā)育（抑制或促進(jìn)作用）和農(nóng)業(yè)系統(tǒng)。這些次生代謝產(chǎn)物主要包括：酚酸、萜類、黃酮類、脂肪酸等等。這些化感物質(zhì)的含量決定了化感作用的強(qiáng)弱。

本發(fā)明利用植物化感作用原理和根際微生態(tài)的理論，在長期種植百香果的果園并感染根腐病的百香果植株根際篩選對(duì)植物有害的病原菌，為雜草防治減少化學(xué)除草劑使用提供一個(gè)新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一株從百香果根際土壤中篩選的聚多曲霉及其應(yīng)用，該聚多曲霉發(fā)酵液中含有原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、水楊酸和肉桂酸等具有抑草作用的酚酸，因此其發(fā)酵液具有抑草作用。本發(fā)明具有環(huán)境安全、環(huán)境相容性好，在土壤中無殘留等優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一株從桉樹根際土壤中篩選的聚多曲霉，所述聚多曲霉為aspergillussydowiifj-01-bxg-08；已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏日期為2017.4.19，保藏號(hào)為cctccm2017198。

所述聚多曲霉fj-01-bxg-08的菌體及發(fā)酵液均對(duì)萵苣、禾本科的稗草和狼尾巴草的生長具有抑制作用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述從桉樹根際土壤中篩選的聚多曲霉作為抑草真菌的方法，其使用方法如下：

（1）取菌株fj-01-bxg-08進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

（2）取發(fā)酵液稀釋1-100倍；

（3）將稀釋發(fā)酵液澆于種子或植株周圍即可。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

該真菌菌株發(fā)酵液中含有原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、水楊酸和肉桂酸等具有抑草作用的酚酸，其具有環(huán)境安全、環(huán)境相容性好，在土壤中無殘留等優(yōu)點(diǎn)；且對(duì)稗草和萵苣的根長和株高都有很強(qiáng)的抑制率。

附圖說明

圖1菌株fj-01-bxg-08發(fā)酵液中酚酸hplc色譜圖；其中，峰1為原兒茶酸；峰2為對(duì)羥基苯甲酸；峰3為香草酸；峰6為水楊酸；峰7為肉桂酸。

圖2菌株fj-01-bxg-08形態(tài)圖；圖2a為菌株分生孢子圖(10×40)，圖2b為菌落圖。

圖3菌株fj-01-bxg-08-itsi區(qū)目的條帶電泳圖；圖3a中泳道1為真菌菌株fj-01-bxg-08-itsi區(qū)目的條帶電泳圖，泳道2為dl10000dnamarker，圖3b為dl10000dnamarker標(biāo)準(zhǔn)電泳條帶示意圖。

圖4菌株fj-01-bxg-08利用nj法（鄰接法）構(gòu)建的發(fā)育樹。

圖5不同濃度菌株fj-01-bxg-08發(fā)酵液對(duì)小稗生長的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

菌株發(fā)酵液的抑草能力生物測(cè)試

分別在組培瓶中放一張濾紙，取稀釋50倍的發(fā)酵液5ml加入到組培瓶中，每個(gè)組培瓶中播入5粒剛冒白的萵苣，蒸餾水做對(duì)照，并將其置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)3d后測(cè)定萵苣的根長和株高。抑制率計(jì)算按公式：ir=（1-tr/ck）×100%。其中，ir：抑制率(inhibitionrate)；tr：處理(treatment)；ck：對(duì)照(control)。

再分別以稗草和狼尾巴草為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行發(fā)酵液抑草能力測(cè)試。以稗草為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)酵液稀釋20倍；以狼尾巴草為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，菌液稀釋50倍進(jìn)行抑草能力測(cè)試。抑草能力生物測(cè)試實(shí)驗(yàn)步驟同上，抑草能力測(cè)試結(jié)果見表1。

表1fj-01-bxg-08菌株發(fā)酵液稀釋后對(duì)受體植株的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，fj-01-bxg-08菌株發(fā)酵液稀釋50倍后對(duì)萵苣的根長和株高都有很強(qiáng)的抑制作用，分別為80.08%和37.98%。對(duì)狼尾巴草的根長的抑制率達(dá)到45.15%，但對(duì)其株高抑制率只有9.93%。對(duì)于抗性較強(qiáng)的稗草，菌株發(fā)酵液稀釋20倍后對(duì)其根長和株高也有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別達(dá)到58.41%和34.43%。

實(shí)施例2菌株鑒定

1、形態(tài)學(xué)鑒定

菌落的形態(tài)學(xué)觀察

在pda固體培養(yǎng)基平板中間接入用直徑0.8cm的打孔器打下的菌餅，28℃連續(xù)培養(yǎng)7d，每天觀察菌落邊緣和表面的質(zhì)地、顏色紋飾等形態(tài)特征。

顯微鏡形態(tài)觀察

將在pda固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3d的菌落用解剖針挑出一點(diǎn)菌落，放在中間滴有無菌水的載玻片上，然后用兩只解剖針盡量的把菌落分散開，蓋上蓋玻片，用吸水紙把載玻片周圍的水吸干，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子梗和孢子等形態(tài)。

形態(tài)學(xué)鑒定依據(jù)菌落的特征，根據(jù)魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》和c.j.alexpoulos的introductorymycology對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定。

其分生孢子圖及菌落形態(tài)如圖2所示，其中，圖2a為菌株fj-01-bxg-08的分生孢子圖，圖2b為其菌落形態(tài)圖。菌落在pda培養(yǎng)基上恒溫28℃培養(yǎng)5d，直徑達(dá)3.00-4.00cm，菌落質(zhì)地為絲絨狀至絮狀，致密有同心環(huán)，邊緣白色；初生顏色呈灰綠色，老后顏色呈淡褐色；背面為乳白色或暗褐色，表面無滲出物。小分生孢子似青霉?fàn)?，呈疏松柱形或散亂。

2、真菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

利用ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒提取純化的真菌的基因組dna。選用下列真菌通用引物對(duì)菌株itsi區(qū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增測(cè)序：

上游引物its1:5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，

下游引物its4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；

pcr擴(kuò)增體系為25μl，其中2×takarataqtmhsperfectmix3.7μl，上下游引物(20μmol·ml^-1)各0.5μl，dna0.5μl，補(bǔ)充滅菌去離子水至25μl。反應(yīng)條件為94℃4min預(yù)變性后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃45s、55℃45s、72℃1min，30個(gè)循環(huán)后，72℃終延伸10min。取pcr產(chǎn)物5μl，在1%wt瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果見圖3，目的片段fj-01-bxg-08-itsi區(qū)大小約為542bp。pcr產(chǎn)物fj-01-bxg-08-itsi區(qū)經(jīng)膠回收試劑盒純化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將序列信息經(jīng)ncbi數(shù)據(jù)庫分析比對(duì)。

菌株its測(cè)序結(jié)果顯示，其序列大小為542bp，通過與ncbi（blast）中的數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比較，該菌株與aspergillussydowii的序列相似率達(dá)99%以上，推斷該菌株是aspergillussydowii（聚多曲霉屬）。利用mega5.05軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法(neighbor-joining，nj)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。

通過形態(tài)學(xué)和its鑒定結(jié)果表明該菌株是aspergillussydowii（聚多曲霉屬）中的一種。

實(shí)施例3菌株發(fā)酵液中酚酸測(cè)定

取發(fā)酵液100ml，用磷酸調(diào)節(jié)ph到4.00，后加入8g的nacl，溶解后溶液待用。取cleanertpep固相萃取小柱分別經(jīng)蒸餾水-甲醇-蒸餾水(8ml-8ml-6ml)浸潤和淋洗活化，后去除甲醇?xì)堄鄠溆谩⒁呀?jīng)處理過的發(fā)酵液加到已經(jīng)活化的pep固相萃取小柱中，當(dāng)發(fā)酵液都流完后，加入2ml的蒸餾水沖洗，再加入10ml的甲醇洗脫，并收集洗脫液后冷凍干燥。用1ml的甲醇（色譜純）溶解后，用0.22μml濾膜過濾于上樣瓶中，即為發(fā)酵液上樣樣品。

分別取原兒茶酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸等7種酚酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（均購于阿拉丁公司），用甲醇（色譜純）配置成1mg/ml的母液備用。母液稀釋成7個(gè)濃度梯度的混合溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表2。

表2酚酸物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

高效液相色譜的程序參照文獻(xiàn)鄭新宇等，略做調(diào)整，簡述為：高效液相色譜儀為日本島津（cbm-20a，lc-20ad，spd-20a），色譜柱為sunfiretw-c18(4.6mm×250mm,id5μm)；流動(dòng)相:a-甲醇（色譜純）和b-0.1%磷酸溶液（分析純）；洗脫條件：0-5min，a：b=27:73，5-10mina：b=27:73，10-15mina：b=50:50，檢測(cè)波長為280nm；流速為1.6ml/min；進(jìn)樣量10μl；柱溫為30℃。

測(cè)試溶液的譜圖與混合標(biāo)樣譜圖對(duì)照，按保留時(shí)間確定物質(zhì)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各物質(zhì)的相對(duì)含量；試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，各物質(zhì)含量如表3所示。

表3菌株fj-01-bxg-08的菌液酚酸含量分析

菌株fj-01-bxg-08菌液的hplc檢測(cè)結(jié)果見表2，菌液中含原兒茶酸0.078mg/l，含對(duì)羥基苯甲酸1.05mg/l，含香草酸4.19mg/l，含水楊酸28.17mg/l，含肉桂酸最高33.39mg/l。

實(shí)施例4菌株抑草潛力驗(yàn)證-盆栽實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度28℃，12h光照。取稻田土自然晾干，碾碎后去除土中的碎石和雜物，過篩。稱取過篩后的細(xì)土500g置于塑料盆（直徑12cm，高6cm）中。將已催芽的小稗5粒播入土壤表層。對(duì)fj-01-bxg-08菌株在28℃，180rpm/min,培養(yǎng)7天的發(fā)酵液進(jìn)行3個(gè)梯度稀釋，共4個(gè)處理。處理1：原液，處理2：稀釋5倍，處理3：稀釋20倍，處理4：稀釋50倍。分別將各梯度的30ml稀釋液澆于種子周圍。對(duì)照為蒸餾水。每個(gè)處理重復(fù)3次。每天用噴霧器添加20ml蒸餾水以保持土壤濕潤。種植5d后測(cè)定受體植株的根長和株高。

菌株發(fā)酵液對(duì)土培條件下的小稗的影響見表4，結(jié)果表明不同濃度梯度的菌株發(fā)酵液對(duì)小稗幼苗的生長是有影響的。對(duì)稗草株高的抑制率最高的達(dá)到56.53%。

表4發(fā)酵液對(duì)土培稗草的影響

菌株發(fā)酵液對(duì)土培條件下的小稗的影響見表4，結(jié)果表明不同濃度梯度的菌株發(fā)酵液均可抑制小稗幼苗的生長，其抑制率高于40%；可用于抑制雜草生長。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建農(nóng)林大學(xué)

<120>一株從百香果根際土壤中篩選的具有強(qiáng)抑草作用真菌

<130>3

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>上游引物its1

<400>1

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>下游引物its4

<400>2

tcctccgcttattgatatgc20

<210>3

<211>584

<212>dna

<213>fjfafu-bxg01-itsi區(qū)

<400>3

taggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggtcctttgggcccaacctcccatc60

cgtgtctattgtaccctgttgcttcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcg120

cctctgccccccgggcccgtgcccgccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgt180

gcagtctgagttgattgaatgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttcc240

ggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaa300

tcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccga360

gcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggg420

gacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtc480

acatgctctgtaggattggccggcgcctgccgacgttttccaaccattctttccaggttg540

acctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaa584