本發(fā)明涉及多肽合成領域，具體是一種e75肽的液相合成方法。
背景技術：
：乳腺癌是女性中最常見的癌癥，并且是女性中與癌癥相關死亡的第二主導因素。過去20年間在乳腺癌治療中的主要進展使得無疾病生存(dfs)率顯著提高。例如，已經(jīng)將利用對腫瘤相關抗原有反應性的抗體療法用于阻斷特定的細胞過程以減緩疾病進展或者預防疾病復發(fā)。盡管近來在乳腺癌治療上有所進展，但是由于目前治療乳腺癌的方法無法有效地根除殘留的癌細胞，因而乳腺癌的復發(fā)率和轉移率比較高，而一旦出現(xiàn)轉移和復發(fā)，對于患者來說面臨一個更為復雜和難治的問題。免疫治療從理論上來說完全可以解決這一問題，疫苗品種或源于自身腫瘤細胞，或源于外部的一些活性物質如多肽等。由于這類品種不同于化學藥物，通常源于人體自身組織，因此副作用小，易于控制，使得利用腫瘤抗原多肽疫苗進行腫瘤免疫治療成為一個新的模式和熱點。her2/neu基因在以乳腺癌為代表的各種腺癌中過表達，在癌細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的her2/neu蛋白。her2/neu蛋白在癌細胞內(nèi)被片段化，產(chǎn)生由8-12個氨基酸構成的her2/neu肽。her2/neu肽與mhci類分子結合并轉移到癌細胞表面作為抗原提呈，成為癌細胞的標志物。e75肽是一種her2/neu肽，由9個氨基酸組成，其氨基酸序列為lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu。e75肽/mhci類分子復合體激活樹突狀細胞，并轉移到淋巴結，激活用于識別所述e75肽/mhci類分子復合體的cd8陽性t淋巴細胞，使其分化成為細胞毒性t細胞(ctl)，并且增殖。ctl識別具有e75肽/mhci類分子復合體的腫瘤細胞，并攻擊該腫瘤細胞。因此，e75肽可以作為癌癥疫苗使用。國內(nèi)外多項研究表明，e75肽與體內(nèi)的hla細胞結合后，能激發(fā)體內(nèi)殺死腫瘤的t細胞的產(chǎn)生。t細胞能識別具備這種多肽以及her2/neu蛋白的腫瘤細胞，從而阻止具有her2/neu蛋白的腫瘤細胞的擴散和轉移。已經(jīng)有大量的關于e75肽的實驗室和臨床研究，一項ii期臨床試驗公布了e75肽用于防治乳腺癌5年的研究數(shù)據(jù)。目前報道的e75肽的制備都是通過多肽固相合成工藝獲得的。固相合成有其顯著的優(yōu)勢，操作簡單并加速了多步驟的合成；但固相合成的存在主要問題是各步反應均需使用保護氨基酸、固相載體上中間體雜質無法分離，這造成最終產(chǎn)物含雜質較多，對分離純化的要求更高，使得制備成本增加。固相合成的產(chǎn)量一般不會太高，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)也不方便。此外，在多肽合成領域，不同的合成策略對終產(chǎn)物的純度和收率均有很大影響。因此，目前需要一種新的e75肽合成方法，既可以保證產(chǎn)物的純度和收率，又可以提高合成工藝的簡便性和規(guī)模性，從而降低e75肽的生產(chǎn)成本。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種e75肽的液相合成方法，以解決上述
背景技術：
中提出的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種e75肽的液相合成方法，分別合成e75肽的3個三肽片段boc-lys-ile-phe-oh、nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3和nh2-ala-phe-leu-och3，再將所述三肽片段依次縮合得到e75肽。作為本發(fā)明進一步的方案：所述e75肽的液相合成方法，包括以下步驟：(1)將boc-ile-oh與nh2-phe-och3進行縮合反應得到二肽片段boc-ile-phe-och3，除去boc保護基得到nh2-ile-phe-och3，將nh2-ile-phe-och3與boc-lys-oh進行縮合反應得到boc-lys-ile-phe-och3，將其水解得到片段一boc-lys-ile-phe-oh；(2)將boc-gly-oh與ser(t-bps)-och3進行縮合反應得到二肽片段boc-gly-ser(t-bps)-och3，將其水解得到boc-gly-ser(t-bps)-oh，將boc-gly-ser(t-bps)-oh與nh2-leu-och3進行縮合反應得到boc-gly-ser(t-bps)-leu-och3，去除保護基boc得到片段二nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3；(3)將片段一boc-lys-ile-phe-oh與片段二nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3進行縮合得到boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-och3，然后水解得到六肽片段boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh；(4)將boc-phe-oh與nh2-leu-och3進行縮合反應得到二肽片段boc-phe-leu-och3，去除保護基boc得到nh2-phe-leu-och3，將nh2-phe-leu-och3與boc-ala-oh進行縮合反應，得到boc-ala-phe-leu-och3，去除保護基boc得到片段三nh2-ala-phe-leu-och3；(5)將上述步驟(3)所得六肽片段boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh與上述步驟(4)所得片段三nh2-ala-phe-leu-och3進行縮合反應得到boc-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3，然后去除保護基t-bps、boc及och3，得到e75肽lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu粗品；(6)采用hplc法純化即得e75肽。作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(1)中，將boc-ile-oh與nh2-phe-och3按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入diea，油浴至外溫30℃，反應18h，得到二肽片段boc-ile-phe-och3，在hcl/ea中除去boc保護基得到nh2-ile-phe-och3；將所述nh2-ile-phe-och3與boc-lys-oh按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入三乙胺，油浴至外溫25℃，反應18h，得到boc-lys-ile-phe-och3，然后在lioh、thf和水的作用下將所述boc-lys-ile-phe-och3水解得到片段一boc-lys-ile-phe-oh。作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(2)中，將boc-gly-oh與ser(t-bps)-och3進行按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入三乙胺，油浴至外溫25℃，反應18h，將反應液倒入水中，分別用ea萃取和飽和食鹽水洗滌，干燥濃縮，得到二肽片段boc-gly-ser(t-bps)-och3，在lioh、thf和水的作用下將所述boc-gly-ser(t-bps)-och3水解得到boc-gly-ser(t-bps)-oh，將所述boc-gly-ser(t-bps)-oh與nh2-leu-och3進行按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入三乙胺，油浴至外溫25℃，反應18h，分別用ea萃取和飽和食鹽水洗滌，干燥濃縮后加入ea和正庚烷，攪拌，抽濾得到boc-gly-ser(t-bps)-leu-och3，然后在tmsotf和dcm的混合溶液中去除boc保護基得到片段二nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3。作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(3)中，將片段一boc-lys-ile-phe-oh與片段二nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入三乙胺，油浴至外溫25℃，反應18h，將反應液倒入水中，析出固體后，抽濾，將濾餅用dcm溶解，濃縮，加入正庚烷，析出固體后，抽濾，得到boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-och3，然后在lioh、thf和水的作用下將所述boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-och3水解得到六肽片段boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh。作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(4)中，將boc-phe-oh與nh2-leu-och3按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入三乙胺，油浴至外溫25℃，反應18h，將反應液倒入水中，析出白色固體后，抽濾，得到二肽片段boc-phe-leu-och3，然后在hcl和ea的混合溶液中去除保護基boc得到nh2-phe-leu-och3，將所述nh2-phe-leu-och3與boc-ala-oh按照摩爾比1:1混合，加入hobt、edci和dmf，攪拌，再加入三乙胺，油浴至外溫25℃，反應18h，分別用ea萃取和飽和食鹽水洗滌，濃縮有機相，得到boc-ala-phe-leu-och3，然后在hcl和ea的混合溶液中去除保護基boc得到片段三nh2-ala-phe-leu-och3。作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(5)中，將上述步驟(3)所得六肽片段boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh與上述步驟(4)所得片段三nh2-ala-phe-leu-och3按照摩爾比1:1混合，加入hbtu和dmf，攪拌，再加入diea，油浴至外溫30℃，反應18h，將反應液倒入水中，析出固體后，抽濾，得到白色固體，甲醇打漿，過濾，得到boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-ala-phe-leu-och3，然后依次在tbaf/thf、hcl/ea混合液以及l(fā)ioh、thf和水的作用下去除保護基t-bps、boc及och3，得到e75肽，lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu。作為本發(fā)明進一步的方案：步驟(6)中，采用pre-hplc法純化e75肽，具體參數(shù)如下：填料：粒徑50～70μm的c18洗脫劑：a：甲醇，含0.5‰三氟乙酸；b：純水，含0.5‰三氟乙酸吸收波長：210nm樣品溶劑：dmso7.5ml。將洗脫劑在35℃進行減壓蒸餾，除去大部分的甲醇，用飽和nahco3水溶液調(diào)節(jié)ph值至7，得到大量白色乳濁固體析出，抽濾，反復水洗，然后加入純水溶解后冷凍干燥，凍干產(chǎn)物為白色粉末狀固體。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用液相合成多肽的方法，對反應過程中的各步中間體可以實現(xiàn)逐個控制，克服了固相合成終產(chǎn)品中雜質含量大、純化分離要求高的缺點。本發(fā)明的方法操作簡單，采用的boc及甲氧基保護策略可控性很強，各步反應收率較高，產(chǎn)物易于分離純化，終產(chǎn)物純度可達97％以上；同時，該發(fā)明容易實現(xiàn)e75肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，批量易于放大，中試階段就可以實現(xiàn)公斤級制備。附圖說明圖1是多肽片段一(a)、片段二(b)和片段三(c)的合成路線示意圖。圖2是由多肽片段一、片段二和片段三縮合得到e75肽的合成路線示意圖。圖3是e75肽的液相色譜圖。圖4是e75肽的質譜圖。圖5是e75肽的體外淋巴細胞增殖活性圖。圖6是不同濃度的e75肽對淋巴細胞增殖的影響結果圖。圖7是本發(fā)明實施例1中boc-lys-oh(s48094)的合成路線圖；圖8是本發(fā)明實施例2中boc-ile-phe-och3(s49082)的合成路線圖；圖9是本發(fā)明實施例3中nh2-ile-phe-och3(s49083)的合成路線圖；圖10是本發(fā)明實施例4中boc-lys-ile-phe-och3(s48538)的合成路線圖；圖11是本發(fā)明實施例5中boc-lys-ile-phe-oh(s48735)的合成路線圖；圖12是本發(fā)明實施例6中ser(t-bps)-och3(s48511)的合成路線圖；圖13是本發(fā)明實施例7中boc-gly-ser(t-bps)-och3(s48537)的合成路線圖；圖14是本發(fā)明實施例8中boc-gly-ser(t-bps)-oh(s48627)的合成路線圖；圖15是本發(fā)明實施例9中boc-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48640)的合成路線圖；圖16是本發(fā)明實施例10中nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48736)的合成路線圖；圖17是本發(fā)明實施例11中boc-phe-leu-och3(s48110)的合成路線圖；圖18是本發(fā)明實施例12中nh2-phe-leu-och3(s48111)的合成路線圖；圖19是本發(fā)明實施例13中boc-ala-phe-leu-och3(s48112)的合成路線圖；圖20是本發(fā)明實施例14中nh2-ala-phe-leu-och3(s48113)的合成路線圖；圖21是本發(fā)明實施例15中boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48737)的合成路線圖；圖22是本發(fā)明實施例16中boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh(s48738)的合成路線圖；圖23是本發(fā)明實施例17中boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-ala-phe-leu-och3(s48739)的合成路線圖；圖24是本發(fā)明實施例18中boc-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48442)的合成路線圖；圖25是本發(fā)明實施例19中nh2-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48259)的合成路線圖；圖26是本發(fā)明實施例20中e75肽(s48260)的合成路線圖。具體實施方式下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的術語縮寫具有以下含義；dic：n，n′-二異丙基碳化二亞胺dcc：n，n′-二環(huán)己基碳二亞胺pybop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷hatu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯hobt：1-羥基苯并三唑boc：叔丁氧羰基ile：異亮氨酸leu：亮氨酸gly：甘氨酸ala：丙氨酸phe：苯丙氨酸glu：谷氨酸lys：賴氨酸ser：絲氨酸dmf：n，n′-二甲基甲酰胺dcm：二氯甲烷nmp：n-甲基吡咯烷酮dmso：二甲基亞砜diea：n，n′-二異丙基乙胺edci：碳化二亞胺thf：四氫呋喃ea：丙烯酸乙酯tmsotf：三氟甲基磺酸三甲基硅酯hbtu：o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽tbaf：四丁基氟化銨實施例1：boc-lys-oh(s48094)的合成請參閱圖7，將lys(s48058)(26.48g，121.7mmol/1.0eq)加入1000ml單口瓶，依次加入300ml二氧六環(huán)和300ml水，攪拌，用3mnaoh溶液調(diào)節(jié)ph＝13，再加入0.3gdmap和60mlboc2o，室溫反應18h，用1mhcl調(diào)節(jié)ph＝3，用3×200mlea萃取，再用300ml飽和食鹽水萃取1次，將有機相濃縮，得到19gboc-lys-oh(s48094)固體，收率為46％。實施例2：boc-ile-phe-och3(s49082)的合成請參閱圖8，將boc-ile(s48243)(22.53g，97.5mmol/1.0eq)加入1000ml三口瓶，依次加入phe-och3(s07451)(20.97g，97.5mmol/1.0eq)、hobt(15.8g，117.0mmol/1.2eq)、edci(22.47g，117.0mmol/1.2eq)和dmf(350ml，14m/v)，攪拌，再加入diea(38g，293mmol/3.0eq)，油浴至外溫30℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入1000ml水中，析出固體后，抽濾，得到35g白色boc-ile-phe-och3(s49082)固體，收率為91％。實施例3：nh2-ile-phe-och3(s49083)的合成請參閱圖9，將boc-ile-phe-och3(s49082)(6g，17.44mmol/1.0eq)加入250ml三口瓶，加入hcl/ea(20ml，4m)，攪拌，室溫反應1h，抽濾，得到4g白色nh2-ile-phe-och3(s49083)固體，純度為96％，收率為70％。實施例4：boc-lys-ile-phe-och3(s48538)的合成請參閱圖10，將boc-lys-oh(s48094)(21g，60.693mmol/1.0eq)加入1000ml三口瓶，依次加入nh2-ile-phe-och3(s49083)(19.97g，60.693mol/1.0eq)、hobt(9.83g，72.832mmol/1.2eq)、edci(13.98g，72.832mmol/1.2eq)和dmf(400ml，18m/v)，攪拌，再加入三乙胺(18.39g，182.08mmol/3.0eq)，油浴至外溫25℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入2500ml水中，析出固體后，抽濾，得到固體boc-lys-ile-phe-och3(s48538)。實施例5：boc-lys-ile-phe-oh(s48735)的合成請參閱圖11，將boc-lys-ile-phe-och3(s48538)(66g，106.4mmol/1.0eq)加入1l單口瓶，依次加入thf(270ml，4m/v)、水(270ml，4m/v)和lioh.h2o(8.94g，212.9mmol/2.0eq)，攪拌，5～10℃反應2h，反應完成，調(diào)節(jié)ph＝3，3×0.5lea萃取，再用2×0.3l飽和食鹽水萃取，有機相濃縮得到60g白色固體，將固體加入到300mlea中，攪拌0.5h，抽濾，得到47g白色boc-lys-ile-phe-oh(s48735，即片段一)固體，純度為90％，收率為73％。實施例6：ser(t-bps)-och3(s48511)的合成請參閱圖12，將ser-och3(s48059)(40g，0.258mol/1.0eq)加入1000ml三口瓶，依次加入咪唑(36.78g，0.542mol/2.1eq)、dmap(0.65g，催化量)和dcm(0.6l，15m/v)，攪拌，冰水浴，在0～5℃下，加入bpscl(72.26g，00.263mol/1.02eq)，8～10℃下反應18h，反應完成，將反應液抽濾，母液濃縮，得到109g油狀固體，加入2lea稀釋，有白色固體析出，抽濾，母液濃縮，得到98.9g黃色油狀ser(t-bps)-och3(s48511)固體，收率為100％。實施例7：boc-gly-ser(t-bps)-och3(s48537)的合成請參閱圖13，將ser(t-bps)-och3(s48511)(98.9g，0.277mol/1.0eq)加入2000ml三口瓶，依次加入boc-gly(s48060)(48.53g，0.277mol/1.0eq)、hobt(44.87g，0.332mol/1.2eq)、edci(63.83g，0.332mol/1.2eq)和dmf(1.5l，15m/v)，攪拌，再加入三乙胺(83.9g，0.83mol/3.0eq)，油浴至外溫25℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入3000ml水中，2×1lea萃取，5×0.5l飽和食鹽水洗滌，干燥，濃縮，得到100g白色boc-gly-ser(t-bps)-och3(s48537)固體，收率為70％。實施例8：boc-gly-ser(t-bps)-oh(s48627)的合成請參閱圖14，將boc-gly-ser(t-bps)-och3(s48537)(115g，240.5mmol/1.0eq)加入2l單口瓶，依次加入thf(600ml，10m/v)、水(600ml，10m/v)和lioh.h2o(20.2g，481.1mmol/2.0eq)，攪拌，5～10℃反應2h，反應完成，調(diào)節(jié)ph＝3，3×1lea萃取，2×0.5l飽和食鹽水萃取，有機相濃縮得到114g白色boc-gly-ser(t-bps)-oh(s48627)固體，純度為88％，收率為95％。實施例9：boc-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48640)的合成請參閱圖15，將boc-gly-ser(t-bps)-oh(s48627)(100g，0.2mol/1.0eq)加入2000ml三口瓶，依次加入leu-och3(s48065)(36.2g，0.2mol/1.0eq)、hobt(32.4g，0.24mol/1.2eq)、edci(46.1g，0.24mol/1.2eq)和dmf(1.2l，12m/v)，攪拌，再加入三乙胺(60.6g，0.6mol/3.0eq)，油浴至外溫25℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入5000ml水中，2×1lea萃取2次，5×0.5l飽和食鹽水洗滌5次，干燥，濃縮，加入200mlea和400ml正庚烷，攪拌0.5h，抽濾，得到46g白色boc-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48640)固體，純度為97％，收率為36％。實施例10：nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48736)的合成請參閱圖16，將boc-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48640)(35g，56mmol/1.0eq)加入1000ml單口瓶，再加入dcm(400ml，12m/v)，攪拌，緩慢滴加tmsotf(24.8g，112.0mmol/2.0eq)，室溫反應0.5h，反應完成，反應液濃縮，得到34gnh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48736，即片段二)固體，純度為95％，收率為100％。實施例11：boc-phe-leu-och3(s48110)的合成請參閱圖17，將boc-phe-oh(s48056)(50g，0.188mol/1.0eq)加入1000ml三口瓶，依次加入leu-och3(s48065)(34.24g，0.188mol/1.0eq)、hobt(27.99g，0.21mol/1.1eq)、edci(39.8g，0.21mol/1.1eq)和dmf(800ml，16m/v)，攪拌，再加入三乙胺(57.1g，0.565mol/3.0eq)，油浴至外溫25℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入3.2l水中，有白色固體析出，抽濾，得到69g白色boc-phe-leu-och3(s48110)固體，收率為93％。實施例12：nh2-phe-leu-och3(s48111)的合成請參閱圖18，將boc-phe-leu-och3(s48110)(51g，0.13mol/1.0eq)加入1000ml單口瓶，再加入4mhcl/ea(325ml，1.3mol/10eq)，攪拌，室溫反應(15～20℃)，反應1.5h，反應完成，反應液濃縮，得到46.5g白色nh2-phe-leu-och3(s48111)固體，純度為100％，收率為94％。實施例13：boc-ala-phe-leu-och3(s48112)的合成請參閱圖19，將nh2-phe-leu-och3(s48111)(52.5g，0.16mol/1.0eq)加入2000ml三口瓶，依次加入boc-ala-oh(s48063)(30.1g，0.16mol/1.0eq)、hobt(25.65g，0.19mol/1.2eq)、edci(36.48g，0.19mol/1.2eq)和dmf(750ml，13m/v)，攪拌，再加入三乙胺(48.28g，0.478mol/3.0eq)，油浴至外溫25℃，反應18h，反應完成，用3×1lea萃取，再用5×1l飽和食鹽水洗滌，濃縮有機相，得到60g白色boc-ala-phe-leu-och3(s48112)固體，收率為80％。實施例14：nh2-ala-phe-leu-och3(s48113)的合成請參閱圖20，將boc-ala-phe-leu-och3(s48112)(34g，73.4mmol/1.0eq)加入500ml三口瓶，再加入hcl/ea(4m，92ml，367mmol/5.0eq)，攪拌，室溫反應2h，反應完成，將反應液倒入500ml正庚烷中，析出固體后，抽濾，得到30gnh2-ala-phe-leu-och3(s48113，即片段三)白色固體，純度為97％，收率為91％。實施例15：boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48737)的合成請參閱圖21，將boc-lys-ile-phe-oh(s48735)(29.5g，48.7mmol/1.0eq)加入1000ml三口瓶，依次加入nh2-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48736)(33.0g，48.7mmol/1.0eq)、hobt(7.8g，58.4mmol/1.2eq)、edci(11.2g，58.4mmol/1.2eq)和dmf(400ml，14m/v)，攪拌，再加入三乙胺(14.8g，146.0mmol/3.0eq)，油浴至外溫25℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入2000ml水中，析出固體后，抽濾，濾餅加入1000mldcm溶解，濃縮至300ml，加入2l正庚烷，固體析出，抽濾，得到51g白色boc-lys-ile-phe-gly-ser-leu-och3(s48737)固體，純度為91％，收率為84％。實施例16：boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh(s48738)的合成請參閱圖22，將boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-och3(s48737)(48g，43mmol/1.0eq)加入1000ml三口瓶，依次加入thf(1000ml，20m/v)、水(300ml，5.5m/v)和lioh.h2o(3.6g，86mmol/2.0eq)，攪拌，室溫反應2h，反應完成，調(diào)節(jié)ph＝3，3×1lea萃取3次，2×1l飽和食鹽水萃取2次，有機相濃縮至800ml，加入2.5l正庚烷，攪拌，抽濾，甲醇打漿，過濾，得到37g白色boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh(s48738)固體，純度為93％，收率為60％。實施例17：boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-ala-phe-leu-och3(s48739)的合成請參閱圖23，將boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-oh(s48738)(5.5g，5.0mmol/1.0eq)加入250ml三口瓶，依次加入nh2-ala-phe-leu-och3(s48113)(2.0g，5.0mmol/1.0eq)、hbtu(2.3g，6.0mmol/1.2eq)和dmf(60ml，11m/v)，攪拌，再加入diea(1.9g，15.0mmol/3.0eq)，油浴至外溫30℃，反應18h，反應完成，將反應液倒入500ml水中，析出固體后，抽濾，得到5.8g白色固體，甲醇打漿，過濾，得到3gboc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-ala-phe-leu-och3(s48739)固體，純度為92％，收率為41％。實施例18：boc-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48442)的合成請參閱圖24，將boc-lys-ile-phe-gly-ser(t-bps)-leu-ala-phe-leu-och3(s48739)(5.8g，4.0mmol/1.0eq)加入250ml單口瓶，依次加入thf(60ml，10m/v)和tbaf/thf(1m，8.0mmol/2.0eq)，攪拌，5～10℃反應2h，反應完成，加入200ml水，析出固體后，抽濾，得到4.0g白色s48442固體，加入20ml甲醇打漿，過濾，得到2gboc-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48442)固體，純度為93％，收率為41％。實施例19：nh2-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48259)的合成請參閱圖25，將boc-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48442)(4.0g，3.3mmol/1.0eq)加入100ml單口瓶，再加入hcl/ea(4m，16.5mmol/5.0eq)，冰水浴，攪拌，反應2h，反應完成，加入正庚烷(50ml，12.5m/v)，有白色固體析出，抽濾，得到3gnh2-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48259)固體，收率為90％。實施例20：e75肽(s48260)的合成請參閱圖26，將nh2-lys-ile-phe-gly-ser-leu-ala-phe-leu-och3(s48259)(3g，3.0mmol/1.0eq)加入250ml單口瓶，依次加入thf(90ml，30m/v)、水(30ml，10m/v)和lioh.h2o(0.50g，12.0mmol/4.0eq)，冰水浴，攪拌2h，反應完成，調(diào)節(jié)ph＝6，將反應液濃縮至90ml，抽濾，濾餅干燥，得到2.45ge75肽(s48260)粗品，形態(tài)為白色固體，純度為79％，收率為82％。實施例21：e75肽的hplc純化采用pre-hplc法純化e75肽粗品，主要參數(shù)如下：填料：粒徑50～70μm的c18；洗脫劑：a：甲醇(含0.5‰三氟乙酸)；b：純水(含0.5‰三氟乙酸)吸收波長：210nm樣品溶劑：dmso(7.5ml)。具體步驟：樣品預處理：取適量e75肽粗品于器皿中，加適量水進行溶解，超聲助溶至澄清無顆粒，用0.45μm膜過濾。純化條件如表1：表1色譜系統(tǒng)制備型高效液相色譜系統(tǒng)檢測波長220nm上樣流速350ml/min洗脫流速400ml/min洗脫梯度：可以調(diào)整梯度使出峰時間控制在35分鐘左右，如表2所示。表2時間(min)a1相(v/v)b相(v/v)095557921657728操作：先用甲醇∶水＝30∶70洗柱10分鐘，再用流動相平衡10分鐘后上樣，按上述純性梯度進行洗脫，按峰分時間段收樣；根據(jù)分析hplc檢測結果并樣。如表3所示。表3實施例22：e75肽的理化性質鑒定本實施例對上述實施例21純化得到的e75肽進行理化性質鑒定。采用液相色譜法鑒定e75肽的純度，hplc圖譜參見圖3，產(chǎn)物純度>97％。采用質譜法對e75肽進行結構表征，質譜圖見圖4，其分子量為996，與理論值一致，說明制備產(chǎn)物為e75肽。實施例23：e75肽的生物活性鑒定因為e75肽作為抗原，可以被淋巴細胞識別和結合，促進淋巴細胞的增殖和活化，因此通過淋巴細胞增殖實驗檢測e75肽的生物活性。實驗材料：e75肽：采用上述實施例21純化得到的e75肽，用去離子水溶解，配制成500μg/ml原液，0.22μm無菌濾器過濾除菌備用。e75肽工作濃度：e75肽液相100μg/mle75肽液相50μg/mle75肽液相25μg/mle75肽液相12.5μg/mle75肽液相6.25μg/mlpbs：pbs緩沖液作為陰性對照。cona:cona(購自聯(lián)科生物)為陽性對照，以pbs溶解配制成200μg/ml原液，0.22μm無菌濾器過濾備用。細胞：nci-n87人胃癌細胞，購自中科院上海細胞庫。動物：balb/c小鼠，5只，雌性，6-8周齡，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。實驗方法：取balb/c小鼠5只，分離脾臟淋巴細胞；將balb/c小鼠轉移至超凈臺中，用剪刀和鑷子剪開balb/c小鼠皮膚，使腹腔內(nèi)脾臟可見，小心用鑷子夾出脾臟，用剪刀盡量去除附著在其上的脂肪組織，取出后浸泡于rpmi1640中，稍作清洗；分離脾淋巴細胞：無菌培養(yǎng)皿中加入5ml淋巴細胞分離液，用止血鉗將尼龍膜固定在培養(yǎng)皿上，放上脾臟，以注射器柱芯研磨，研磨時間不超過5分鐘。將上述培養(yǎng)皿中的淋巴細胞分離液轉移至15ml離心管，沿管壁小心加入約500μl無血清rpmi1640，立即800g室溫離心30分鐘。離心后，用細胞玻璃吸管小心的將第二層的淋巴細胞層吸出至15ml離心管中，加入10倍體積無血清rpmi1640，混勻后250g室溫離心10分鐘；淋巴細胞計數(shù)：小心棄去上清，用1ml淋巴細胞培養(yǎng)基重懸細胞，稀釋100倍計數(shù)；96孔細胞培養(yǎng)板中接種鼠淋巴細胞懸液(2.5×105/100μl/孔)，接種4塊培養(yǎng)板，以備不同時間(培養(yǎng)0h、24h、48h、72h)檢測用；每孔中加入相應的藥物：e75肽100、50、25、12.5、6.25μg/ml；pbs為陰性對照；10μg/mlcona為陽性對照；每個樣品設3個實驗孔。37℃、5％co2條件下孵育24、48、72、96小時；分別在孵育0、24、48和72h時取出一塊培養(yǎng)板，加cck-8溶液。每孔中加入20μlcck-8溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時；用酶標儀測定450nm處的吸光度。結果：表4不同時間各組淋巴細胞增殖率a：增殖率＝(實驗孔a450平均值/陰性對照a450平均值-1)×100根據(jù)表4，對樣品的a450和淋巴細胞增殖率分別作圖，得到圖5和6，從圖5和6可以看出，利用本發(fā)明液相合成法制備的e75肽具有促進淋巴細胞增殖的活性，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，說明本發(fā)明的合成產(chǎn)物具有生物活性。對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。當前第1頁12