本發(fā)明屬于基因載體技術領域，具體涉及一種可作為非病毒基因載體的基于δ-戊內酯的聚合物及其制備方法與應用。

背景技術：

基因治療是將外源正?；驅氩◇w細胞以替換或修補缺陷的基因，從而達到治療相應疾病的目的。在細胞膜上有很多帶有負電荷的糖蛋白和糖脂化合物，核酸的骨架結構中的磷酸基團也帶有負電荷，并且核酸本身具有較大的體積，因此裸露的核酸難以被細胞吞噬。為了解決裸露核酸難以被細胞攝取的難題，科研工作者們發(fā)展了基因載體?；蜉d體可以有效的將細胞外的核酸帶入細胞內，并可以一定程度上保護核酸在細胞核不被核酸酶水解。另外，基因載體在運輸核酸進入細胞后，也可以將核酸釋放，而被釋放的核酸又可以進入細胞核進行相應的蛋白表達，最終達到基因治療的目的。

基因載體一般可分為兩類，一類是病毒型載體，一類是非病毒載體。通常，病毒型載體的轉染效率很高，并且可進行迅速表達，因而病毒型載體在臨床試驗中被廣泛使用。但是，病毒型載體也有其固有的缺陷，如：潛在的免疫原性和致瘤性；攜帶的核酸尺寸有限(通常為2-3kb)；制備和存儲困難復雜等。而非病毒型載體不僅僅可以完全避免上述缺陷，且其本身還有很多其他優(yōu)點，如結構可調、可大規(guī)模生產和具有靶標性。這些特性更利于非病毒載體在基因治療中的應用。但是非病毒基因載體也有一些問題需要解決，就是轉染效率相對病毒基因載體低、毒性相對較大。因此，發(fā)展高效低毒的非病毒基因載體是非常重要的。

目前，非病毒類載體有很多種，包括陽離子化合物，陽離子脂質體，陽離子聚合物，功能納米粒子，無機配合物以及量子點等。在陽離子聚合物中，聚酯類由于其酯鍵可水解，容易被降解，所以應用到臨床的可能性更大。所以，基于聚酯的非病毒基因載體的設計與合成對可降解的非病毒基因載體具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

作為各種廣泛且細致的研究和實驗的結果，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，α,β-不飽和δ-戊內酯上連接不同的側鏈，按照不同比例開環(huán)聚合得到不同聚合物，它們可以有效凝聚dna，并與dna形成納米顆粒通過內吞作用進入細胞中，利于跨膜，采用該聚合物形成的基因載體具有較高的轉染效率，具有較低的細胞毒性。基于這種發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種制備基于δ-戊內酯的聚合物的方法，在α,β-不飽和δ-戊內酯的基礎上，連接不同的側鏈，按照不同比例開環(huán)聚合得到不同聚合物，制備方法簡單方便，產率高；制得的聚合物可以有效凝聚dna形成納米顆粒，利于細胞攝取。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種基于δ-戊內酯的聚合物，所述基于δ-戊內酯的聚合物具有下面顯示的[化學式1]中的結構：

[化學式1]

其中，r2是選自含硫的直鏈烷基中的任意一種，n大于或等于1，m大或等于0。

優(yōu)選的是，其中，r2是選自含有硫的c4、c8、c12和c16直鏈烷基中的一種。

優(yōu)選的是，其中，r2為和中的一種。

優(yōu)選的是，其中，所述聚合物為嵌段共聚物，無規(guī)共聚物和均聚物中的一種。

本發(fā)明的目的還可以進一步由基于δ-戊內酯的聚合物的制備方法來實現(xiàn)，所述方法包括以下步驟：

步驟一、通過click反應制備下面顯示的[化學式2]與[化學式3]的單體化合物；

步驟二、[化學式2]單體化合物與[化學式3]單體化合物進行開環(huán)聚合反應制備[化學式1]所示的基于δ-戊內酯的聚合物；

其中，

[化學式2]

[化學式3]

其中，a為2，6，10或14。

優(yōu)選的是，其中，所述步驟一中，具體包括以下步驟：

s1.按比例稱取環(huán)外的α,β-不飽和δ-戊內酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入溶劑，在氬氣氛圍下反應，反應后減壓濃縮干，減壓蒸餾，得到化合物[化學式2]單體化合物；

s2.按比例分別稱取環(huán)外的α,β-不飽和δ-戊內酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇，催化劑，加入溶劑溶解，在氬氣氛圍下反應8-10h，反應結束后，減壓濃縮，硅膠柱層析分離得到[化學式3]單體化合物。

優(yōu)選的是，其中，所述步驟二中，基于δ-戊內酯的聚合物為嵌段聚合物，無規(guī)共聚物或均聚物，其中，嵌段聚合物的合成步驟具體為：稱取[化學式2]單體化合物，加入引發(fā)劑和催化劑，在手套箱內進行開環(huán)聚合反應，當轉化率為80％以上時，再按比例加入[化學式3]單體化合物，形成嵌段聚合物，其中，[化學式2]單體化合物、[化學式3]單體化合物、引發(fā)劑的摩爾比為20:20-30:1；無規(guī)共聚物的合成步驟具體為：分別稱取[化學式2]單體化合物與[化學式3]單體化合物，加入引發(fā)劑和催化劑，在手套箱內進行開環(huán)聚合反應，形成無規(guī)共聚物，其中，[化學式2]單體化合物、[化學式3]單體化合物、引發(fā)劑的摩爾比為10:10:1；均聚物的合成步驟具體為：稱取[化學式2]單體化合物，加入引發(fā)劑和催化劑，在手套箱內進行開環(huán)聚合反應，形成均聚物，其中，[化學式2]單體化合物與引發(fā)劑的摩爾比為40:1。

優(yōu)選的是，其中，所述s2步驟中，環(huán)外的α,β-不飽和δ-戊內酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇的摩爾比為1:1，催化劑為三丁基膦，溶劑為二氯甲烷。

優(yōu)選的是，其中，引發(fā)劑為卞醇，催化劑為1,5,7-三氮雜二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯。

本發(fā)明的目的還可以進一步由基于δ-戊內酯的聚合物在非病毒基因載體中的應用來實現(xiàn)。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

1、提供不同的基于δ-戊內酯的聚合物，可以有效凝聚dna，并利用靜電作用與dna形成合適大小的納米顆粒通過內吞作用進入細胞中；

2、以基于δ-戊內酯的聚合物作為基因載體細胞毒性較低，表現(xiàn)出很好的轉染效果，有些甚至超過商品化的pei25k，這為聚酯類作為基因載體的進一步研究做了很好的鋪墊；

3、基于δ-戊內酯的聚合物的制備方法簡單、成熟、易于掌控；

4、基于δ-戊內酯的聚合物與細胞具有好的相容性，具有作為基因治療中非病毒載體的潛力；

5、基于δ-戊內酯的聚合物能全部包裹dna，可作為dna跨膜、轉運的良好載體；

6、基于δ-戊內酯的聚合物與dna凝聚后的粒徑，與dna形成100-250nm大小的顆粒，這對成功穿入細胞膜實現(xiàn)基因轉染具有重要的意義；

7、基于δ-戊內酯的聚合物在一定條件下可以降解，這為可降解的聚合物作為非病毒基因載體的研究提供了一個平臺。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；

圖2為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；

圖3為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；

圖4為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物與質粒dna的復合物在a549、hek293t、hela與hepg2細胞中細胞毒性圖；

圖5為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；

圖6為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；

圖7為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物與質粒dna的復合物在a549、hek293t、hela與hepg2細胞中的熒光素酶報告基因轉染實驗圖；

圖8為本發(fā)明的基于δ-戊內酯的聚合物用hcl處理降解前后的分子量測定圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

<實例1>

一種基于δ-戊內酯的聚合物，其特征在于，所述基于δ-戊內酯的聚合物具有下面顯示的[化學式1]中的結構：

[化學式1]

其中，r2為和中的一種，n大于或等于1，m大或等于0。n和m是根據(jù)兩部分的比例的變化而變化的。

[化學式1]聚合物具體合成路線為：

其中，[化學式2]化合物為合成路線中的化合物1，[化學式3]化合物中，a為2，6，10或14分別對應的合成路線中的化合物為2，3，4，5；

得到的基于δ-戊內酯的聚合物的數(shù)均分子質量處于2,000-10,000范圍內，結構末端是羥基。

具體合成步驟如下：

步驟一、按摩爾比為1:1稱取環(huán)外的α,β-不飽和δ-戊內酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入四氫呋喃溶劑，在氬氣氛圍下反應。反應后減壓濃縮干，用微量蒸餾儀減壓蒸餾，得到化合物1；

步驟二、按比例分別稱取環(huán)外的α,β-不飽和δ-戊內酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇、催化劑，加入溶劑溶解，在氬氣氛圍下反應8-10h，反應結束后，減壓濃縮，硅膠柱層析分離得到化合物2-5，其中，環(huán)外的α,β-不飽和δ-戊內酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇的摩爾比為1:1，催化劑為三丁基膦，溶劑為二氯甲烷，硅膠柱層析所用洗脫劑分別為石油醚/乙酸乙酯比例20/1、6/1、15/1、6/1；

步驟三、稱取化合物1，加入一定量的引發(fā)劑和催化劑，在手套箱內進行開環(huán)聚合反應，待轉化率達到80％以上后，再分別按比例加入化合物2-5，形成基于δ-戊內酯的嵌段聚合物b1-b6，對于b1-b4，加入的兩種單體與引發(fā)劑的比例(化合物1/化合物2-5/引發(fā)劑)為20:20:1，對于b5-b6，加入的兩種單體與引發(fā)劑的比例(化合物1/化合物3-4/引發(fā)劑)為20:30:1，其中，催化劑用量為單體摩爾量的1/20；

步驟四、分別稱取化合物1和不同比例的化合物2-5，加入一定量的引發(fā)劑和催化劑，在手套箱內進行開環(huán)聚合反應，形成基于δ-戊內酯的無規(guī)共聚物c1-c4，加入的兩種單體與引發(fā)劑的比例(化合物1/化合物2-5/引發(fā)劑)為10:10:1；

驟五：僅有化合物1，加入一定量引發(fā)劑和催化劑，在手套箱內進行開環(huán)聚合反應，形成基于δ-戊內酯的均聚物p1，單體與引發(fā)劑的比例為40:1。

其中，在所述步驟三、四和五中，開環(huán)聚合反應所用引發(fā)劑卞醇，所用催化劑為1,5,7-三氮雜二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(tbd)，催化劑用量為單體摩爾量的1/20；

其中，在所述步驟三、四和五中，開環(huán)聚合反應結束后，用乙酸/二氯甲烷溶液進行淬滅，攪拌5min；

其中，在所述步驟三、四和五中，開環(huán)聚合反應結束后，得到的聚合物用乙醇進行滲析，將產物溶于10ml乙醇中，置于1000da透析袋中，用乙醇透析1天。得到無色油狀液體聚酯。

其中化合物表征如下：

化合物1：ft-ir(kbr,cm^-1):2942(s),2858(m),2816(m),2765(s),1750(vs),1461(m),1258(m),1246(m),1152(s),1077(m),964(m).¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.33(m,2h),3.08(m,1h),2.72(m,2h),2.59(m,2h),2.40(m,2h),2.26(m,6h),1.93(m,2h),1.80(m,2h),1.71(m,2h).¹³cnmr(cdcl3,101mhz):δ173.01,77.44,77.13,76.81,68.74,58.27,45.21,40.46,33.77,30.86,27.42,24.21,22.01.esi-ms:m/zc11h22no2s[m+h]⁺,calcd.231.13,found232.13.產率84％。

化合物2：產率58％.ft-ir(kbr,cm^-1):3329(w),2957(m),2930(m),2872(w),1732(s),1452(w),1246(m),1157(m).¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.34(m,2h),3.09(m,1h),2.77-2.63(m,2h),2.56(t,j＝7.3hz,2h),2.27(m,1h),1.92(m,2h),1.70(m,1h),1.57(m,2h),1.41(m,2h),0.92(t,j＝7.3hz,3h).¹³cnmr(cdcl3,101mhz):δ173.12,68.83,40.55,33.78,32.82,31.75,24.26,22.06,21.93,13.66.esi-ms:m/zc10h19o2s[m+h]⁺,calcd.202.10,found203.10.

化合物3：產率78％.ft-ir(kbr,cm^-1):3340(w),2957(m),2955(m),2926(m),2852(w),1737(m),1246(m),1149(w).¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.39-4.27(m,2h),3.08(t,j＝8.7hz,1h),2.71(m,2h),2.55(t,j＝7.5hz,2h),2.27(m,1h),1.93(m,2h),1.70(m,1h),1.58(m,2h),1.36(m,2h),1.28(m,8h),0.88(t,j＝6.5hz,3h).¹³cnmr(cdcl3,101mhz):δ173.11,68.83,40.56,33.81,33.18,31.80,29.69,29.18,28.85,24.27,22.64,22.07,14.09.esi-ms:m/zc14h27o2s[m+h]⁺,calcd.258.17,found259.18.

化合物4：產率82％.ft-ir(kbr,cm^-1):3308(w),2957(m),2916(m),2850(w),1741(w),1666(w),1361(w),1149(w),1078(w).¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.34(m,2h),3.09(m,1h),2.76-2.62(m,2h),2.55(t,j＝7.3hz,2h),2.27(m,1h),2.03-1.81(m,2h),1.77-1.61(m,1h),1.58(m,2h),1.41-1.30(m,2h),1.26(m,14h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³c-nmr(cdcl3,100mhz):δ173.12,68.83,40.57,33.82,33.19,31.92,29.71,29.65,29.63,29.60,29.53,29.23,28.86,24.28,22.69,22.08,14.12.esi-ms:m/zc18h35o2s[m+h]⁺,calcd.314.23,found315.22.

化合物5：產率84％.ft-ir(kbr,cm^-1):3333(w),2955(w),2920(s),2848(m),1709(m),1467(w),1159(w),1062(w),960(w).¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ4.33(m,2h),3.08(m,1h),2.70(m,2h),2.54(t,j＝7.4hz,2h),2.27(m,1h),1.98(m,j＝7.4hz,2h),1.69(m,1h),1.58(m,2h),1.37(m,2h),1.25(m,24h),0.88(t,j＝6.3hz,3h).¹³cnmr(cdcl3,101mhz):δ173.11,68.83,40.57,33.82,33.19,31.93,29.70,29.69,29.68,29.66,29.61,29.54,29.37,29.24,28.87,24.29,22.70,22.09,14.13.esi-ms:m/zc22h43o2s[m+h]⁺,calcd.370.29,found371.29.

<實例2>

分別配制不同濃度聚合物(b1-b6、c1-c4、p1)的溶液，將不同濃度的聚合物的溶液和pgl-3質粒dna(9μg/ml)置于37℃水浴中，作用1h，進行dna瓊脂糖凝膠阻滯實驗得到不同濃度的聚合物(b1-b6、c1-c4、p1)對pgl-3dna的凝膠阻滯結果。

圖1a～1k分別是本發(fā)明聚合物b1-b6、c1-c4、p1的pgl-3dna的瓊脂糖凝膠阻滯實驗結果；其中，圖1a為本發(fā)明實施例1中聚合物b1對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1b為本發(fā)明實施例1中聚合物b2對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1c為本發(fā)明實施例1中聚合物b3對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1d為本發(fā)明實施例1中聚合物b4對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1e為本發(fā)明實施例1中聚合物b5對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1f為本發(fā)明實施例1中聚合物b6對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1g為本發(fā)明實施例1中聚合物c1對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1h為本發(fā)明實施例1中聚合物c2對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1i為本發(fā)明實施例1中聚合物c3對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1j為本發(fā)明實施例1中聚合物c4對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1k為本發(fā)明實施例1中聚合物p1對pgl-3的瓊脂糖凝膠阻滯實驗圖；圖1a～1k表明聚合物b1-b6、c1-c4、p1均可在較低質量比下完全阻滯dna在瓊脂糖中遷移；聚合物b1-b6、c1-c4、p1的最低阻滯的聚合物/dna質量比分別為：4、4、3、5、5、4、6、5、5、5和2。

從圖1可以得出，本發(fā)明制備的基于δ-戊內酯的聚合物在水中可以有效凝聚dna形成納米顆粒，可以作為非病毒基因載體。

<實例3>

別配制不同濃度聚合物(b1-b6、c1-c4、p1)的溶液，將不同濃度的聚合物的溶液和pgl-3質粒dna(9μg/ml)置于37℃水浴中，作用1h，進行動態(tài)激光光散射技術研究，我們研究了聚合物與dna凝聚后的粒徑。

圖2a～2k分別是本發(fā)明聚合物b1-b6、c1-c4、p1的pgl-3dna的動態(tài)光散射實驗結果；圖2a為本發(fā)明所述聚合物b1與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2b為本發(fā)明所述聚合物b2與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2c為本發(fā)明所述聚合物b3與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2d為本發(fā)明所述聚合物b4與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2e為本發(fā)明所述聚合物b5與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2f位本發(fā)明所述聚合物b6與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2g為本發(fā)明所述聚合物c1與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2h為本發(fā)明所述聚合物c2與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2i為本發(fā)明所述聚合物c3與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2j為本發(fā)明所述聚合物c4與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖；圖2k為本發(fā)明所述聚合物p1與質粒dna的復合物的動態(tài)光散射粒徑圖。

結果表明聚合物均可與dna形成100-200nm大小的顆粒，說明復合物比較容易進入細胞。

<實例4>

別配制不同濃度聚合物(b1-b6、c1-c4、p1)的溶液，將不同濃度的聚合物的溶液和pgl-3質粒dna(9μg/ml)置于37℃水浴中，作用1h，進行掃描電鏡實驗，直接把轉聚合物與dna的復合物滴加到硅片上，室溫自然晾干。

圖3a～3k分別是本發(fā)明聚合物b1-b6、c1-c4、p1的pgl-3dna的掃描電子顯微鏡實驗結果；圖3a為本發(fā)明所述聚合物b1與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3b為本發(fā)明所述聚合物b2與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3c為本發(fā)明所述聚合物b3與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3d為本發(fā)明所述聚合物b4與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3e為本發(fā)明所述聚合物b5與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3f位本發(fā)明所述聚合物b6與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3g為本發(fā)明所述聚合物c1與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3h為本發(fā)明所述聚合物c2與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3i為本發(fā)明所述聚合物c3與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3j為本發(fā)明所述聚合物c4與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖；圖3k為本發(fā)明所述聚合物p1與質粒dna的復合物的掃描電子顯微鏡圖。

結果表明聚合物均可與dna形成100-200nm大小的顆粒，說明復合物比較容易進入細胞。

<實例5>

配制不同濃度的聚合物溶液，加入培養(yǎng)24h的hek293t、hela、a549和hepg2細胞，采用不含聚合物的dmem培養(yǎng)基作為空白對照，采用商業(yè)化pei25k作為陽性對照。4小時后將所有培養(yǎng)基吸出，向其中每孔加入200μl含10％fbs的dmem，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，向每孔加入10μlmtt溶液，4小時后吸出所有加入液，生成的紫藍色結晶用150μldmso溶解，于搖床上震蕩10分鐘后用酶標儀測定每一孔在490nm處的吸光度值。按如下公式計算細胞存活率(％)＝[a490test-空白]/[a490control-空白]×100。

如圖4所示，圖4a為不同濃度的聚合物b1-b6、c1-c4、p1以及參照pei25k與質粒dna的復合物在a549細胞中測定的細胞毒性；圖4b為不同濃度的聚合物b1-b6、c1-c4、p1以及參照pei25k與質粒dna的復合物在hek293t細胞中測定的細胞毒性，圖4c為不同濃度的聚合物b1-b6、c1-c4、p1以及參照pei25k與質粒dna的復合物在hela細胞中測定的細胞毒性，圖4d為不同濃度的聚合物b1-b6、c1-c4、p1以及參照pei25k與質粒dna的復合物在hepg2細胞中測定的細胞毒性；經(jīng)過在hek293t、hela、a549和hepg2細胞中測定上述十一種聚合物的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)細胞毒性都比較低，尤其是都比pei25k的低。在hepg2細胞中，聚合物濃度為20μg/ml的時候，細胞的成活率都在70％左右。總體呈現(xiàn)的規(guī)律是：隨著聚合物濃度的增加，細胞死亡數(shù)目增加，這是由于聚合物氮原子可以增加細胞毒性；因此為了達到細胞毒性小并且轉染率高的目的，選擇比較合適的濃度相當重要。

<實例6>

hek293t細胞對聚合物b1-b6、c1-c4、p1凝聚的dna的納米顆粒的攝取實驗

將聚合物與dna按照質量比為5:1配制，其中dna的濃度為1μg/ml，配好的溶液與hek293t細胞作用30min，對細胞進行共聚焦顯影得到相應的細胞顯像圖；聚合物b1-b6、c1-c4、p1的細胞顯像如圖5a～5k；圖5a為本發(fā)明所述聚合物b1與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5b為本發(fā)明所述聚合物b2與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5c為本發(fā)明所述聚合物b3與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5d為本發(fā)明所述聚合物b4與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5e為本發(fā)明所述聚合物b5與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5f位本發(fā)明所述聚合物b6與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5g為本發(fā)明所述聚合物c1與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5h為本發(fā)明所述聚合物c2與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5i為本發(fā)明所述聚合物c3與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5j為本發(fā)明所述聚合物c4與質粒dna的復合物的細胞攝取圖；圖5k為本發(fā)明所述聚合物p1與質粒dna的復合物的細胞攝取圖。

由圖5a～5k表明，聚合物與dna的凝聚顆?？梢员患毎行z取，是優(yōu)良的非病毒基因載體材料；

<實例7>

將聚合物與pegfp按照質量比為5:1配制，其中pegfp的濃度為1μg/ml，配好的溶液在37℃條件下作用30min，加入到hek293t細胞中培養(yǎng)4h，然后將hek293t細胞的培養(yǎng)液換成新鮮的含有10％fbs的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)24h；用1mlpbs將hek293t細胞洗滌五次后，將細胞置于共聚焦顯微鏡下進行拍照(10倍放大)；

對商業(yè)轉染試劑pei25k的綠色熒光蛋白表達圖采用上述同樣的實驗方法，作為效果對照組；

圖6a～6k為聚合物b1-b6、c1-c4、p1的綠色熒光蛋白表達圖；圖6l為商業(yè)轉染試劑pei25k的綠色熒光蛋白表達圖；圖6a為本發(fā)明所述聚合物b1本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6b為本發(fā)明所述聚合物b2本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6c為本發(fā)明所述聚合物b3本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6d為本發(fā)明所述聚合物b4本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6e為本發(fā)明所述聚合物b5本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6f為本發(fā)明所述聚合物b6本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6g為本發(fā)明所述聚合物c1本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6h為本發(fā)明所述聚合物c2本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6i為本發(fā)明所述聚合物c3本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6j為本發(fā)明所述聚合物c4本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6k為本發(fā)明所述聚合物p1本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖；圖6l為本發(fā)明pei25k本身轉染pegfp-n1基因的綠色熒光蛋白表達圖。

由圖6a～6k可以看出，聚合物b1-b6、c1-c4、p1都觀察到了綠色熒光蛋白的表達；表明本發(fā)明公開的聚合物可以作為優(yōu)良的非病毒基因載體；另外，分析結果可以看出，聚合物b1和聚合物b5的轉染效果比其他聚合物較好，p1的最差。

<實例8>

將聚合物b1-b6、c1-c4、p1與pgl-3質粒dna(dna的濃度為1μg/ml)按照不同質量比在37℃條件下，作用30min后，加入到hepg2、hela、a549和hek293t細胞中培養(yǎng)4h；然后將細胞的培養(yǎng)液換成新鮮的含有10％fbs的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)24h；除去培養(yǎng)基后，加入20μl細胞裂解液將細胞裂解細胞，再分別測定相對發(fā)光強度和蛋白含量，最終以每毫克蛋白的相對發(fā)光強度(rlu/mgprotein)表示聚合物b1-b6、c1-c4、p1對pgl-3的轉染效率。

圖7a～7d是本發(fā)明聚合物b1-b6、c1-c4、p1作為非病毒基因載體，在與dna的最佳質量比下，在不同細胞中的熒光素酶表達結果；以商業(yè)化轉染試劑pei25k為參照。圖7a為本發(fā)明所述聚合物與質粒dna的復合物在a549細胞中的熒光素酶報告基因轉染實驗圖；圖7b為本發(fā)明所述聚合物與質粒dna的復合物在hek293t細胞中的熒光素酶報告基因轉染實驗圖；圖7c為本發(fā)明所述聚合物與質粒dna的復合物在hela細胞中的熒光素酶報告基因轉染實驗圖；圖7d為本發(fā)明所述聚合物與質粒dna的復合物在hepg2細胞中的熒光素酶報告基因轉染實驗圖。

圖中x軸表示不同的聚合物b1-b6、c1-c4、p1，在整個圖中由左到右，條形柱對應的x軸分別表示pei25k、b1-b6、c1-c4、p1；y軸表示熒光素酶表達量。

(1)結果表明在hek293t細胞中，聚合物b1-b6、c1-c4、p1的最佳轉染效率分別是pei25k的78％，84％，85％、11％、220％、47％、88％、9.4％、96％、1.1％和0.67％，如圖7b。

(2)其中，在hela細胞中，聚合物b5的轉染效率也是最高的，可以達到pei25k的1.5倍，如圖7c。

(3)在hek293t細胞和hela細胞中，含有短脂肪鏈的嵌段聚合物比含有長脂肪鏈的嵌段聚合物轉染效果好，而且嵌段聚合物的轉染效果比無規(guī)共聚物的好，均聚物的轉染效果最差。

(4)聚合物在不同細胞中的轉染效果也不一樣；在hek293t細胞中轉染效果最好，其次是hela，接著是a549和hepg2細胞，如圖7a為聚合物b1-b6、c1-c4、p1作為非病毒基因載體在a549細胞轉染效果圖，如圖7d為聚合物b1-b6、c1-c4、p1作為非病毒基因載體在hepg2細胞中的轉染效果圖。

<實例9>

將聚合物b5在hcl存在條件下，搖床上搖24h，對降解前后的聚合物進行凝膠滲透色譜檢測分子量，見圖8，hcl處理后b5的分子量明顯變小，說明聚合物很容易降解。這對其作為非病毒基因載體非常有意義，因為聚合物容易降解，可以提高生物相容性、減小毒性。

綜上所述，本發(fā)明提供的基于δ-戊內酯的聚合物及其制備方法與應用，本發(fā)明基于δ-戊內酯的聚合物可作為可降解的聚酯類非病毒基因載體在基因轉染中應用，聚合物是基于含有胺官能團和不同長度脂肪鏈的δ-戊內酯，通過開環(huán)聚合形成不同的嵌段共聚物、無規(guī)共聚物和均聚物，可以有效凝聚dna形成納米顆粒，并進入細胞進行基因轉染。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域。對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。