本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及抗病毒化合物及其制備方法與應用。

背景技術：

病毒是嚴重危害人類健康的病原體，有一半以上的傳染性疾病均由病毒引起。近年來，高致病、高傳染性病毒在世界范圍內的流行傳播，已引起全球人民對于病毒性疾病前所未有的關注。甲型流感病毒是a型流感病毒，例如攜帶有h1n1亞型豬流感病毒毒株，包含有禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征，是人類的易感病毒。病毒進入機體后需在宿主細胞內進行復制和繁殖，因此，能抑制病毒繁殖的藥物對宿主細胞或機體有不同程度的損害，使得抗病毒藥的發(fā)展一直較為緩慢。目前，抗病毒藥物按結構可以分為核苷類藥物如阿昔洛韋，三胺類藥物如金剛烷胺，焦磷酸類如膦甲酸鈉；神經(jīng)氨酸酶抑制劑如奧司他韋；蛋白酶抑制劑如沙喹那韋以及其他類如甘草甜素等。目前至少有50種抗病毒藥物用于臨床防治多種病毒感染。眾所周知，病毒變異極快，往往一種藥物使用不久就會出現(xiàn)相應的耐藥毒株，因此，積極開發(fā)具有高效、低毒的抗病毒藥物意義重大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種化合物。

所述化合物由鼠尾草屬中藥丹參salviamiltiorrhizabunge中的主要成分隱丹參酮通過微生物轉化獲得，為新化合物；所述化合物可由其羥基位置的區(qū)別而分別命名為1和2。

所述化合物1結構式如下述式i所示：

所述化合物2的結構式如下述式ⅱ所示：

本發(fā)明所提供的化合物可通過包括下述步驟的方法制備得到：以魯氏毛霉(mucorroxianus)cgmcc3.3447為轉化菌株，對隱丹參酮進行微生物轉化，得到化合物。

所述微生物轉化為：將魯氏毛霉(mucorroxianus)cgmcc3.3447種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基室溫下培養(yǎng)3天-4天，然后加入隱丹參酮室溫下發(fā)酵培養(yǎng)5天-7天(如5天)，得到發(fā)酵液。

所述魯氏毛霉(mucorroxianus)cgmcc3.3447種子液為將魯氏毛霉(mucorroxianus)cgmcc3.3447接種于斜面培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)，得到斜面菌種；再將所述斜面菌種接種到種子培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)后得到的魯氏毛霉(mucorroxianus)cgmcc3.3447種子液。

上述方法還包括從所述發(fā)酵液中分離得到化合物1和2的步驟。具體操作如下：將所述發(fā)酵液過濾后收集濾液，將所述濾液用有機溶劑(如乙酸乙酯)萃取后濃縮得到濃縮物，將所述濃縮物依次通過中壓柱層析、反相高效液相色譜法進行分離，得到化合物1和2。

在本發(fā)明中，所述中壓柱層析為：將所述濃縮物進行中壓柱層析分離，以乙腈的體積百分含量為10％-80％的乙腈水溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集體積百分含量為50％-60％的乙腈水溶液的洗脫組分，除去所述組分中的溶劑，濃縮得到濃縮液，其中，梯度洗脫的梯度程序為從0min到90min，乙腈水溶液中乙腈的體積百分含量從10％到80％。

所述反相高效液相色譜法為：將上述經(jīng)中壓柱層析得到的濃縮液進行反相高效液相色譜法分離，其中，所述反相高效液相色譜法的條件為：agilentzorbaxsb-c8250×9.4mm反相色譜柱，檢測波長210nm，流動相為體積百分含量為45％的乙腈水溶液，等度洗脫，依次收集在210nm波長處出現(xiàn)吸收峰時對應的洗脫組分，得到化合物1和2。

經(jīng)紫外光譜、質譜、核磁共振譜、cd譜,檢測其結構正確。實驗證明本發(fā)明提供的化合物結構全新，具有很好的抗病毒活性，適宜于抗病毒活性先導化合物的研究或制備抗病毒藥物

本發(fā)明的另一個目的是提供上述化合物的用途。

本發(fā)明所提供的化合物的用途是其在制備抗病毒藥物中的應用。

所述病毒具體可為流感病毒。

所述流感病毒具體可為甲型流感病毒。

所述甲型流感病毒具體可為甲型h1n1流感病毒。

包含上述化合物的抗病毒藥物也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述抗病毒藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學介導的方法導入機體如肌肉、皮內、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質混合或包裹后導入機體。

需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。

包含上述化合物的抗病毒藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。

本發(fā)明提供的化合物結構全新，具有很好的抗病毒活性，適宜于抗病毒活性先導化合物的研究或制備抗病毒藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述化合物1的紫外圖譜。

圖2為本發(fā)明所述化合物2的紫外圖譜。

圖3為本發(fā)明所述化合物1的高分辨質譜圖。

圖4為本發(fā)明所述化合物2的高分辨質譜圖。

圖5為本發(fā)明所述化合物1溶于dmso-d6中的¹h-nmr譜圖。

圖6為本發(fā)明所述化合物2溶于dmso-d6中的¹h-nmr譜圖。

圖7為本發(fā)明所述化合物1溶于dmso-d6中的¹³c-nmr譜圖。

圖8為本發(fā)明所述化合物2溶于dmso-d6中的¹³c-nmr譜圖。

圖9為本發(fā)明所述化合物1溶于dmso-d6中的¹h-¹hcosy譜。

圖10為本發(fā)明所述化合物2溶于dmso-d6中的¹h-¹hcosy譜。

圖11為本發(fā)明所述化合物1溶于dmso-d6中的hsqc譜圖。

圖12為本發(fā)明所述化合物2溶于dmso-d6中的hsqc譜圖。

圖13為本發(fā)明所述化合物1溶于dmso-d6中的hmbc譜圖。

圖14為本發(fā)明所述化合物2溶于dmso-d6中的hmbc譜圖。

圖15為本發(fā)明所述化合物1的圓二色譜譜圖。

圖16為本發(fā)明所述化合物2的圓二色譜譜圖

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例使用的馬鈴薯購自普通市場。

葡萄糖購自國藥集團化學試劑有限公司，產品目錄號為k491390。

魯氏毛霉(mucorroxianus)保藏號為cgmcc3.3447。

隱丹參酮購自西安昊軒生物科技有限公司。

甲型h1n1流感病毒的293t-iav-luc重組單克隆細胞系：記載于“秦玉潔.矮地茶中抗流感病毒化合物的篩選及其機制研究.中國科學院微生物研究所，碩士論文，2015年”，方法如下：

1)質粒提取

挑取陽性克隆的轉化子接種至lb液體培養(yǎng)基中，以220rpm/min的轉速過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)后的菌液12，000rpm離心1min,棄上清；加入250μlbufferp1將菌液重懸；加入250μlbufferp2，上下顛倒混勻；加入350μlbufferp3上下顛倒混勻；將混勻后的液體12,000rpm離心10min；將上清加至已平衡過的qiagen-tip柱中，室溫孵育幾分鐘，12，000rpm離心1min；加入600μlbufferpe,12,000rpm離心1min；重復此步驟1次；將空管12,000rpm離心2min；室溫放置幾分鐘使酒精充分揮發(fā)；將柱子放入新的1.5ml離心管中，向柱子中加入60μlbuffereb，室溫靜置2min；12,000rpm離心兩分鐘；收集管中的液體，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)轉染

0.25％胰酶消化293t細胞1min，棄去胰酶加入6mldmem培養(yǎng)液，將細胞吹散。在6cm培養(yǎng)皿中加入相應數(shù)量的細胞，使第二天細胞的覆蓋率達80％，將細胞置于5％co2的細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；轉染前1h換新鮮培養(yǎng)基；吸取4μgprep4-iav-luc質粒加至l50mmol/lnacl使體積至200μl，混勻；吸取24μgpei加至l50mmol/lnacl使體積至200μl，混勻；將上兩步所得液體混均，室溫靜置15min，加至細胞中，置于5％co2的細胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；轉染6h后換液。

3)流感病毒包裝

將流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的除pa表達質粒外各1.5μg，pa表達質粒0.15μg共轉染10cm皿的293t細胞，轉染6h后換成含有2％血清的完全培養(yǎng)基。48h后收細胞。細胞凍融一次后過0.45μm濾膜，將病毒分裝并放于-80℃保存。

4)噬斑實驗

12孔板加入mdck細胞，使第二天細胞密度達到100％；將細胞用pbs洗兩遍加入dmem稀釋好的病毒液，同時加入tpck胰酶至終濃度2μg/ml；感染1h后吸棄病毒液，并用pbs洗兩遍，洗去未感染的病毒；加入1ml1％的低熔點瓊脂糖，同時加入tpck胰酶以及雙抗；4℃冰箱放置10min，待瓊脂糖凝固后，37℃倒置培養(yǎng)；培養(yǎng)3-5天待肉眼可見的噬斑出現(xiàn)，結晶紫染色后對其進行計數(shù)。

5)病毒感染

待感染細胞在37℃細胞培養(yǎng)箱中過夜，第二天細胞密度達到80％時，pbs將細胞洗兩遍；流感病毒用dmem稀釋后加到細胞上，感染細胞1h；pbs洗三次，加入含有10％血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

6)pei轉染3μgprep4-iav-luc質粒至3.5cm培養(yǎng)皿中的293t細胞，轉染6h后換液，用含10％(體積分數(shù))胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。轉染36h之后，將細胞按1:384的比例傳代至10cm細胞培養(yǎng)皿，24小時后更換新鮮培養(yǎng)基，并加入250μg/ml的潮霉素進行篩選，每隔2-3天換新鮮培養(yǎng)基，同時維持潮霉素的篩選壓力。兩周后從10cm細胞培養(yǎng)皿中挑取單克隆細胞至24孔板，擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中始終維持潮霉素壓力100μg/ml。最終獲得穩(wěn)定表達流感特異啟動子報告基因的單克隆細胞系，命名為293t-iav-luc。

實施例1、抗流感病毒化合物的制備和鑒定。

一、發(fā)酵制備抗流感病毒化合物

1、種子培養(yǎng)

(1)將斜面培養(yǎng)基在121℃下滅菌20min，制成斜面，于28℃恒溫培養(yǎng)3天。至表面水分稍干，無雜菌生長時，將魯氏毛霉(mucorroxianus)cgmcc3.3447菌種孢子接種于斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)3天，外觀為白色菌絲，菌絲豐滿，無染菌時即可收取使用，即得到斜面菌種。

上述斜面培養(yǎng)基由以下成分組成：馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂和水；

各成分在所述斜面培養(yǎng)基中濃度分別為(g/l)：馬鈴薯(去皮，切成小塊煮沸20min，紗布過濾)200g/l、葡萄糖20g/l、瓊脂20g/l，所述斜面培養(yǎng)基的ph值為自然ph，溶劑為水。

(2)在多個250ml玻璃瓶中分別裝入50ml種子培養(yǎng)基，加封口膜，于121℃下滅菌20分鐘，由斜面挖塊接種，所接菌種為上述步驟(1)制備的斜面菌種。于28℃在旋轉搖床旋轉培養(yǎng)(轉速為220rpm)48小時，得到種子液。

所述種子培養(yǎng)基由以下成分組成：馬鈴薯、葡萄糖和水；

各成分在所述種子培養(yǎng)基中濃度分別為：馬鈴薯200g/l(去皮，切成小塊煮沸20min，紗布過濾)、葡萄糖20g/l，所述種子培養(yǎng)基的ph值為自然ph，溶劑為水。

2、發(fā)酵培養(yǎng)

配制發(fā)酵培養(yǎng)基。在1000ml的三角瓶中分裝300ml發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后按照2％(體積百分比)的接種量將上述步驟1得到的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃旋轉培養(yǎng)(轉速為220rpm)3天后，毎瓶加底物隱丹參酮15mg，繼續(xù)于28℃旋轉培養(yǎng)(轉速為220rpm)5天，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液為容器內的所有物質。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成：馬鈴薯、葡萄糖和水；

各成分在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中濃度分別為：馬鈴薯200g/l(去皮，切成小塊煮沸20min，紗布過濾)、葡萄糖20g/l，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為自然ph，溶劑為水。

二、從發(fā)酵液中分離抗流感病毒化合物并鑒定

1、分離純化抗流感病毒化合物

將步驟一得到的發(fā)酵液過濾(采用4層紗布過濾)，收集濾液。將濾液用等體積乙酸乙酯(4l)萃取3次，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮蒸干，稱重，得到提取物。而后提取物進行ods(5μm)中壓柱層析(購自北京慧德易科技有限公司)，用乙腈-水體系10％-80％(乙腈的體積百分含量)梯度洗脫(梯度程序為從0min到90min，乙腈水溶液中乙腈的體積百分含量從10％到80％)，收集50％-60％的乙腈洗脫液(色譜峰集中出現(xiàn)在此區(qū)域)，濃縮后再經(jīng)反相高效液相色譜法分離，其中，反相hplc的條件為：agilentzorbaxsb-c8250×9.4mm反相色譜柱，檢測波長210nm，流動相為體積百分含量為45％的乙腈水溶液，等度洗脫，依次收集在210nm波長處出現(xiàn)吸收峰時對應的洗脫組分，得到化合物1和2。

2、鑒定化合物1和2

將上述步驟1分離純化得到的化合物1和2進行下述鑒定：

(1)外觀：化合物1，化合物2均為無定形白色粉末。

(2)溶解性：易溶于甲醇，丙酮，微溶于氯仿等低極性有機溶劑。

(3)紫外光譜：化合物1甲醇溶液的紫外光譜在204，241，290nm處有最大吸收峰。化合物2甲醇溶液的紫外光譜在209，241，297nm處有最大吸收峰。分別見圖1和圖2。紫外光譜測試儀器為marinersystem5304instrument。

(4)旋光值：化合物1，化合物2，旋光光譜測試儀器為nperkin-elmermodel343polarimeter，采用鈉光譜d線(589.3nm)測定，測定管長度1dm。

(5)高分辨質譜：圖3是化合物1的hresims質譜圖，顯示其[m+h]⁺峰為m/z331.1597，并提供最可能分子式為c19h23o5。圖4是化合物2的hresims質譜圖，顯示其[m+h]⁺峰為m/z329.1414，并提供最可能分子式為c19h21o5。hresims測試采用brukerapexⅲ7.0tspectrometer。甲醇為溶劑。

(6)核磁共振譜：化合物1和2的nmr測試采用bruker600mhz儀器(¹h500mhz；¹³c125mhz)，溶劑為dmso-d6(溶劑峰校正δh2.50/δc39.5)。圖5和圖6分別是化合物1和2的¹h-nmr譜圖。圖7是和圖8分別是化合物1和2的¹³c-nmr譜圖。根據(jù)化合物的¹h-nmr,¹³c-nmr，¹h-¹hcosy(圖9和圖10)，hsqc(圖11和12)，hmbc(圖13和14)和圓二色譜(圖15和16)，對兩化合物的核磁共振譜進行了研究并對¹³c信號進行了歸屬，見表1。并最終確定結構如下：

表1化合物1和2¹h-nmr和¹³c-nmr譜各峰歸屬

實施例2、化合物1和2的抗流感病毒測定

一、細胞毒性實驗

將293t-iav-luc細胞傳代至96孔板，每孔細胞數(shù)10,000；傳代14h后棄去培養(yǎng)基加入梯度稀釋后的化合物(濃度為40μm，進行二倍梯度稀釋5次，濃度依次為20μm、10μm、5μm、2.5μml、1.25μm)；培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)基，加入含終濃度0.5mg/ml的mtt培養(yǎng)基，37℃孵育4h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μldmso，避光搖床裂解10min，酶標儀檢測570nm處的吸光值。根據(jù)所得結果計算回歸曲線，計算cc50值。

二、抗流感病毒活性測定

將生長于10cm細胞培養(yǎng)皿的293t-iav-luc細胞均勻的鋪于96孔板上，每孔20,000個細胞，培養(yǎng)12h；吸取溶于dmso的化合物加入50μldmem使其濃度為20μmol/l，并吸取適量的dmso為陰性對照，10μg/ml的利巴韋林為陽性對照；以moi＝0.5計算所需病毒量，將病毒稀釋于dmem中；將稀釋好的病毒與稀釋好的化合物混勻；pbs清洗96孔板中的細胞兩次，加入混合后的液體；1h后換含有體積分數(shù)10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。細胞用pbs洗兩遍之后加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，細胞裂解30min后，每個樣品取10μl加至1.5ml離心管中，加入熒光素酶發(fā)光底物后用熒光素酶檢測儀檢測細胞中的熒光素酶報告基因的表達水平。

三、抗流感病毒活性和細胞毒性測定結果

化合物1，化合物2，隱丹參酮和陽性對照利巴韋林的測試結果見表2。

表2化合物的抗病毒活性

^a抑制率實驗中所有化合物的濃度為10μm

由表2可知：化合物1和2的抗病毒活性比隱丹參酮要強，且細胞毒性小。與陽性對照利巴韋林活性結果相當。