本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用微生物全細(xì)胞催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原兒茶酸(protocatechuicacid，pca)即3,4二羥基苯甲酸，是重要的中藥活性成分。國外已有報道天然花青素在豬腸道中轉(zhuǎn)化為小分子代謝物-原兒茶酸。原兒茶酸有許多藥理作用，主要為抗菌、抗腫瘤，預(yù)防哮喘，促進(jìn)大鼠皮層神經(jīng)元增值等藥理作用，臨床用于治療慢性氣管炎。原兒茶酸目前工業(yè)生產(chǎn)主要是由香草醛經(jīng)堿熔、酸化而得。這種化學(xué)合成工藝中酸堿物質(zhì)會造成一定環(huán)境污染壓力，也無法直接添加于食品生產(chǎn)。目前制備天然來源原兒茶酸主要來源是從中草藥葉莖中通過反復(fù)醇提和純化得到分粉末晶體。現(xiàn)有技術(shù)中對天然花青素微生物催化轉(zhuǎn)化原兒茶酸沒有一般適用方法。

花青素(anthocyanidin)是一類廣泛地存在于植物中的水溶性天然色素，屬于黃酮類化合物，是膳食中最豐富的多酚。其黃酮c6-c3-c6碳結(jié)構(gòu)上有多個酚羥基，具有顯著天然抗氧化和清除自由基等活性作用，顯示出獨特的藥理學(xué)功效是人們對花青素的關(guān)注重點。比如，研究表明紫甘薯提取的花青素具有明顯的抗氧化、抗突變、減輕肝功能障礙等生理功能?；ㄇ嗨刈鳛橐环N安全無毒的天然色素，對人體具有許多保健功能，已被應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。

在體內(nèi)腸道環(huán)境下花青素被腸道中的微生物種群利用，或被菌群分泌的酶系催化轉(zhuǎn)化生成小分子代謝產(chǎn)物如原兒茶酸。然而，其體內(nèi)轉(zhuǎn)化途徑和代謝機制仍不明確，目前構(gòu)建模擬腸道的模型研究代謝途徑仍具有一定復(fù)雜性。食品和植物來源的益生菌，除了具有公認(rèn)的增強免疫作用外，也擁有豐富的酶體系，為探究體外生物轉(zhuǎn)化花青素變成原兒茶酸提供了條件。專利cn201210364142介紹了一種將花色苷作為著色劑添加酸奶中發(fā)酵的方法，但沒有具體描述花色苷是否被轉(zhuǎn)化為其他組分如原兒茶酸。楊艷(《腸道益生菌生物轉(zhuǎn)化桑椹花青素與應(yīng)用研究》，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：60)報道了腸道微生物和四種益生菌對桑葚花青素的轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化過程在mrs培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基中復(fù)雜的碳源成分對花青素轉(zhuǎn)化的影響較大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用微生物全細(xì)胞催化天然花青素轉(zhuǎn)化制備原兒茶酸的方法。該方法以花青素為碳源，克服了現(xiàn)有化學(xué)合成和物理提取制備原兒茶酸技術(shù)上的產(chǎn)生污染壓力、無法直接添加于食品生產(chǎn)等問題，同時也有利于簡化后續(xù)的純化工序。該方法具有步驟簡便、底物專一、條件溫和的特點，在不引入其他化學(xué)與生物營養(yǎng)成分的前提下，可將催化花青素轉(zhuǎn)化為原兒茶酸(pca)。對體外研究微生物代謝轉(zhuǎn)化花青素的機制具有重要的意義，也對直接應(yīng)用益生菌轉(zhuǎn)化發(fā)酵含花青素食品提供一種理論依據(jù)。

本發(fā)明另一目的是提供上述用微生物全細(xì)胞催化天然花青素的方法轉(zhuǎn)化的原兒茶酸。

本發(fā)明再一目的是提供上述原兒茶酸的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種用微生物全細(xì)胞催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸的方法，包括以下具體步驟：

s1.在花青素提取物的培養(yǎng)基中接種微生物培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移微生物培養(yǎng)液至無菌離心管中，離心后棄盡上清，得沉淀為微生物菌體；

s2.加入磷酸鹽緩沖液到步驟s1的離心管中，重懸菌體沉淀，制成菌懸液；

s3.花青素提取物用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，將已除菌的花青素提取物添加到步驟s2的菌懸液中混合均勻，將菌懸液置于35～37℃靜置培養(yǎng)；

s4.將培養(yǎng)后的菌懸液離心后取出上清液，即為微生物催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸；

其中，所述的微生物為鼠李糖乳桿菌yyjp-2(l.rhamnosusyyjp-2)，該菌種于2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60115；或干酪乳桿菌kfl2(l.caseikfl2)，該菌種于2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60117)。

優(yōu)選地，步驟s1中所述的花青素提取物的培養(yǎng)基的配方為：花青素提取物1～10％、酪蛋白胨或胰蛋白胨或細(xì)菌蛋白胨8～12g/l、牛肉膏8～12g/l、酵母膏或酵母提取物3～5g/l、葡萄糖10～20g/l、吐溫801.0g/l、磷酸氫二鉀2.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、硫酸鎂0.2g/l和硫酸錳0.05g/l；所述培養(yǎng)基的ph為5.5～6.0，所述微生物培養(yǎng)的時間為18～24h，所述離心的速率為5000～8000rpm。

優(yōu)選地，步驟s2中所述的磷酸鹽緩沖液包括磷酸二氫鉀8.2～8.4g/l和磷酸氫二鉀0.7～0.9g/l，所述磷酸鹽緩沖液的ph為5.5～5.8；所述菌懸液的濃度>10⁵cfu/ml。

優(yōu)選地，步驟所s3中所述花青素提取物為紫薯淀粉、新鮮紫薯、紫甘藍(lán)、山竹殼、黑枸杞、桑葚的花青素原料的提取物。

上述花青素提取物的提取工藝為：配制40～80％乙醇溶液，加入濃hcl調(diào)節(jié)ph為3～4，再加入花青素原材料，花青素原材料和乙醇溶液的質(zhì)量比為1：(10～40)，在50～60℃條件下超聲波輔助提取30～120min，5000rpm離心10min，收集上清液，在壓力0.8～0.9mpa和溫度60℃條件下真空濃縮，即得到花青素提取物。

優(yōu)選地，步驟s3中所述的已除菌的花青素提取物與菌懸液的體積比為1:(10～100)。

優(yōu)選地，步驟s3中所述靜置培養(yǎng)的時間為12～48h。

優(yōu)選地，步驟s4中所述離心的速率為5000～10000rpm，所述離心的時間為10～15min。

上述微生物全細(xì)胞催化天然花青素的方法制備的原兒茶酸及其在益生菌發(fā)酵食品、添加天然色素的微生物發(fā)酵食和含原兒茶酸的特膳食品生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明是以弱酸性磷酸鹽緩沖液作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)，緩沖液的弱酸性有利于花青素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；同時弱酸性磷酸鹽緩沖液，提供微生物(特別是大部分益生菌)細(xì)胞穩(wěn)定的等滲環(huán)境而且不引入多余營養(yǎng)條件下；以益生菌完整細(xì)胞提供生物催化所需的酶系，以天然花青素提取濃縮液作為底物共同構(gòu)成生物轉(zhuǎn)化花青素體系。

全細(xì)胞催化是指利用完整的生物有機體(即全細(xì)胞、組織甚至個體)作為催化劑進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，本質(zhì)是利用細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行催化。全細(xì)胞催化是介于發(fā)酵法和提取酶催化法之間的一種生物催化技術(shù)。全細(xì)胞催化中各酶系保持原有狀態(tài)和位置，酶穩(wěn)定性好，更易實現(xiàn)能量和輔酶的原位再生；細(xì)胞內(nèi)可實現(xiàn)多酶體系的級聯(lián)反應(yīng)，彌補酶法催化中級聯(lián)催化過程不易實現(xiàn)，酶活半衰期短等不足，提高了催化效率，省去了酶純化過程，制備更加簡單，生產(chǎn)成本更低，環(huán)境壓力更小。本發(fā)明利用部分無毒可食用的微生物轉(zhuǎn)化天然色素花青素，產(chǎn)物安全具有一定抗氧化性，可直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，提高營養(yǎng)效益。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明采用益生菌在弱酸性磷酸鹽緩沖液條件下用全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化天然花青素并獲得原兒茶酸。弱酸性磷酸鹽緩沖體系，有利于花青素和菌體的性質(zhì)穩(wěn)定，提供了安全無毒的催化條件，并且緩沖體系只含有無機鹽，無其他營養(yǎng)成分對花青素轉(zhuǎn)化造成干擾。該方法步驟簡便，始終保證了天然色素的安全性和可食用性，可用于添加天然花青素的食品產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)。

2.本發(fā)明省略了催化酶的提取和酶活保護(hù)的步驟，更易實現(xiàn)多酶體系的高效催化。微生物在生物轉(zhuǎn)化前經(jīng)過篩選和誘導(dǎo)培養(yǎng)，更利于微生物對代謝酶的表達(dá)，提高了生物轉(zhuǎn)化率。

3.本發(fā)明以花青素為碳源，解決了現(xiàn)有化學(xué)合成和物理提取制備原兒茶酸技術(shù)上的產(chǎn)生污染壓力、無法直接添加于食品生產(chǎn)等問題，同時也有利于后續(xù)的純化工序。

附圖說明

圖1為實施例1中鼠李糖乳桿菌yyjp-2(gdmcc60115)菌種基因組指紋圖譜。

圖2為實施例2中鼠李糖乳桿菌yyjp-2(gdmcc60115)菌種基因組指紋圖譜。

圖3為實施例5中用鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosusyyjp-2)催化紫薯花青素轉(zhuǎn)化生成原兒茶酸的hplc圖。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

在實施例1-5中：

所述的高效液相色譜檢測條件為：進(jìn)樣20μl，波長245nm，流速1ml/min，流動相a：1％甲酸水。流動相b：乙腈。洗脫方法：0～4mina相保持95％；4～16mina相95％降到88％；16～30mina相保持70％；30～35mina相從70％升到95％。

所述總花青素初始濃度的測試采用ph示差法。

實施例1鼠李糖乳桿菌yyjp-2的分離與鑒定

1.菌株分離

(1)鼠李糖乳桿菌yyjp-2(l.rhamnosusyyjp-2)是從傳統(tǒng)白酒發(fā)酵酒曲分離獲得。具體分離方法如下：以無菌蒸餾水充分震蕩酒曲得到懸濁液，采用倍比稀釋法將上述懸濁液稀釋成10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的樣液，涂布在mrs平板上培養(yǎng)，2d后挑去取單菌落平板劃線法純化兩次，斜面保藏菌種備用。

(2)上述分離得到鼠李糖乳桿菌yyjp-2(l.rhamnosusyyjp-2)屬于革蘭氏陽性菌，在mrs平板上具有大的、奶油白色、不透明、表面濕潤光滑的菌落，在mrs肉湯試管中產(chǎn)生大量粘稠糖類物質(zhì)，表現(xiàn)為豐富的胞外多糖。

2.菌株鑒定

提取上述分離的菌株基因組dna，通過常規(guī)pcr擴(kuò)增16srdna片段并測序分析，測序結(jié)果如seqidno：1所示。顯示其與鼠李糖乳桿菌同源99％以上相似，屬于lactobacillaceae科lactobacillus屬rhamnosus種。

同時，結(jié)合其他鑒定數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，該菌株為鼠李糖乳桿菌菌種的一個新菌株，將該菌株命名為鼠李糖乳桿菌yyjp-2(l.rhamnosusyyjp-2)，2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60115，地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。

rep-pcr指紋圖譜是一種揭示菌株和種屬遺傳差異和多樣性的分析技術(shù)。原理是利用特定的引物擴(kuò)增細(xì)菌基因組的進(jìn)化過程中高度保守的短重復(fù)序列，得到系列的特定譜帶，即細(xì)菌基因的指紋圖譜，對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和多態(tài)性研究。對上述分離的菌株基因組dna進(jìn)行rep-pcr擴(kuò)增得到鼠李糖乳桿菌yyjp-2(gdmcc60115)菌種基因組指紋圖譜如圖1所示。其中，鼠李糖乳桿菌yyjp-2基因指紋圖譜，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m(xù)為dnamarkeriii。從圖1中可知，李糖乳桿菌yyjp-2特有的box-pcr主條帶約9條，(gtg)5-pcr主條帶為8～10條，rep-pcr主條帶為7～10條，大小集中在0.3k～4kbp之間，由此指紋圖譜可對該鼠李糖乳桿菌yyjp-2進(jìn)一步鑒定和多態(tài)性研究。

實施例2干酪乳桿菌kfl2(l.caseikfl2)的分離與鑒定

1.菌株分離

(1)干酪乳桿菌kfl2(l.caseikfl2)是從傳統(tǒng)白酒發(fā)酵酒曲分離獲得。具體分離方法如下：以無菌蒸餾水充分震蕩酒曲得到懸濁液，采用倍比稀釋法將上述懸濁液稀釋成10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的樣液，涂布在mrs平板上培養(yǎng)，2d后挑去取單菌落平板劃線法純化兩次，斜面保藏菌種備用。

(2)上述分離得到干酪乳桿菌kfl2(l.caseikfl2)屬于革蘭氏陽性菌，在mrs平板上具有邊緣整齊、白色、不透明、表面光滑的菌落，稍有酸味。

2.菌株鑒定

提取上述分離的菌株基因組dna，通過常規(guī)pcr擴(kuò)增16srdna片段并測序分析，測序結(jié)果如seqidno：2所示，顯示其與干酪乳桿菌同源99％相似，lactobacillaceae科lactobacillus屬l.casei種。

同時，結(jié)合其他鑒定數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，該菌株為干酪乳桿菌菌種的一個新菌株，將該菌株命名為干酪乳桿菌kfl2(l.caseikfl2)，2016年11月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60117，地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。

對上述分離的菌株基因組dna進(jìn)行rep-pcr擴(kuò)增得到干酪乳桿菌kfl2(gdmcc60117)菌種基因組指紋圖譜如圖2所示。其中，泳道1為box-pcr譜帶；泳道2為(gtg)5-pcr譜帶；泳道3為rep-pcr譜帶；泳道m(xù)為dnamarkeriii。從圖2可知，干酪乳桿菌kfl2特有的box-pcr主條帶約4條，(gtg)5-pcr主條帶為10～12條，rep-pcr主條帶為10～13條，大小集中在0.3k～2.5kbp之間，由此指紋圖譜可對該干酪乳桿菌kfl2細(xì)菌進(jìn)一步鑒定和多態(tài)性研究。

實施例3

配制ph＝3的60％乙醇溶液1000ml，按料液比1：40加入紫薯淀粉25g，60℃條件下超聲波輔助熱提取120分鐘，10000rpm離心10分鐘，收集上清液在壓力0.9mpa、溫度55℃條件下真空濃縮即可得紫薯天然花青素濃縮液。

取紫薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長對數(shù)期的鼠李糖乳桿菌yyjp-2(l.rhamnosusyyjp-2，gdmcc60115)，轉(zhuǎn)移1ml菌液到10ml離心管，離心棄盡上清。用4.9ml的磷酸鹽緩沖液(ph＝5.8)重懸菌沉淀，加入0.1ml已用0.2μm微孔濾膜過膜的花青素濃縮液。37℃培養(yǎng)48h取出立即12000rpm離心后取1ml上清，即為微生物催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸。以ph示差法測總花青素初始濃度20.5mg/l，48h后濃度11.4mg/l，花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸的轉(zhuǎn)化率為44.3％。

實施例4

配制ph＝3的40％乙醇溶液100ml，按料液比1:10加入烘干的山竹殼10g，50℃條件下熱提取60分鐘，10000rpm離心10分鐘，收集上清液在壓力0.9mpa、溫度50℃條件下真空濃縮，即山竹殼天然花青素提取液。

取含山竹殼提取液的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長對數(shù)期的酪乳桿菌kfl2(l.caseikfl2)，轉(zhuǎn)移1ml菌液到10ml離心管，離心棄盡上清。用4.9ml的磷酸鹽緩沖液(ph＝5.8)重懸菌沉淀，加入0.1ml已用0.2μm微孔濾膜過膜的花青素濃縮液。37℃培養(yǎng)24h，取出立即12000rpm離心后取1ml上清液，即為微生物催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸。以ph示差法測總花青素，濃度初始濃度3.53mg/l，24h后濃度2.34mg/l，花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸的的轉(zhuǎn)化率為33.7％。

實施例5

按照上述實施例3中的方法制備天然花青素濃縮液備用。

取紫薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長對數(shù)期的鼠李糖乳桿菌yyjp-2(l.rhamnosusyyjp-2，gdmcc60115)，轉(zhuǎn)移1ml菌液到10ml離心管，離心棄盡上清液。用4.9ml的磷酸鹽緩沖液(ph＝5.8)重懸菌沉淀，加入0.1ml過膜的花青素濃縮液。ck空白對照組是無菌的4.9ml的磷酸鹽緩沖液(ph＝5.8)加入0.1ml已用0.2μm微孔濾膜過膜的花青素濃縮液。37℃培養(yǎng)48h。取出立即12000rpm離心后取1ml上清液，即為微生物催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸，過膜后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖3為實施例5中的鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosusyyjp-2)轉(zhuǎn)化紫薯花青素生成原兒茶酸的hplc圖。其中，(a)l.rhayyjp-2為鼠李糖乳桿菌yyjp-2株(l.rhamnosusyyjp-2)在48h產(chǎn)物中原兒茶酸的信號峰；(b)pca+ck為原兒茶酸標(biāo)品混空白對照；(c)ck為空白對照。原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品的信號峰和鼠李糖乳桿菌yyjp-2產(chǎn)物的信號峰對應(yīng)保留時間分別17.2min和16.9min，可知為原兒茶酸，根據(jù)峰面積計算l.rhayyjp-2催化紫薯花青素產(chǎn)原兒茶酸的含量為33mg/l。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種用微生物全細(xì)胞催化天然花青素轉(zhuǎn)化原兒茶酸的方法和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1433

<212>dna

<213>lactobacillus屬

<400>1

caccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccggg60

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<212>dna

<213>lactobacillus屬

<400>2

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