【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及制藥工程領(lǐng)域，特別涉及一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法。
背景技術(shù)：
苯烯莫德(benvitimod)是新一代二苯乙烯類抗炎藥物，用于治療多種重大免疫性疾病，如牛皮癬、濕疹、發(fā)膿性結(jié)腸炎和多種過敏性疾病。它被科技部列為“國家科技重大專項”，2016年12月，已經(jīng)提交了新藥上市申請(化藥1類)，用于治療皮膚病與牛皮癬。該化合物最初由welchembiotech公司研發(fā)，申請了專利us2003171429a1和us2005059733a1，后授權(quán)給施泰福(葛蘭素史克子公司)和天濟(jì)藥業(yè)。
苯烯莫德最初是一種來源于細(xì)菌(photohabdusluminescens)的天然產(chǎn)物，但目前，主要是通過有機(jī)合成的方法進(jìn)行制備，其中，主要是四種合成路線，分別是中國發(fā)明專利cn10153157b、cn104003848b、cn103265412a和cn103992212a。這些方法一般通過5-7步反應(yīng)，涉及溴化、甲基化、氧化、還原、脫甲基化和縮合等反應(yīng)。反應(yīng)過程中，常常是在高溫高壓、貴重金屬催化劑、有機(jī)溶劑條件下進(jìn)行，不適宜環(huán)保綠色的主題。另外，過多的反應(yīng)步驟、繁瑣的操作、產(chǎn)品收率偏低、產(chǎn)物選擇性差和反應(yīng)后產(chǎn)物純化操作復(fù)雜等問題也影響這些工藝的工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
鑒于上述有機(jī)合成方法制備苯烯莫德過程中的諸多問題，本發(fā)明目的在于提供一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，該技術(shù)創(chuàng)新性的模擬在生物體內(nèi)合成苯烯莫德的途徑，利用簡單的合成方法合成兩個中間體，然后利用生物酶stld和stlc為催化劑完成縮合和芳香化反應(yīng)，在水溶液和溫和的反應(yīng)條件下可高效催化合成苯烯莫德，具有高效、低成本的特點，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與0.5～5份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入500～1500份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在20～25℃下反應(yīng)2～4h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和0.5～5份n-乙酰基半胱胺放入500～1500份甲苯中，在75～85℃下反應(yīng)3～6h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與0.5～5份n-乙?；腚装贩湃敕磻?yīng)器中，加入500～1500份二氯乙烷，攪拌均勻，在20～25℃下反應(yīng)2～5h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.005～0.05份酮酶stld和0.005～0.05份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為6～9的緩沖液，攪拌均勻后，在20～55℃下反應(yīng)1～5h，得到反應(yīng)溶液；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
有機(jī)合成的方法按照以下路線進(jìn)行反應(yīng)：
在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說明，步驟(3)所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1。
在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說明，步驟(3)所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2。
本發(fā)明具有以下有益效果：
1.本發(fā)明所用的化學(xué)法和生物法相結(jié)合的工藝，能夠結(jié)合化學(xué)法和生物法的優(yōu)點，進(jìn)而制備高收率的苯烯莫德?；瘜W(xué)法是成熟的酯化反應(yīng)合成路線，反應(yīng)得率高，反應(yīng)步驟為1～2步，分離純化方便，避免了多步反應(yīng)的繁瑣和產(chǎn)率低等問題，生物酶法是選取高表達(dá)，易于純化的高活力酶，該酶具有高轉(zhuǎn)化率，適合工業(yè)化粗放條件等優(yōu)良特點。其中，關(guān)鍵的縮合步驟由生物酶完成。本發(fā)明能夠做到揚長避短，充分結(jié)合化學(xué)法和生物法的優(yōu)點，所制備的苯烯莫德的總收率明顯高于單純采用化學(xué)法或者生物法所制備的苯烯莫德的收率。
2.本發(fā)明所用的催化劑以綠色的生物催化劑為主，安全無毒性；反應(yīng)條件溫和，同時以水溶液作為溶劑，避免使用毒性高、易燃易爆的有機(jī)溶劑，是一種環(huán)境友好的工藝方法。
3.本發(fā)明所用酮酶stld，其在水溶液中穩(wěn)定性良好，具有催化效率高，轉(zhuǎn)化率高等生物催化劑特有特點。
4.本發(fā)明所用芳香化酶stlc，其在水溶液中穩(wěn)定性良好，具有催化效率高，轉(zhuǎn)化率高等生物催化劑特有特點。
【具體實施方式】
實施例1：
一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與0.5份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入500份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在20℃下反應(yīng)2h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和0.5份n-乙?；腚装贩湃?00份甲苯中，在75℃下反應(yīng)3h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與0.5份n-乙?；腚装贩湃敕磻?yīng)器中，加入500份二氯乙烷，攪拌均勻，在20℃下反應(yīng)2h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.05份酮酶stld和0.05份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為7.5的緩沖液，攪拌均勻后，在37℃下反應(yīng)2h，得到反應(yīng)溶液；所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1；所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
經(jīng)計算，本實施例中苯烯莫德的總收率為96.31％。
實施例2：
一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與1份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入800份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在22℃下反應(yīng)2.5h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和2份n-乙酰基半胱胺放入700份甲苯中，在78℃下反應(yīng)4h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與1份n-乙?；腚装贩湃敕磻?yīng)器中，加入750份二氯乙烷，攪拌均勻，在20℃下反應(yīng)2h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.01份酮酶stld和0.01份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為6的緩沖液，攪拌均勻后，在20℃下反應(yīng)1h，得到反應(yīng)溶液；所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1；所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
經(jīng)計算，本實施例中苯烯莫德的總收率為93.56％。
實施例3：
一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與2份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入900份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在24℃下反應(yīng)2.5h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和4份n-乙酰基半胱胺放入1000份甲苯中，在82℃下反應(yīng)4h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與3份n-乙酰基半胱胺放入反應(yīng)器中，加入850份二氯乙烷，攪拌均勻，在23℃下反應(yīng)4h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.005份酮酶stld和0.005份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為8的緩沖液，攪拌均勻后，在45℃下反應(yīng)1h，得到反應(yīng)溶液；所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1；所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
經(jīng)計算，本實施例中苯烯莫德的總收率為70.69％。
實施例4：
一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與3份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入1000份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在22℃下反應(yīng)3h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和1份n-乙?；腚装贩湃?200份甲苯中，在80℃下反應(yīng)5h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與1份n-乙酰基半胱胺放入反應(yīng)器中，加入1000份二氯乙烷，攪拌均勻，在21℃下反應(yīng)3h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.008份酮酶stld和0.008份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為6.5的緩沖液，攪拌均勻后，在30℃下反應(yīng)4h，得到反應(yīng)溶液；所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1；所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
經(jīng)計算，本實施例中苯烯莫德的總收率為90.23％。
實施例5：
一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與2份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入1100份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在22℃下反應(yīng)3.5h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和2份n-乙?；腚装贩湃?300份甲苯中，在77℃下反應(yīng)4h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與2份n-乙酰基半胱胺放入反應(yīng)器中，加入1500份二氯乙烷，攪拌均勻，在25℃下反應(yīng)3h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.02份酮酶stld和0.02份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為7.5的緩沖液，攪拌均勻后，在24℃下反應(yīng)1h，得到反應(yīng)溶液；所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1；所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
經(jīng)計算，本實施例中苯烯莫德的總收率為54.72％。
實施例6：
一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法，先以有機(jī)合成的方法合成中間體1和中間體2，再利用酮酶stld和芳香化酶stlc催化中間體1和中間體2，合成苯烯莫德；包括以下步驟：
(1)按照摩爾份數(shù)計，先將1份異戊酸與5份丙二酸亞異丙酯混合后放入反應(yīng)器中，加入1500份二氯乙烷，攪拌均勻，在n，n'-二環(huán)己基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶的催化作用下，在25℃下反應(yīng)4h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，并用硅膠柱分離出產(chǎn)物，接著將產(chǎn)物和5份n-乙?；腚装贩湃?500份甲苯中，在85℃下反應(yīng)6h，最后減壓蒸餾除去甲苯，并經(jīng)過硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體1；
(2)按照摩爾份數(shù)計，將1份(2e，4e)-5-苯基-2，4-戊二烯酸與5份n-乙?；腚装贩湃敕磻?yīng)器中，加入1200份二氯乙烷，攪拌均勻，在25℃下反應(yīng)5h，然后減壓蒸餾除去二氯乙烷，用硅膠柱分離后，放在tlc板上，在波長為256nm的紫外線照射下，析出的產(chǎn)物即為中間體2；
(3)按照摩爾分?jǐn)?shù)計，將1份中間體1、1份中間體2、0.03份酮酶stld和0.03份芳香化酶stlc放入反應(yīng)器中，加入ph值為9的緩沖液，攪拌均勻后，在55℃下反應(yīng)5h，得到反應(yīng)溶液；所述的酮酶stld為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的酮酶，氨基酸序列為sqeidno1；所述的芳香化酶stlc為一種來源于細(xì)菌photohabdusluminesces的芳香化酶，氨基酸序列為sqeidno2；
(4)將按體積比為1：1的乙酸乙酯萃取液和反應(yīng)溶液混合后，對反應(yīng)溶液進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，并用無水氯化鈣進(jìn)行干燥，經(jīng)過減壓蒸餾除去乙酸乙酯后，即得苯烯莫德。
經(jīng)計算，本實施例中苯烯莫德的總收率為42.15％。
上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細(xì)說明，但實施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。
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<110>廣西科學(xué)院
<120>一種利用化學(xué)酶法制備苯烯莫德的方法
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