專利名稱：在植物生產蛋白質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在植物中生產抗體以及其它復合蛋白質。
背景技術：
為了某些有利益的目的，重組DNA技術是以特定DNA片段修改生物體的基因構造所必須的技術。這項技術導致以微生物、細胞培養(yǎng)、植物及動物的工程學來生產可廣泛應用的有用產物。進行此項工程的重要之處在于以最經濟(與先前通過標準方法達到相同目的相比)的方式生產所需產物的能力。本質上，基因工程已擴大產物的價值，現(xiàn)今可通過最適合及最經濟的生產系統(tǒng)來生產產物。
雖然此項技術最初是在細菌系統(tǒng)中進行的，而現(xiàn)今于培養(yǎng)中可依照固定程序來改變多種生物體(包含各種微生物的真核細胞(酵母菌及其它真菌)、植物以及動物細胞)以及生產所有轉基因的植物及動物。于通過任何轉基因的方式來生產產物方面，仍需面對許多挑戰(zhàn)。盡管微生物系統(tǒng)往往在克隆及生產轉化細胞速度方面提供先進技術的優(yōu)點，但在自實驗室規(guī)模提升至大型發(fā)酵槽上經常遭遇到困難。此外，雖然細菌可有效地合成及分泌重組蛋白質及酶，但大體而言，細菌無機制去執(zhí)行所有所需的翻譯后修飾。某些真菌可生產經分泌的糖蛋白質類；然而，聚糖的型式及制造并不同于動物系統(tǒng)。
哺乳動物及昆蟲細胞培養(yǎng)已廣泛使用于生產各種蛋白質，最顯著進步可能是翻譯作用后程序。其它方面，培養(yǎng)基、設備及特殊培養(yǎng)環(huán)境使生產成本提高而此明顯地成為這些系統(tǒng)的缺點。與微生物培養(yǎng)的情形相似，由于由實驗室規(guī)模提升至大量制造時，往往無法直接進行翻譯作用，所以使大量制造成為顯著的問題。這些系統(tǒng)的另一缺點為考慮到培養(yǎng)病毒或病原性蛋白顆粒(prion)時，對人類健康具有潛在性的危險。
已說明利用轉基因動物可于牛乳中、分泌至尿中或通過鳥類的蛋來生產人類蛋白質。一般，仍有動物病毒及造成生物體疾病等潛在問題。此外，大量生產及維持生產族群(細菌或細胞群)的成本高且耗費時間。與動物細胞培養(yǎng)類似，轉基因動物應提供帶有需要的翻譯后修飾的蛋白質。
已討論過利用植物作為重組蛋白質表達系統(tǒng)或″生物反應器″的引人注目的方式來替代以細菌、酵母菌、昆蟲、動物及細胞為主的生產系統(tǒng)。于植物中生產蛋白質有許多好處且使用植物來生產轉基因的蛋白質正獲得廣泛的支持。
植物生產系統(tǒng)可容易予以純化而免于動物病原的污染。已存在多種植物種類的轉化方法。在許多種子植物及農作物的例子中，已存在收集及控制大量物質的方法及基礎設備。大量生產相當簡單且純粹地基于種子的生產及種植區(qū)域。因此，與通過哺乳動物細胞培養(yǎng)或轉基因動物生產類似物質的方法相比，以植物生產類似物質的方法具有實質上減少商品成本的優(yōu)點、降低哺乳動物的病毒或病原性蛋白顆粒污染的風險，以及相對低的原料及生產設備的資本需求。
一般，以植物生產所需的蛋白質的方法僅有一個顯著的缺點，即在于蛋白質于翻譯后糖化作用方面。然而，于許多例子中已證實，植物中替代的糖修飾作用對糖蛋白質不會造成有毒的作用或不需要的免疫基因特性。
已發(fā)展出許多在植物中表達蛋白質的生產系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包含于油體(oil bodies)上(Rooijen等人的Plant Physiology 1091353-1361(1995)；Liu等人的Molecular Breeding 3463-470(1997))、通過根分泌(rhizosecretion)(Borisjuk等人的Nature Biotechnology 17466-469(1999))、于種子中(Hood等人的Molecular Breeding 3291-306(1997)；Hood等人的In Chemicals via Higher Plant Bioengineering[由Shahidi等人編輯]Plenum Publishing Corp.pp 127-148(1999)；Kusnadi等人的Biotechnology and Bioengineering 56473-484(1997)；Kusnadi等人的Biotechnology and Bioengineering 6044-52(1998)；Kusnadi等人的Biotechnology Progress 14149-155(1998)；Witcher等人的MolecularBreeding 4301-312(1998))、以病毒表面的抗原決定部位(epitopes)(Verch等人的Journal of Virology 73930-938(1999)；Brennan等人的Microbiology 145211-220(1999))以及于馬鈴薯塊莖中穩(wěn)定的表達蛋白質(Arakawa等人的Transgenic Research 6403-413(1997)；Arakawa等人的Nature Biotechnology 16292-297(1998)；Tacket等人的Nature Medicine 4607-609(1998))。重組蛋白質亦可標記至種子、葉綠體或細胞外間隔上，以辨別可提供蛋白質累積最高程度的位置。
通常，所采用的可編碼出產物的DNA基礎功能片段包含啟動子、接著為蛋白質編碼區(qū)域以及終結基因。于任何生物體中，這些基礎的、單一的順反子(cistronic)(亦稱為″單順反子″)為表達基因的標準型式。根據(jù)核糖體掃描模型(典型為大多數(shù)真核生物的mRNA)，40S核糖體亞單位會結合至mRNA的5′-端且沿著非翻譯的5′序列移動直到40S核糖體亞單位到達AUG密碼子(Kozak，Adv.Virus Res.31229-292(1986)；Kozak，J.Mol.Biol.108229-241(1989))。雖然對大多數(shù)真核生物的mRNA而言，只有第一個開放閱讀框(，ORF)具有翻譯活性，但仍有其它不同的機制(mRNA具有多順反子功能(Kozak，Adv.Virus Res.31229-292(1986)))，不需以分離的啟動子控制各個編碼區(qū)域而可表達多數(shù)個編碼區(qū)域。
專利公開第WO98/54342號教示于植物中利用植物病毒驅動核糖體內進入位點(IRES)以同時表達期望的基因的方法。該公開案亦揭示煙草花葉病毒屬的IRES要件對3′近側基因表達(于植物、動物、人類以及酵母菌中，自雙順反子假想的mRNA轉錄)提供一種內翻譯途徑，且可將外來基因插入至IRES下游而表達。專利公開第WO 00/789085號描述利用基因構建中所設計的IRES片段以允許作物中多重作物保護特性(即除草劑抗藥性以及殺蟲毒素(Bt)的表達)的累積或表達可改變植物的代謝物的基因使植物生產聚羥基愛康酯(polyhydroxyalconates，PHA′s)，其可作為塑料的某種型式的前驅物。
發(fā)明概要本發(fā)明提供一種在植物中用以生產蛋白質的組成及方法，尤其是于自然狀態(tài)下的蛋白質為了成為具有生物活性的蛋白質，需要多數(shù)個結構基因來協(xié)同表達。典型地最終產物具有治療、診斷或產業(yè)上用途。
此外，本發(fā)明的一方面是針對重組核酸分子或表達單元，由5′至3′包含轉錄起始物及多個結構基因，并通過核糖體內結合序列(internalribosome binding sequence，IRES)分開各個重組核酸分子或表達單元。于一優(yōu)選具體實施例中，該轉錄起始物為植物細胞中具有功能的啟動子(其不必為植物中自然發(fā)現(xiàn)的啟動子)。該轉錄起始物可另外包括加強序列或其它調節(jié)要件以調整表達及/或特異性表達(例如提供轉錄作用的暫時性及/或空間性調節(jié))的程度。
結構基因以可編碼出多-亞單位蛋白質的亞單位為佳。本文中所使用的″多-亞單位蛋白質″系一種蛋白質，其含有多個分離的多肽或蛋白質鏈，彼此結合后可形成單一球狀蛋白質，其中至少兩個分離的多肽系由不同的基因所編碼。在另一優(yōu)選的觀點中，多-亞單位蛋白質至少包括一個抗體的免疫活性部分，因此可與抗原專一地結合。例如，該多-單元蛋白質可包括抗體分子的重鏈(heavy chains)及輕鏈(light chains)或部分重鏈及輕鏈。多重抗原結合部分可通過不同的結構基因而編碼出以產生多價抗體。
然而，任何多-亞單位蛋白質系包含于本發(fā)明的范疇中。多亞單位蛋白質的實例包含，但非限于異二聚或異多聚蛋白質，例如T細胞受體、MHC分子、免疫球蛋白家族的蛋白質、核酸結合蛋白質(例如復制因子、轉錄因子等)、酶、催化性抗體(abzymes)、受體(尤其是可溶性受體)、生長因子、細胞膜蛋白質、分化因子、似血紅素蛋白質、多聚激酶等。
于另一方面，該結構基因可編碼帶有同等功能的蛋白質復合物的成分，例如酶復合物、分化因子復合物、復制復合物等。
于一方面，本發(fā)明提供第一表達單元，包括于植物細胞中具有功能的轉錄起始物、可編碼出第一多-亞單位蛋白質(例如包括抗體分子的重鏈或輕鏈)中一個亞單位的結構基因以及可編碼出于植物中具有活性的選擇性標記的第一報導基因。亦可提供第二表達單元，其含有于植物細胞中具有功能的轉錄起始物、一或多個結構基因(其可編碼出第二多-亞單位蛋白質(例如抗體分子的重鏈或輕鏈)的其它亞單位)以及可編碼出不同于第一表達單元的選擇性標記且其于植物細胞中亦具有活性的第二報導基因。一或多個表達單元可包括復制源、原核生物源及真核生物源。例如可提供多重不同型式的真核生物源，使表達單元的復制作用可于一或多個植物細胞、哺乳動物細胞、酵母菌、昆蟲細胞等中進行。
于另一優(yōu)選具體實施例中，表達單元中的結構基因可編碼出一或多個蛋白質，其為將不成熟的蛋白質加工成具有成熟生物活性型式的蛋白質所需。例如，該結構基因可編碼出蛋白酶(其系通過切割蛋白質來加工不成熟蛋白質(例如前胰島素原)成為成熟型式蛋白質(胰島素)所需)。可以部分相同表達單元或部分不相同的表達單元提供可編碼出不成熟蛋白質的基因。
于又一優(yōu)選具體實施例中，該重組核酸分子或表達單元包含至少一個5′結構基因，其序列為可編碼出靶肽(例如轉移肽)的序列，該肽系指引基因的表達產物轉移至植物細胞內或細胞外某些位置。于一方面，各個結構基因(包括5′靶序列)系用以指引結構基因至所選擇的位置。該5′靶序列可相同或不同，例如基因產物的某些結合作用可靶至相同或不同位置。該重組核酸分子進一步包括可選擇性標記基因及/或多腺苷序列。優(yōu)選為該多腺苷序列系位于表達單元的3′端部分。
本發(fā)明的另一方面系針對于植物中生產蛋白質的方法，包括制備包括重組核酸分子的載體；將載體引入植物細胞中，以產生轉化植物細胞；以及選擇衍生自轉化植物細胞(可表達多數(shù)個編碼序列)的植物。于一優(yōu)選具體實施例中，表達的產物系標記至特定位置，例如細胞膜、細胞外間隔或細胞器，例如細質體(葉綠體)。于另一優(yōu)選具體實施例中，該植物細胞為阿拉伯芥(arabidopsis)細胞。亦提供經轉化的植物細胞、含有重組核酸分子的轉基因植物、包含由經轉化的植物細胞再生的植物、植物的一部分以及衍生自轉基因植物的種子。
本發(fā)明提供用于植物及植物細胞中可暫時或穩(wěn)定表達的基因構建，以及造成活性生物分子(非植物之內生性生產)的表達。
附圖描述參考以下詳細描述和附圖可以更好地理解本發(fā)明的目的與特征。


圖1是本發(fā)明核酸構建圖示；圖2是本發(fā)明核酸構建的圖示；圖3是來自煙草核酮糖-1，5二磷酸羧化酶小亞單位(GenBankACCESSION X023 53)的葉綠素靶肽；圖4表示植物鈣調蛋白的氨基末端部分與各種抗體基因的氨基末端區(qū)域比較的序列比較；圖5是pICP1176的質粒圖譜；圖6是pICP1221的質粒圖譜；圖7是pICP1177的質粒圖譜；圖8是pICGHpolyAb1的質粒圖譜；圖9是pICGHpolyAb4的質粒圖譜；圖10是Pxb1500的質粒圖譜。
圖11A和11B是本發(fā)明核酸構建在產生胰島素中的示意圖。
發(fā)明詳述依照本發(fā)明的各種基因構建系圖示地說明于第1及2圖中。第1圖說明DNA構成，其中啟動子會驅動一系列基因中的第一基因，各基因系由IRES要件將其分開。IRES序列會于經選擇的植物細胞中起始帽-獨立(cap-independent)翻譯作用。于一優(yōu)選具體實施例中，多腺苷信號系緊接的插入需要表達的最后一個基因序列的3′端以使轉錄出的mRNA可有效地加工。該DNA構成的轉錄作用可形成聚順反子mRNA。核糖體系獨立地結合至RNA的5′端以及各IRES要件上，使聚順反子mRNA中所有蛋白質可獨立但同等重要的表達。
第2圖說明本發(fā)明的另一具體實施例，其中，IRES要件系位于DNA構成的5′端，而不位于啟動子。如此使得DNA構成上的基因可利用一種通過宿主位點(該宿主位點是在轉化期間插入DNA構成的位點)的轉錄活性加以調節(jié)的方法而表達。于一相關的具體實施例中，該DNA構成包含一段可允許特定位置整合至先前所定義的染色體的位點的序列(該染色體的位點具有所需要的轉錄表達的能力)。因此，由第2圖所示的具體實施例中，基于基因位點(基因構建插入處)的轉錄作用的控制，利用5′IRES要件使基因表達。
植物的啟動子該啟動子可為結構性、組織特異性、發(fā)育調節(jié)或其它誘發(fā)性或抑制性調節(jié)基因，且所提供的啟動子于植物細胞中具有功能。大多數(shù)植物的啟動子(如前述)可引導基因表達(不論是結構性或其它形式調節(jié))。調節(jié)作用可基于暫時性、空間性或發(fā)育信號、環(huán)境的訊息或通過化學性誘導物或抑制物的手段來控制，以及這些制劑的來源可為自然或合成而來，即該啟動子可由自然的來源或由基因重組工程而得到。轉錄作用的起始區(qū)域包括啟動子以及一或多個添加的調節(jié)要件，例如增強子。啟動子亦可為嵌合的基因序列，即來自利用二或多個不同的自然或合成的啟動子的序列要件。
植物的啟動子可經選擇，以于不同的植物組織中通過熟習此技藝的人士所知悉的方法(Gasser & Fraley，Science 2441293-99(1989)來控制轉殖基因的表達。花椰菜鑲嵌病毒35S啟動子(CaMv)、經加強的CaMv啟動子的衍生物(Odell等人的Nature，3(13)810(1985))、肌動蛋白啟動子(McElroy等人的Plant Cell 2163-71(1990))、AdhI啟動子(Fromm等人的Bio/Technology 8833-39(1990)，Kyozuka等人的Mol.Gen.Genet.22840-48(1991))、泛素(ubiquitin)啟動子、玄參(Figwort)鑲嵌病毒啟動子、甘露堿(mannopine)合成酶啟動子、諾巴林(nopaline)合成酶啟動子以及章魚堿(octopine)合成酶啟動子及其衍生物等為熟知的基本的啟動子。經調節(jié)的啟動子系描述為光誘發(fā)(例如核酮糖雙磷酸羧基酶啟動子的小亞單位)、熱沖擊啟動子、硝酸鹽及其它化學性誘發(fā)啟動子(參見，例如美國專利第5,364,780以及5,777,200號)。
當需要于植物中的特定部位表達蛋白質時，可使用組織特異性啟動子。葉子的特異性啟動子可包含因前接35S增強子的C4PPDK啟動子(Sheen，15 MBO，123497-505(1993))或其它于葉子中具特異性表達的啟動子。至于欲在種子中表達蛋白質時，則可使用下列啟動子柰平(napin)基因的啟動子(美國專利第5,420,034以及5,608,152號)、乙?；?CoA羧基酶啟動子(美國專利第5,420,034以及5,608,152號)、2S白蛋白啟動子、種子貯存蛋白質啟動子、腰豆蛋白(phaseolin)啟動子(Slightom等人的Proc.Natl.Acad Sci.USA 801897-1901(1983))、油膜蛋白啟動子(Plant等人的Plant Mol.Bio.25193-205(1994)；Rowley等人的1997，Biochim.Biophys.Acta.13451-4(1997)；美國專利第5,650,554號；PCT WO 93/20216)、玉米膠蛋白質(zein)啟動子、堿溶性蛋白質(glutelin)啟動子、淀粉合成酶啟動子以及分枝淀粉酶啟動子。
植物中的IRES要件該IRES要件可為先前所敘述中一者或于植物細胞中具有活性的人造IRES(即合成的或由基因工程制造的IRES)。至于含有多-IRES的DNA構成，其可使用具有不同DNA序列的IRES要件。近年來已由Oleracia officinalis L.植物中分離出一種新的煙草花葉病毒，crTMV，且該crTMV的基因體已完成定序(6312個核酸)(Dorokhov等人的Dokladyof Russian Academy of Sciences 332518-522(1993)；Dorokhov等人的FEBS Lett.3505-8(1994))。
crTMV的RNA與典型的煙草花葉病毒的RNA不同處為crTMV的RNA的3′近側的CP基因的翻譯作用系通過核糖體內進入(由特定序列要件(IREScp)所調節(jié)，Ivanov等人的Virology 232，32-43(1997))機制而發(fā)生于試管以及植物界中。該結果指出，crTMV的RNA中的CP基因上游于148-核酸區(qū)域含有IREScp，該IREScp可促進于試管及生物體(原生質粒及轉基因植物)中翻譯作用之內起始。
近年來，已證實煙草花葉病毒的基因體RNA含有一序列(該序列位于MP基因之上游)，其可促進3′近側基因的表達(于試管中，以帽-獨立的方式翻譯連接至該序列上嵌合的mRNA)。crTMV的RNA中的MP基因上游的228-核酸序列(IRESMP228CR)可調節(jié)3′近側GUS基因(其系由雙順反子轉錄)的翻譯。另外，crTMV的RNA中的MP基因上游的75-核酸序列與228-核酸序列具有一樣的效力。因此，75-核酸序列含有一IRESMP要件(IRESMP75CR)。已發(fā)現(xiàn)類似于crTMV RNA，與煙草花葉病毒為同一群(TMV UI)的病毒其基因體RNA上游的75-核酸序列亦含有IRESMP75UI要件，該IRESMP75UI要件可調節(jié)3′近側基因的帽-獨立翻譯作用。
該煙草花葉病毒提供了一種新的內起始翻譯作用的實例，其與小RNA病毒及其它病毒以及真核細胞的mRNA顯示的IRES顯然不同。可調節(jié)帽-獨立翻譯作用的IRESMP要件不僅存在于crTMV的RNA中，也存在于與煙草花葉病毒為同一群病毒(TMV UI)及其它草嵌紋病毒(胡瓜綠斑嵌紋病毒)的基因體中。也就是說，草嵌紋病毒群中不同的病毒成員亦含有IRESMP。
由實施例可知，使用兩種特異性的IRES要件來驗證本發(fā)明。下列為由十字花科煙草花葉病毒(crTMV)的基因體而來的兩種IRES的核酸序列IRESmp75cr5′TTCGTTTGCTTTTTGTAGTATAATTAAATATTTGTCAGATAAGAGATTGTTTAGAGATTTGTTCTTTGTTTGATA3′(SEQ ID NO.1)IREScp148cr5′GAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTTTAAAAGAAGGAAAAAGAAGGTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGTAAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCCGGTCCTGATTCGTTTAATTTGAAAGAAGAAA3′(SEQ ID NO.2)由結構基因編碼的蛋白質于一方面中，通過本發(fā)明的表達方法以及表達單元所編碼出的蛋白質為原始形式的蛋白質，為了使該蛋白質具有生物活性，其基因需要與數(shù)個結構基因協(xié)同表達。于一例子中，該蛋白質需要與數(shù)個亞單位組合才能具有活性。于另一例子中，該蛋白質生產出來后，為未成熟的形式，其需要經過加工(例如由一或多個其它蛋白質進行蛋白水解切割)或經過蛋白質修飾(例如，磷酸化、蛋白質糖化、異戊烯化(prenylation)、核糖基化(ribosylation)等)而變成具有活性的蛋白質。
用以驗證本發(fā)明的非限制實例為抗體(例如單株抗體)以及胰島素。于此兩種蛋白質中，本發(fā)明不僅證明出可通過協(xié)同表達的方法來生產該功能性分子的能力且亦可通過細胞蛋白質的分泌器以正確地辨識于植物細胞中較不尋常、本文揭示的基因體構建及其后的多順反子mRNA。尤其，可通過該基因構建以及本發(fā)明的方法生產單株抗體而不需要產生融合瘤細胞。
單株抗體的基因可由鼠科動物、人類或其它動物來源獲得。此外，亦可合成該基因，例如可編碼出組成抗體分子的重鏈或輕鏈的基因，其為嵌合或經修飾的基因型式。編碼區(qū)域的順序(例如重鏈然后輕鏈，或輕鏈然后重鏈)并不重要。重鏈以及輕鏈多肽(例如可變重鏈及可變輕鏈多肽)的基因編碼可來自細胞產生的IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。制備基因體DNA片段(由此免疫球蛋白變異區(qū)域的基因可經克隆)的方法為此技藝中所熟知的技術。參見例如，Herrmann等人的Methods inEnzymol.，152180-183(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.，152183-190(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.，152199-212(1987)。
用于分離可編碼出免疫球蛋白產物的基因的探針包含編碼VH的恒定部分的序列、編碼VH及VL的骨架區(qū)域的序列以及完全重組的免疫球蛋白基因的恒定區(qū)域的探針，這些序列系由可利用的來源獲得。參見，例如，Early and Hood，Genetic Engineering，Setlow and Hollaendereds.，Vol.3157-188，Plenum Publishing Corporation，New York(1981)；以及Kabat等人的Sequences of Immunological Interests，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1987)。
蛋白質的實例為胰島素，于其自然的環(huán)境中，編碼及翻譯出的胰島素為前驅物形式，然后通過一或多個蛋白水解切割步驟以形成成熟且具有功能性的蛋白質。翻譯作用之后，前胰島素原蛋白質的加工(以獲得成熟形式的胰島素)包含蛋白水解切割步驟(包含移除胺基端的分泌作用信號序列(此為真核生物的分泌作用途徑的一般步驟))，以及通過枯草菌素(subtilisin)家族的蛋白酶(例如PC2以及PC1/PC3蛋白酶)于內位置進行加工及通過羧肽酶E進行修飾。切割作用會使內肽(C-肽以及A及B肽)釋出。該A及B肽在形成肽鏈內及肽鏈間的雙硫鍵后，才會形成熟成的胰島素蛋白質。
真核生物的分泌作用途徑的細胞內區(qū)間提供了優(yōu)選的環(huán)境使適當?shù)牡鞍踪|進行成熟作用、折疊作用以及雙硫鍵的形成，于植物中以此方式表達人類或動物的蛋白質將同樣地顯示有利于生產適當成熟形式的蛋白質。其它合成成熟胰島素的方法包含分別地表達各個A及B肽，然后于試管中提供一個適合進行還原作用的環(huán)境以利雙硫鍵的形成(美國專利第4,421,685以及4,559,300號)。
依照本發(fā)明，可制備許多型式的多順反子基因構建以生產胰島素。于一具體實施例中，一多順反子基因構建包含胰島素編碼區(qū)域與其本身的分泌作用信號或植物的分泌作用信號，以及可編碼出蛋白水解加工酶的結構基因?？墒褂酶鞣N為熟知此技藝的人士所知悉的方法克隆出人類的胰島素基因(GenBank Accession J00265)。該克隆的優(yōu)選型式為來自成熟mRNA的cDNA，以此方式可排除內含子以及減少期望克隆的基因的整體大小。同樣地，可利用已知DNA序列的信息(例如于一或多個如上述的表達單元中包括下列一或多個序列)克隆出編碼蛋白水解酶(PC2、PC1/PC3以及羧肽酶E)的基因。
結構基因 于GenBank中的說明人類胰島素 定義人類胰島素基因，完整的cds。
編號J00265(GenBank)PC2前蛋白轉換酶 定義現(xiàn)代人(homo sapiens)的蛋酶白原轉變，枯草菌素/第2型科星(kexin)(PCSK2)，mRNA。
編號XM_012963(GenBank)PC3(PC1)前蛋白轉換酶 定義現(xiàn)代人的前蛋白轉換酶，枯草菌素/第1型科星(PCSK1)，mRNA。
編號XM_003674CPE羧肽酶E酶 定義現(xiàn)代人的羧肽酶E(CPE)，mRNA。
編號XM_003479(GenBank)于這些例子中，優(yōu)選型式的基因為來自成熟mRNA或與其DNA序列同等的cDNA。該基因可產生多個多順反子載體以使這些所有構成成熟蛋白質的組份以所需的比例來達成于植物中成熟胰島素的高階表達。因此，本發(fā)明提供一種在植物中通過將所有所需的基因結合于多順反子載體中以完整的合成具有治療作用的經加工的成熟的蛋白質。
于一優(yōu)選的具體實施例中，該核酸構建或表達單元由5′至3′的順序包括驅動人類胰島素基因表達的啟動子、接著為IRES(優(yōu)選為cp148或mp75)、CP2的編碼區(qū)域、第二個IRES、CP3的編碼區(qū)域、第三個IRES以及CPE的編碼區(qū)域。整個的片段結束于帶有適當?shù)闹参镛D錄作用終止處以及多腺苷酸作用信號的3′端以確保轉錄出的mRNA可進行最有效的加工作用。參見第3A圖。雖然所述的基因為單一順序，但該編碼區(qū)域(編碼區(qū)域中所給予的任何序列系為了生產出治療性蛋白質)最理想的順序可依照標準技術而決定以及具有不同基因順序的表達單元皆包括于本發(fā)明范疇中。
于其它具體實施例中，本發(fā)明的基因構建及方法可以下述方式修改例如，于引入含有編碼加工蛋白質的結構基因的基因構建后，分別將編碼未成熟形式胰島素的結構基因引入植物細胞中。因此，制備出一種″宿主″加工植物且使其增殖到引入包括胰島素基因的表達單元。于此例中的胰島素，該多順反子基因構建未包含胰島素編碼區(qū)域且該啟動子會驅動第一個加工酶(PC2)的表達，接著由IRES驅動PC3及PCE基因的表達。然后以穩(wěn)定的基因片段或通過暫時性表達(transientexpression)將胰島素基因引入植物中。此基因構建的圖標說明顯示于第3B圖。這些基因的各個產物系定位于適當?shù)拇渭毎g隔中，此與人類細胞中發(fā)生的加工作用最為相似。
靶序列當?shù)鞍踪|于細胞中合成時，其可通過靶序列的功效靶至特定的亞細胞或細胞外位置。于一些例子中，氨基酸的序列系以多肽的胺基端部分合成，以及于移位或定位過程之后或期間通過蛋白酶加以切割。例如，于真核細胞中，蛋白質分泌途徑的模型為隨著核糖體結合至mRNA以及翻譯作用起始后，開始出現(xiàn)剛合成的多肽鏈。如果該蛋白質系預定用于分泌，該蛋白質暴露出的胺基端會為信號辨識粒子(signalrecognition particle，SRP)所辨識，使得當mRNA、核糖體以及SRP復合體?？坑趦荣|網時短暫地中止翻譯作用。停靠后，翻譯作用重新開始，雖然此時的多肽鏈為一邊進行翻譯作用一邊移位至ER內部。蛋白質亦可于翻譯作用后再移位；但于生物體中此種過程較不具效率且通常不將其視為進入ER的正常途徑。
美國專利第5,474,925號描述利用信號肽的基因表達構成，該肽可經翻譯融合成重組蛋白質，使該蛋白質靶至細胞壁的纖維素基質。如此使可回復的纖維素基質與蛋白質分離出特別有助于在棉屬植物中表達蛋白質。因此，本發(fā)明的一具體實施例中，該表達單元可包括一結構基因，其系融合至編碼這些信號肽的序列的主干中。
于另一方面，該蛋白質可靶至植物的間液(interstitial fluids)而允許蛋白質(例如抗體，優(yōu)選為單株抗體)可自間液中直接分離。自間液分離蛋白質的一示范方法系描述于美國專利第6,284,875號。因此，于一具體實施例中，該表達單元包括一結構基因，其系融合至靶序列(由蛋白質分泌至間隙液體)的主干中。此種蛋白質系描述于例如，美國專利第6,284,875號。
本發(fā)明中，特佳的具體實施例為，例如，該結構基因可編碼抗體分子的重鏈及輕鏈者，該結構基因包含用以指引表達產物至分泌途徑的靶肽。如同抗體系一種正常分泌的蛋白質-該分泌過程于成熟抗體分子的生產中扮演一重要角色。為了于植物中達成上述目的，該基因系經合成(例如克隆)，且該基因具有其本身哺乳動物的信號肽編碼區(qū)域或以融合型式取代植物的分泌作用信號肽。該信號肽及該蛋白質間的融合應使植物進行加工時，所得的蛋白質的胺基端與于人類宿主中所產生的胺基端相同。
將蛋白質靶至植物內膜系統(tǒng)為本發(fā)明的優(yōu)選具體實施例，其對蛋白質的胺基端提供適當?shù)某墒熳饔?。如果期望的蛋白質不論是具有附加的靶信息或是利用基因工程的方式使該蛋白質包含附加的靶信息，則可實現(xiàn)將其進一步定位至內膜系統(tǒng)的特定區(qū)域。
靶至胞器(例如細質體(如葉綠體)以及線粒體)亦有利于達成期望的胺基端成熟，靶至這兩個位置系由胺基端的信號序列指定，接著則進行蛋白質切割。于一優(yōu)選具體實施例，該作為信號的肽可指引表達產物至細質體(如葉綠體)或其它亞細胞器。一實例為紫花苜蓿核酮糖-雙磷酸羧基酶的小亞單位的轉移肽(transit peptide)(Khoudi等人的Gene197343-5(1997))。過氧化物酶體的(peroxisomal)靶序列系有關肽序列(不論系N-端序列，內部序列或C-端序列)，其可使蛋白質靶至過氧化物酶體上，例如植物的C-端靶三肽SKL(Banjoko等人的Plant Physiol.1071201-08(1995))。
另一方面，細胞核定位信號并不一定是限制在5′端位置(胺基端)且無法通過任何已知的細胞機制將其蛋白水解移除。第3圖顯示葉綠體靶肽的序列，它是來自煙草細胞核基因編碼的核酮糖-雙磷酸羧基酶的小亞單位(GenBank ACCESSION X02353)。于進入胞器期間，該信號或轉移肽會通過胞器的蛋白酶的作用而移除。于基因融合體的5′端包括此序列，該基因融合至這段序列(起始于期望的成熟形式蛋白質(即抗體的重鏈或輕鏈)的第一個氨基酸)有助于生產成熟形式的蛋白質。
為了于液泡中定位或分泌蛋白質，用以將蛋白質靶至內膜系統(tǒng)的信號序列在植物及動物中是相似的。第4圖顯示植物鈣調蛋白蛋白質的胺基端部分與一些抗體基因的胺基端部分的比較。該比較的序列包含抗體蛋白質的部分，該抗體蛋白質系制造成前蛋白質原的部分，但不存在于最終成熟蛋白質(經過分泌途徑的加工)。一般，此種信號序列在長度上可有些許改變，如實施例中，植物的信號肽比哺乳動物的序列長10至11個氨基酸，但它們都具有共同的特征，該特征已知為與真核細胞的分泌信號肽有關。為了使信號肽適用于本發(fā)明，可依據(jù)標準技術加以改變(例如制備帶有適合用于與其它任何基因克隆的端基)。
融合蛋白質結構基因亦可編碼融合蛋白質。例如，結構基因(其可編碼出需經加工的多聚體蛋白質或蛋白質的多肽亞單位)包括可編碼出效應物多肽的序列。本文中所使用的″效應物分子″系指氨基酸序列，例如蛋白質、多肽或肽，以及可包含，但非限于調節(jié)因子、酶、抗體、毒素等。由效應物分子產生所需的效應的非限制實例包含，引起細胞增生或細胞死亡、起始免疫反應或作為診斷目的的偵測分子(例如該融合體可編碼出螢光多肽，例如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。
選擇性標記以及報導基因(Reporter genes)由報導基因編碼出的選擇性標記(例如抗抗生素基因(例如卡那霉素(kanamycin)以及抗潮霉素(hygromycin))、抗除草劑(固殺草(glufosinate)、伊米達璘諾(imidazlinone)或嘉磷塞(glyphosate))基因或生理上標記(可見或生物化學上))系用于篩選經本發(fā)明的核酸構建轉化的細胞。另一方面，非轉基因的細胞(即非轉化株)系經撲殺或優(yōu)先地在選擇性的條件下無法生長。報導基因可包含于基因構建中或載體中，最后將該基因構建運送至植物細胞。本文中所使用的″報導基因″系指可提供細胞一種經表達后為可見的或可測量的表型的任何基因。
優(yōu)選地，報導基因的表達會產生一種可偵測的結果，例如，提供視覺上的比色、螢光、冷光或生物化學上可分析的產物；以及/或選擇性標記，其可基于生理反應(例如生長差異、增殖速率的改變、分化狀態(tài)等)選擇轉化體。細胞中報導基因的表達會造成該細胞展現(xiàn)出視覺生理上或生物化學的特征。一般使用的報導基因包含lacZ(β-半乳糖)、GUS(β-尿酸化)、GFP(綠色螢光蛋白質)、螢光酶或CAT(綠霉素乙酰基轉移)，這些特征可容易地觀察到或測量。此種基因可組合使用或取代選擇性標記而可輕易地挑出所想要的克隆。選擇性標記亦可包含有助于分離出表達該標記的細胞的分子。例如，選擇性標記可編碼出抗原(該抗原可由抗體所辨識)而通過以親合性為主的純化技術或流式細胞技術(flow cytometry)分離出經轉型的細胞。報導基因亦包括可通過對植物細胞為外來者的優(yōu)點而偵測到的序列(例如，由PCR偵測)。于此具體實施例中，該報導基因不需表達蛋白質或造成表型可見的改變。
植物轉化作用將DNA分子轉移以及整合至植物宿主基因體中的方法為已知。例如以阿拉伯芥的真空-滲透或浸漬為優(yōu)選的方法，因為許多植物可于小空間中進行轉化作用，而產生大量的種子以篩選轉化體。典型地，定氮菌屬(agrobacterium)可以經界定端(T-DNA邊緣)轉移線形DNA片段(T-DNA)亦使其成為優(yōu)選的方法?？衫蔑@微注射法、化學處理或粒子槍法(microprojectile bombardment，biolistics)進行直接DNA轉化作用。除了任何重組DNA構成的尺寸上的限制外，多順反子基因(依據(jù)本發(fā)明的編碼序列)可利用病毒載體傳送至植物內。該經轉型的植物細胞可能存在于原生質粒、細胞培養(yǎng)、愈合組織、懸浮培養(yǎng)、葉、花粉或分生組織的型式中。
于適宜的情形下，經轉化的細胞會再生至整個植物中，其新的細胞核材料系穩(wěn)定的合并至基因體內。以此方式可獲得經轉化的單子葉及雙子葉植物。尚有多種植物類型可以本發(fā)明的核酸構建加以轉化。其它經基因修飾且可生產的植物的實例包含農藝作物、谷類、水果以及蔬菜(例如油菜、煙草、甜菜、棉花、大豆、玉蜀黍、小麥、大麥、稻谷、高梁、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、洋梨、草莓、香蕉、甜瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、萵苣、甘藍菜、洋蔥)。優(yōu)選的植物為阿拉伯芥、蕓薹類、玉蜀黍、紫花苜蓿、大豆、煙草、十字花科(crucifera)、棉子、向日葵以及豆科植物。
蛋白質的分離耕種后，采收轉基因植物以回收經生產的多-亞單位蛋白質或經加工的蛋白質(及/或其它依照本發(fā)明，通過結構基因生產的蛋白質)。采收的步驟包括采收整株植物，或只采收植物的葉子、根或細胞。這個步驟會砍殺植物或只采收轉基因植物中的部分，只采收轉基因植物中的部分可使該植物其余部分繼續(xù)生長。
采收后，可利用此技藝中習知的方法進行蛋白質分離。例如，將至少一部分的植物均質化，以及萃取蛋白質然后將其進一步純化。萃取包括于適當溶劑中浸泡或浸漬該均質物。如上述，蛋白質亦可由植物之間隙液體中分離，例如，通過真空浸透法(描述于美國專利第6,284,875號)。
純化方法包含，但非限于免疫親合性純化法以及根據(jù)蛋白質/蛋白質復合體的特定尺寸、電泳移動性、生物活性以及/或欲分離的多聚體蛋白質的凈電荷等的純化方法。
以下將通過數(shù)個可行的實施例說明本發(fā)明。這些實施例的目的系用以說明本發(fā)明而不欲于任何方面限制本發(fā)明。
實施例1質粒ICP1176(第6圖)包含IgG1亞種單株抗體(pspHCIgG1)的重鏈編碼區(qū)域，該抗體可辨識哺乳動物組織因子蛋白質。質粒ICP1221(第7圖)含有κ輕鏈編碼區(qū)域(pspLCIgG1/4)，其可與上述的重鏈形成帶有所需特性的完整鏈的單株抗體。在兩克隆中使用標準的方法產生限制端以有助于進行克隆。兩克隆區(qū)域系釋放為NcoI至XbaI限制片段。于該實施例(第8圖)中顯示該輕鏈區(qū)域系克隆至植物的表達載體中，與(OCS)3MAS啟動子相鄰并接著將IRES(cp148)及重鏈插入至其3′處，且接著為Nos轉錄作用終止信號。該相同的載體于2x35S啟動子的轉錄控制下帶有植物選擇性標記(BAR)(pICGHpolyAb1，第8圖)。
于第1圖中，DNA構成與所述的分子相似，其中輕鏈基因系Gene1以及重鏈基因系Gene 2。另外構成一個類似的質粒，其重鏈及輕鏈的順序與上述相反。接著將此載體轉移至定氮菌屬而用以進行暫時性表達及阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(N.benthamiana)、芥菜(Brassica juncea)以及小油菜(B.campestris)的轉化作用。雖然已確定有多種方法可進行定氮菌屬引導的植物轉化作用，而本發(fā)明中阿拉伯芥的定氮菌屬轉化作用系利用真空滲透法進行。暫時性表達試驗系利用葉子移植片段以及整株幼苗的真空滲透物而進行。
于第9圖中顯示的實施例，該結構基因可編碼出抗體的輕鏈。該基因系克隆至植物的表達載體，與(OCS)3MAS啟動子相鄰，如圖所示，該IRES(cp148)及植物的可選擇性標記(NPTII)系插入該結構基因的3′端。于此基因構建的3′端提供CaMV35S轉錄作用終止信號。于相同的載體中也帶有可編碼出抗體的重鏈的基因，該基因克隆至與(OCS)3MAS啟動子相鄰的位置。IRES(cp148)及植物的可選擇性標記(NPTII)系插入重鏈基因的3′端，且接著為CaMV 35S轉錄作用終止信號(pXB1500，第9圖)。于此形式中，該DNA構成與第1圖所述的分子相似，其中抗體鏈基因系Gene 1以及可選擇性標記基因系Gene 2。
另外構成一個類似的質粒，其重鏈及輕鏈的順序與上述相反。接著將此載體轉移至定氮菌屬而用以進行暫時性表達及如上述的阿拉伯芥、煙草、芥菜以及小油菜的轉化作用。雖然已確定有多種方法可進行定氮菌屬引導的植物轉化作用，而本發(fā)明中阿拉伯芥的定氮菌屬轉化作用系利用真空滲透法進行。眾所周知的暫時性表達試驗系利用葉子移植片段以及整株幼苗的真空滲透物而進行。
于定氮菌屬的轉化作用的例，T1種子是在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上發(fā)芽，然后將存活的植物通過PCR分析篩選出存在有重鏈及輕鏈編碼區(qū)域者。于此試驗中呈陽性的材料使其進一步繁殖以及通過西方點墨(western blot)分析法及ELISA加以測試。
實施例2此實施例系描述單株抗體的生產。
質粒ICP1177(第9圖)包含IgG4亞種單株抗體(pspHCIgG4)的重鏈編碼區(qū)域。質粒ICP1221(第7圖)含有κ輕鏈編碼區(qū)域(pspLCIgG1/4)，其與上述的重鏈一起形成一個帶有所需特性的完整鏈的單株抗體。
克隆的程序(產生pICGHpolyAb4，第10圖)、植物的轉化作用、篩選以及產物的分析實質上與實施例1所述相同。
實施例3實施例3。于此實施例中有3個編碼區(qū)域系由單一個啟動子驅動。此例子中，植物選擇性標記已直接包含在DNA構建中，其系與啟動子相鄰的基因中最5′端的基因，而重鏈的5′端系插入至cp148 IRES的下游。輕鏈基因的5′端系插入至mp75 IRES的下游，最后為終止信號/多A位置。另一種構形可使多順反子重鏈及輕鏈基因通過實施例1及2的啟動子而驅動，且于相同DNA構建上，該選擇性標記帶有自己的啟動子。此型式中該抗體基因系置于一種型式的啟動子的控制下，而選擇性基因系置于另一種型式的啟動子的控制下。與實施例1及2所述的共-轉化作用法相比，實施例3提供標記及該抗體基因較緊密的連接，但仍可分離及區(qū)別基因表達的調節(jié)。
于本說明書中所舉例的所有專利及非專利的公開案是指本領域技術人員普通水平程度。所有這些公開案及專利申請均合并于本文作為參考，即個別的公開案或專利申請案系明確地及分別地以參考方式合并于本文。
那些熟知此技藝的人士者可僅利用常規(guī)的實驗法確定或察明與本文所述等同的多種特定物質及程序。此種等同物質及方法系視為本發(fā)明的范圍且包含于下列權利要求中。
權利要求
1.一種核酸構建物，它含有在植物細胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作連接轉錄調節(jié)要件、可編碼出包括可專一性地與抗原結合的抗體中具有免疫活性的第一部分的第一多肽的第一編碼區(qū)域、IRES要件、可編碼出包括可專一性地與抗原結合的抗體中具有免疫活性的第二部分的第二多肽的第二編碼區(qū)域，其中當該第一及第二部分經表達后，它們會互相結合以形成可專一性地與抗原結合的多-亞單位多肽。
2.一種核酸構建物，它含有在植物細胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作連接轉錄作用調節(jié)要件、編碼多-亞單位蛋白質的第一多肽亞單位的第一編碼區(qū)域、IRES要件、編碼多-亞單位蛋白質的第二多肽亞單位的第二編碼區(qū)域，其中所述的第一及第二編碼區(qū)域不會編碼出相同的亞單位。
3.一種核酸構建物，它含有在植物細胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作連接轉錄作用調節(jié)要件、至少一個第一編碼區(qū)域，其可編碼出用以加工不成熟蛋白質使其成為成熟蛋白質的加工蛋白質、于植物細胞中具有功能的IRES要件、第二編碼區(qū)域，其可編碼出不成熟蛋白質，其中于相同植物細胞中，該第一及第二編碼區(qū)域的表達會造成將不成熟蛋白質加工成為成熟形式的蛋白質，IRES要件位于編碼區(qū)域之間，轉錄調節(jié)要件轉錄編碼第一和第二編碼區(qū)域的多順反子片段。
4.一種在宿主植物細胞中用于表達外源性多-亞單位多肽的核酸構建物，它包括編碼外源性多-亞單位蛋白的多順反子mRNA的編碼序列，其中所述的外源性多肽是在宿主植物細胞中非天然表達的多肽。
5.一種在宿主植物細胞中表達多肽的核酸構建，它包括編碼單鏈T細胞受體、單鏈MHC分子、單鏈免疫球蛋白超家族或其融合物的多順反子mRNA的編碼序列。
6.根據(jù)權利要求1所述的核酸構建物，其中所述的第一編碼區(qū)域及第二編碼區(qū)域可編碼抗體的重鏈或輕鏈，且其中所述的第一及第二編碼區(qū)域不會編碼出相同的鏈。
7.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，它還包括終止信號。
8.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，其中所述的第一及第二編碼區(qū)域還包括靶序列。
9.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，其中所述的轉錄作用調節(jié)要件為啟動子。
10.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，其中所述的轉錄作用調節(jié)要件是用植物細胞中具有功能的IRES要件替代以及該整合的基因體位點對經基因工程的基因構建提供轉錄控制。
11.根據(jù)權利要求1所述的核酸構建物，其中所述的抗體系單克隆抗體。
12.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，其中所述的IRES要件系IRESmp75。
13.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，其中所述的IRES要件系IREScp148。
14.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，其中所述的靶序列將第一及第二編碼區(qū)域的多肽產物靶向至植物細胞的內質網。
15.根據(jù)權利要求8所述的核酸構建物，其中所述的靶序列系轉移肽，其將第一及第二編碼區(qū)域的多肽產物靶向至植物細胞的質體。
16.根據(jù)權利要求15所述的核酸構建物，其中所述的質體系葉綠體。
17.根據(jù)權利要求8任意一項所述的核酸構建物，其中所述的靶序列系轉移肽，其將第一及第二編碼區(qū)域的多肽產物靶向至植物細胞的線粒體。
18.根據(jù)權利要求1所述的核酸構建物，其中所述的第一編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的重鏈以及該第二編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的輕鏈。
19.根據(jù)權利要求1所述的核酸構建物，其中所述的第一編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的輕鏈以及該第二編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的重鏈。
20.根據(jù)權利要求1所述的核酸構建物，其中所述的抗體系人類的抗體或人類屬性的抗體。
21.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，還包括編碼可選擇標記的基因。
22.根據(jù)權利要求21所述的核酸構建物，其中所述的編碼可選擇標記的基因可操作連接至啟動子，而該啟動子可驅動標記的表達。
23.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，還包括至少一個真核細胞的復制作用起始點。
24.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，還包括原核細胞的復制作用起始點。
25.根據(jù)權利要求23所述的核酸構建物，還包括原核細胞的復制作用起始點。
26.根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，還包括一種或多種在一或多種附加結構基因的5′處包括IRES要件的附加的結構基因。
27.根據(jù)權利要求3所述的核酸構建物，其中所述的不成熟蛋白質系前胰島素原。
28.根據(jù)權利要求8所述的核酸構建物，其中所述的靶序列可靶至非質粒、液泡、葉綠體、質體、線粒體、過氧化物酶體或細胞核，或者靶至細胞壁。
29.一種包括第一表達單元以及第二表達單元的組合物，其中所述的第一表達單元包括根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物，以及該第二表達單元包括第三編碼區(qū)域，該第三編碼區(qū)域可操作連接至啟動子或IRES要件。
30.一種包括根據(jù)權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物的植物或其部分。
31.根據(jù)權利要求30所述的植物或其部分，其中所述的植物系選自阿拉伯芥、蕓薹類、玉蜀黍、紫花苜蓿、大豆、煙草、十字花科、棉子、向日葵以及豆科植物。
32.一種生產可表達外源性蛋白質的宿主植物細胞的方法，包括引入如權利要求1-5任意一項所述的核酸構建物至宿主植物細胞中。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，還包括由該植物細胞繁殖出植物。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，還包括栽培該植物的后代。
35.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述的植物細胞系由選自原生質粒、細胞、愈合組織、懸浮培養(yǎng)、葉子、根、莖、胚軸、花粉、種子以及分生組織等組織而來。
36.根據(jù)權利要求32所述的方法，還包括表達蛋白質的步驟。
37.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述的蛋白質系選自抗體、T細胞受體、MHC蛋白質、免疫球蛋白超家族的蛋白質、干擾素、白介素、激素、抗原、受體以及治療性蛋白質。
38.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述的蛋白質系融合蛋白質。
39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中所述的融合蛋白質包括效應物分子。
40.一種宿主植物或其部分，包括至少一個細胞，該細胞包括可編碼出多順反子mRNA的核酸，該多順反子mRNA可編碼出外源性多-亞單位蛋白質，而該外源性蛋白質為宿主植物中非自然表達者。
41.根據(jù)權利要求40所述的植物或其部分，其中所述的植物系F0植物。
42.根據(jù)權利要求40所述的植物或其部分，其中所述的植物系阿拉伯芥。
43.根據(jù)權利要求40-42任一所述的植物或其部分，其中所述的多-亞單位蛋白質包括選自由T細胞受體、MHC分子、免疫球蛋白超家族的蛋白質或共-受體、核酸結合蛋白質、催化性抗體(abzymes)、受體、生長因子、細胞膜蛋白質、分化因子、類血紅素蛋白質以及多聚激酶異二聚體或異多聚體蛋白質。
44.一種植物或其部分，包括至少一個細胞，該細胞包括可編碼出多順反子mRNA的核酸，而該多順反子mRNA可編碼出無活性的多肽，該無活性的多肽可經修飾而成為活性形式以及包括可加工該無活性的蛋白質成為活性形式的加工蛋白質。
45.根據(jù)權利要求44所述的植物或其部分，其中所述的加工蛋白質系蛋白酶。
46.根據(jù)權利要求44-45中任一所述的植物或其部分，其中所述的無活性的蛋白質系前胰島素原。
47.根據(jù)權利要求44所述的植物或其部分，其中所述的加工蛋白質系修飾蛋白質用的酶。
48.根據(jù)權利要求47所述的植物或其部分，其中所述的酶系激酶。
49.一種生產可表達于宿主植物細胞中非自然表達的外源性多-亞單位蛋白質的宿主植物細胞的方法，包括于植物細胞中表達可編碼出多順反子mRNA的核酸，而該多順反子mRNA可編碼出多-亞單位蛋白質。
50.根據(jù)權利要求49所述的方法，其中所述的植物細胞系得自F0植物。
51.根據(jù)權利要求49所述的方法，其中所述的植物細胞系阿拉伯芥細胞。
52.根據(jù)權利要求49-51中任一所述的方法，其中所述的多-亞單位蛋白質包括選自由T細胞受體、MHC分子、免疫球蛋白超家族的蛋白質或共-受體、核酸結合蛋白質、催化性抗體、受體、生長因子、細胞膜蛋白質、分化因子、類血紅素蛋白質以及多聚激酶的異二聚體或異多聚體蛋白質。
53.一種于植物中生產活性形式的外源性蛋白質的方法，包括表達可編碼出多順反子mRNA的核酸，該多順反子mRNA可編碼出無活性的多肽，該無活性的多肽可經修飾而成為活性形式以及包括可加工該無活性的蛋白質成為活性形式的加工蛋白質。
54.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中所述的加工蛋白質系蛋白酶。
55.根據(jù)權利要求53或54所述的方法，其中所述的無活性的蛋白質系前胰島素原。
56.根據(jù)權利要求52所述的方法，其中所述的加工蛋白質系修飾蛋白質用的酶。
57.根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述的酶系激酶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在植物中用以生產蛋白質的組合物及方法，尤其是于自然狀態(tài)下的蛋白質為了成為具有生物活性的蛋白質，需要多數(shù)個結構基因來協(xié)同表達。典型地最終產物具有治療、診斷或產業(yè)上用途。
文檔編號C12P21/02GK1533438SQ02802025
公開日2004年9月29日 申請日期2002年6月7日 優(yōu)先權日2001年6月8日
發(fā)明者G·赫爾, N·拜斯可, M·波西, G 赫爾, 箍 申請人:愛康遺傳科技公司