本發(fā)明涉及微生物檢測
技術領域：
，具體涉及一種應用重組酶聚合酶擴增-側流層析試紙條技術，現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的引物、探針及試劑盒。
背景技術：
：副結核病，也稱副結核性腸炎，是由副結核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis，MAP)引起牛、羊、鹿以及駱駝等多種動物的一種慢性傳染病。OIE將其列為B類疫病，我國將其列為多種動物共患的二類動物疫病。副結核分支桿菌主要感染牛、羊和鹿，發(fā)病動物和隱性感染者是主要傳染源，它們可通過乳汁、糞便和尿排出大量的病原菌。本病的流行特點是發(fā)展緩慢，發(fā)病率不高，病死率極高，并且一旦在動物群中出現(xiàn)則很難根除。近年來我國養(yǎng)殖場副結核病的感染率有上升的趨勢，一些養(yǎng)殖場依然沒有重視該病的防控。由于副結核病引起患病動物消瘦、生產性能下降、增加飼料消耗及易感染其他疾病直至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失相當嚴重，因此，規(guī)?；翀龈苯Y核病的檢疫與凈化顯得非常重要。目前，副結核病的診斷方法主要有病原學方法、變態(tài)反應和血清學方法，其中，病原學主要有萋-尼氏抗酸染色、分離培養(yǎng)、PCR技術、LAMP快速檢測等。對于萋-尼氏抗酸染色而言，由于糞便樣品中可能還有其他的抗酸菌，會干擾染色法的診斷結果；對于分離培養(yǎng)法而言，分離培養(yǎng)耗時費工，分離率也較低；PCR技術對儀器設備和技術人員依賴程度高，在基層條件差和技術人員匱乏的情況下，很難實現(xiàn)現(xiàn)場實地快速診斷；LAMP快速檢測雖然可以進行核酸的恒等溫擴增，但仍不能對核酸粗提物的DNA樣本進行直接擴增。此外，現(xiàn)有的采用PCR和LAMP診斷副結核病的報道中，其設計引物所依據(jù)的保守基因序列有多種，有的以副結核分枝桿菌ISMav2基因(AF286339)的保守區(qū)域設計引物(“牛副結核分支桿菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立”，中國畜牧獸醫(yī)，2012年第39卷第10期)；有的以牛副結核分枝桿菌的IS900基因序列作為靶基因設計特異性引物(“牛副結核分枝桿菌LAMP快速檢測方法的建立”，中國預防獸醫(yī)學報，2012年6月)，而根據(jù)不同的靶標(保守基因)設計的引物序列不同，對副結核分枝桿菌的診斷和檢測效果也存在較大差異，因此，選擇何種靶標作為引物設計的依據(jù)也是病原學法診斷副結核分枝桿菌的難點之一。皮內變態(tài)反應能檢測出副結核感染前期的大部分發(fā)病動物，但對于感染中后期以及處于耐受期的動物敏感性不強或者不出現(xiàn)反應狀態(tài)。動物在感染副結核分枝桿菌后的前期并不產生抗體，只有在臨床癥狀階段才產生抗體，所以使用血清學方法可能漏檢副結核病陽性動物。因此，從臨床診斷的時效性方面考慮，亟需一種新的病原學現(xiàn)場快速恒等溫擴增檢測技術。重組酶聚合酶擴增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技術是目前新出現(xiàn)的一種體外快速核酸擴增技術，在37℃左右就能發(fā)生反應，并且僅需十幾分鐘就能擴增出痕量級的檢測產物。同時RPA可以完成核酸粗提物的擴增，它通過瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴增曲線和側流層析試紙條(LateralFlowDipstick，LFD)三種方式檢測結果，這三種方式的引物與探針反應原理是不同的?；镜腞PA擴增只需上下游引物，產物通過凝膠電泳檢測，而RPA-nfo和RPA-exo反應，是通過不同的探針結合到模板互補鏈后再通過核酸內切酶IV(nfo)和核酸內切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，這兩種方法分別通過LFD(nfo)和實時熒光(exo)兩種不同的手段檢測結果。凝膠電泳和熒光擴增曲線法仍然依賴實驗室和特殊儀器設備，而LFD是一種無需特殊儀器可用于現(xiàn)場的檢測方法。將RPA技術與LFD技術結合，通過LFD讀取結果，既不要求特殊儀器設備，也無需復雜的樣品處理，借助恒溫水浴鍋用LFD就可以通過肉眼觀察結果。但目前尚無文獻報道利用RPA-LFD技術現(xiàn)場檢測副結核分枝桿菌。但RPA技術屬于新興的核酸擴增技術，其應用并不十分普遍，其主要技術難點在于特異性引物和探針的設計和篩選，而引物/探針的設計和選擇對RPA-nfo的結果是至關重要的，目前并沒有像PCR擴增技術那樣專門的引物/探針的設計軟件，也沒有較多的文獻和試驗數(shù)據(jù)提供技術依據(jù)。經(jīng)相關檢索，目前還未有針對副結核分枝桿菌進行RPA-LFD檢測的相關報道。綜上，對于副結核分枝桿菌的RPA-LFD檢測，目前尚無明確可借鑒的思路和結果，還需要技術人員做大量和深入的研究。技術實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的是提供一種用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的引物、探針及試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：本發(fā)明的第一方面，提供一種用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針；其RPA-nfo正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，其RPA-nfo探針序列如SEQIDNO.3所示。具體序列如下：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探針：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。本發(fā)明的探針，在其5'端用FAM標記，距離5'端30個堿基左右的位置處用dSpacer替代一個堿基，3’端用C3-spacer阻斷。需要說明的是，與常規(guī)PCR反應不同，RPA-nfo反應所需引物的長度通常為30～35bp，引物過短會嚴重影響重組酶的活性；但長引物也并不一定能提高擴增性能，反而還會增加形成二級結構的可能性。LF探針長度一般在46～52bp，nfo核酶距離探針5'端30個堿基左右，距離3'端16～22個堿基左右，個別堿基的替換或增減都會對探針的特異性產生影響。因此，引物的設計和選擇對RPA的結果至關重要。RPA技術正處于起步研究階段，尚無專門的引物、探針設計軟件，也沒有大量的數(shù)據(jù)為其引物設計原則提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標序列兩端設計多對引物和探針組合，然后進行試驗優(yōu)化、篩選才能得到。本發(fā)明設計了多組不同的引物和探針組合，經(jīng)試驗反復驗證后，確定本發(fā)明所列出的上述引物和探針組合，其檢測效果最佳。本發(fā)明的第二方面，提供一種用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。進一步的，該試劑盒中還包括：陽性質控標準品、陰性質控標準品和RPA-nfo反應液。所述陽性質控標準品為：包括副結核分支桿菌IS900基因片段的陽性質控標準品；優(yōu)選的，所述副結核分支桿菌IS900基因片段陽性質控標準品由含有259個堿基的核苷酸片段構成的pEASY-T3重組質粒組成；所述含有259個堿基的核苷酸片段的序列如SEQIDNO.4所示，具體如下：5'-ATCAGCGCGGCACGGCTCTTGTTGTAGTCGAAGGCGCGTTCCAGCGCCGAAAGTATTCCAGCAGCTGGGCGCGCATTCGGTTCGATCGCCCGGGTCCGATCAGCCACCAGATCGGAACGTCGGCTGGTCAGGATGCGCAGCTCGACTGCGATGTCATCGCCGGCGCGCAGAGGCTGCAAGTCGTGGCGCATCCGGGCCTGATCGGCGATGATCGCAGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTGCCTTCGCCGCGGTAACTACCCG-3'；(SEQIDNO.4)上述含有259個堿基的核苷酸片段是從副結核分支桿菌標準菌株基因組DNA中克隆得到。所述陰性質控標準品為pEASY-T3空載質粒。所述RPA-nfo反應液，包括：recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂(MgAc)溶液、側流層析試紙條(LFD；特異性檢測生物素與FAM標記基因擴增產物)、LFD檢測緩沖液(1×PBS+0.1％吐溫20)、滅菌去離子雙蒸水(ddH2O)，TE緩沖液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K和副結核分支桿菌標準陽性模板。本發(fā)明的第三方面，提供一種非診斷目的的檢測副結核分支桿菌的方法，步驟如下：(1)檢測樣本DNA的提取或檢測樣本的現(xiàn)場裂解處理；(2)以步驟(1)中處理的樣本為模板，篩選優(yōu)化引物和探針，進行RPA-nfo擴增；(3)用LFD檢測上述RPA-nfo擴增產物，根據(jù)檢測結果判定樣本中是否含有副結核分支桿菌。步驟(2)中，所述RPA-nfo擴增的體系為25μL：其中包括1.0μL(10μM)的正向引物，1.0μL(10μM)的反向引物，0.3μL(10μM)的探針，rehydration緩沖液14.75μL，待測樣本DNA或粗裂解產物2μL，ddH2O4.7μL；將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接在37℃恒溫水浴鍋處理25min。步驟(3)的具體步驟為：取RPA反應產物1μL與49μLLFD檢測緩沖液混合，將LFD垂直浸入，5min之內觀察結果，若同時出現(xiàn)檢測條帶和對照條帶，則該樣品中副結核分支桿菌核酸陽性；僅出現(xiàn)對照條帶則說明該樣品中不含副結核分支桿菌核酸，如果僅出現(xiàn)檢測條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測不成立。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明提供的RPA技術是最新的一種核酸體外擴增技術，在檢測時間上均優(yōu)于PCR和環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術，其反應在25min內就能從單個模板分子得到大約1012擴增產物。(2)本發(fā)明提供的副結核分支桿菌RPA-nfo檢測引物與探針組合以及試劑盒，最低可以檢測到8拷貝/反應的副結核分支桿菌DNA，RPA-LFD檢測引物與探針分別與牛分支桿菌、結核分枝桿菌、禽分枝桿菌、草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、非洲分支桿菌、布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、衣原體等細菌均無交叉反應，具有靈敏度高、特異性強的特性。(3)本發(fā)明提供的副結核分支桿菌RPA-nfo引物與探針組合以及試劑盒不僅可用于副結核分支桿菌分菌株的檢測，還可用于糞便、血液、奶樣等臨床樣本的檢測。(4)本發(fā)明提供的副結核分支桿菌RPA-LFD檢測方法使用方便，無需特殊儀器設備，借助恒溫水浴鍋，25min就能對待測樣本的粗裂解物進行副結核分支桿菌DNA的檢測，適合現(xiàn)場或基層副結核病的診斷工作。(5)使用本發(fā)明的試劑盒能夠有效診斷出副結核分枝桿菌，及時的發(fā)現(xiàn)副結核分枝桿菌陽性動物，為副結核病的防制提供技術保障。附圖說明構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。圖1：副結核分支桿菌RPA-nfo引物與探針的篩選，A：6對引物與探針的電泳圖，B：A圖對應引物與探針的LFD結果，其中，1：F1-R1-LF1(235bp和107bp)，2：F2-R1-LF1(213bp和107bp)，3：F3-R1-LF1(158bp和106bp)，4：F2-1-R2-LF2(259bp和161bp)，5：F2-2-R2-LF2(224bp和161bp)，6：F2-3-R2-LF2(200bp和161bp)。B圖中a：為4×104拷貝/μL副結核分支桿菌陽性質控標準品，b：是以pEASY-T3空載質粒的陰性對照。圖2：副結核分支桿菌RPA-LFD靈敏性檢測，其中1～7：模板分別為8×106～8×100拷貝/μL的陽性質控標準品，8：陰性對照，9：模板為ddH2O。圖3：副結核分支桿菌RPA-LFD特異性檢測，其中，1：模板為副結核分支桿菌4×104拷貝/μL的陽性質控標準品，2～11：模板分別為牛分支桿菌、結核分枝桿菌、禽分枝桿菌、非洲分支桿菌、草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、衣原體基因組DNA；12：陰性對照。圖4：副結核分支桿菌RPA-LFD重復性檢測，其中1、2、3：分別在三個獨立時間段進行的試驗，模板為副結核分支桿菌4×104拷貝/μL的陽性質控標準品，2是1檢測完1周后進行的重復性試驗，3是2檢測完1個月后進行的重復性試驗。圖5：副結核分支桿菌RPA-LFD臨床樣本的檢測，其中，+：模板為副結核分支桿菌4×104拷貝/μL的陽性質控標準品DNA，－：陰性對照組，1～9：副結核分支桿菌核酸陽性糞便DNA，11：副結核分支桿菌核酸陽性血清DNA，13～16：副結核分支桿菌核酸陽性血液DNA，18：副結核分支桿菌核酸陽性奶樣DNA，10、12、17、19：分別為副結核分支桿菌核酸陰性的糞便、血清、血液和奶樣DNA。具體實施方式應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬
技術領域：
的普通技術人員通常理解的相同含義。需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復數(shù)形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。正如
背景技術：
所介紹的，現(xiàn)有技術中還未有針對副結核分支桿菌進行RPA-LFD檢測的相關報道?；诖?，本發(fā)明提出了一種用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的引物、探針及試劑盒。在本申請的一種實施方案中，提供了一種用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針的序列如下所示：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探針：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。對于副結核分支桿菌而言，能夠作為靶標序列的保守基因的種類有多種，但以不同的保守基因區(qū)域設計的引物不同，對副結核分支桿菌的診斷和檢測的效果不同。本申請對用于設計引物的副結核分支桿菌的靶標序列進行了優(yōu)化篩選，結果發(fā)現(xiàn)，以IS900基因作為靶標序列設計RPA引物，可以提高檢測分析的特異性。另外，RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計，常規(guī)的PCR引物多半是不適用于RPA分析的，因為RPA引物比一般的PCR引物要長，通常需要達到30-35個堿基，引物過短會嚴重影響重組酶的活性，降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度；但長引物也并不一定能提高擴增性能，反而還會增加形成二級結構的可能性。另外，在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增的關鍵因素。但RPA的引物和探針設計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，目前還不能僅根據(jù)序列判斷引物的擴增性能，需要不斷的摸索條件進行優(yōu)化，通過設計多組候選引物進行測試和篩選，對于RPA引物的設計，目前，只有設計引物和探針的長度、GC含量等簡單信息，試驗表明，一個堿基的刪減都有可能影響RPA的擴增性能與成敗。RPA技術沒有相應的引物和探針的設計軟件，需要通過多次的試驗篩選和優(yōu)化。本申請在試驗過程中，設計了多組不同的引物和探針，并分別進行組合，經(jīng)RPA反應后分別檢測其特異性和擴增效率，以篩選最優(yōu)的可用于臨床檢測的引物和探針組合。結果發(fā)現(xiàn)，以上述的引物和探針組合對副結核分支桿菌進行檢測的特異性和靈敏度最優(yōu)。在本申請的另一種實施方案中，提供了一種用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合、陽性質控標準品、陰性質控標準品和RPA-nfo反應液。本申請通過將上述優(yōu)選的引物和探針組合設計成試劑盒，結合側流層析試紙條讀取檢測結果，方便對試驗樣品進行快速檢測。為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本申請的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本申請的技術方案。下面實施例中所用一些材料和試劑如下：副結核分枝桿菌C68604標準菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，非結核分枝桿菌標準菌株如非洲分支桿菌(ATCC26420)和恥垢分枝桿菌(ATCC607)來自山東省胸科醫(yī)院，牛分支桿菌(ATCC19210)、結核分枝桿菌H37Rv株、禽分枝桿菌標準菌株(ATCC25291)、非洲分支桿菌、布魯氏菌A19疫苗株、大腸桿菌K99株、沙門氏菌、衣原體等常見微生物核酸樣品由本實驗室保存；臨床上確診為副結核病陽性的糞便、血液、血清、奶樣DNA樣本等均由山東師范大學反芻動物疾病研究中心保存。引物與探針由上海生工生物有限公司合成。TwistAmpDNAAmplificationnfoKits購自TwistDX公司，側流層析試紙條(HybriDetectDipsticks)購自Milenia公司，pEASY-T3載體試劑盒和PCRmix購自北京全式金生物科技有限公司。其他生化試劑均為進口分裝或國產分析純。本發(fā)明實施例中所用的未進行具體說明試驗材料均為本領域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。實施例1：引物與探針的設計和篩選1.引物與探針的設計目前，RPA-nfo引物與探針的設計沒有具體操作規(guī)則，必須經(jīng)過RPA反應后檢測其特異性和擴增效率，才能篩選獲得可用于臨床檢測的引物與探針。試驗中需要從靶標序列兩端設計多對引物與探針進行優(yōu)化和篩選，個別堿基的替換或增減都會對實驗結果產生重要影響。本發(fā)明根據(jù)副結核分枝桿菌特異性的IS900基因(GengBankNo.S74401)設計正向引物、反向引物與探針，分別見表1，有6組引物與探針的RPA組合。設計引物時，首先在Genebank數(shù)據(jù)上BLAST了引物設計區(qū)域IS900基因的保守性，均與現(xiàn)有副結核分枝桿菌菌株序列100％匹配。再對設計的上下游引物和探針進行BLAST對比，結果發(fā)現(xiàn)均不與其他基因序列相匹配，保證了引物序列的特異性。表1引物對與探針序列注：Biotin：生物素標記；FAM：羧基熒光素標記；dSpacer：核苷酸堿基類似物，是nfo核酸酶切割位點；C3-Spacer：聚合酶延伸阻斷物。2.利用RPA-nfo擴增反應篩選引物和探針通過建立副結核分支桿菌RPA-LFD檢測方法，利用RPA-nfo擴增反應對引物和探針進行篩選，具體步驟如下：(1)陽性質控標準品的制備：①模板DNA的提?。簩Ω苯Y核分支桿菌標準菌株應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。②PCR擴增：以提取的DNA為模板，用如下引物進行擴增：IS900-S：5'-ATCAGCGCGGCACGGCTCTTG-3'，IS900-A：5'-CGGGTAGTTACCGCGGCGAAG-3'反應體系為50μL，包括2×PCRmix：25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH2O19μL。反應條件為：94℃3min，94℃30sec、60℃30sec、72℃25sec，35個循環(huán)，72℃10min。③重組質粒的構建及陽性質控標準品的建立：將PCR產物進行凝膠純化回收，然后連接pEASY-T3載體，轉化，提取質粒后雙酶切鑒定，將陽性重組質粒進行測序，并進行序列比對。序列正確的重組質粒命名為pEAST-T3-IS900，將上述陽性質粒用紫外分光光度計測定濃度，為160ng/μL，按照下述公式計算出每μL質粒中的DNA拷貝數(shù)，結果為4×1010拷貝/μL，將這個陽性質粒作為陽性質控標準品。拷貝數(shù)(copies/μL)＝質粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質?？傞L度)(2)陰性質控標準品：陰性質控標準品為pEASY-T3空載質粒。(3)副結核分枝桿菌RPA-nfo反應體系的建立RPA-nfo反應體系為25μL：將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接置于37℃恒溫水浴鍋反應25min。反應結束后取1μL與49μLLFD檢測緩沖液混合，將LFD垂直浸入上述混合緩沖液，5min之內觀察結果，通過試紙條的顯示進行判讀。若同時出現(xiàn)檢測條帶和對照條帶，則該樣品中副結核分枝桿菌核酸陽性；僅出現(xiàn)對照條帶則說明該樣本中不含副結核分枝桿菌核酸，如果僅出現(xiàn)檢測條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測不成立。3.引物和探針的篩選結果RPA技術屬于新興的核酸擴增技術，目前尚無副結核分枝桿菌RPA檢測的相關報道，現(xiàn)有分子生物學技術如LAMP等的副結核分枝桿菌相關的引物和探針并不一定適用于RPA，其引物和探針的設計原理和規(guī)則與PCR等擴增技術也不相同，需經(jīng)過大量實驗驗證和分析。對表1中的6組副結核分支桿菌RPA-nfo引物與探針組合分別進行RPA-LFD檢測篩選，優(yōu)化出1組最優(yōu)的引物和探針組合，結果如圖1所示，3：為最優(yōu)引物與探針組合擴增結果。其他組也出現(xiàn)了檢測條帶，但在反應模板和反應條件相同的情況下，3的檢測條帶最亮，說明擴增效率最高，3的引物與探針組合擴增效率高于其他組合。最優(yōu)的引物與探針序列見表1中IS900-F2、IS900-R1、IS900-LF1，分別為本發(fā)明提供的SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的引物序列，本發(fā)明在進行副結核分支桿菌DNA的檢測時，靈敏度高、特異性強、重復性好(圖1)。副結核分支桿菌RPA-LFD檢測方法的靈敏性、特異性和重復性考察1.試驗方法：(1)副結核分枝桿菌RPA-LFD靈敏性檢測將陽性質控標準品以10倍倍比稀釋成8×106～8×100拷貝/μL，在RPA-nfo反應管中加入2μL，以本發(fā)明實施例1篩選得到的引物與探針按照上述實施例1中步驟(3)進行RPA-nfo擴增，同時以pEASY-T3空載質粒為陰性對照，檢驗本方法的靈敏性。(2)副結核分枝桿菌RPA-LFD特異性檢測以本發(fā)明實施例1篩選得到的引物與探針分別對牛分支桿菌、結核分枝桿菌、禽分枝桿菌、非洲分支桿菌、草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、衣原體基因組DNA進行擴增，4×104拷貝/μL的副結核分枝桿菌陽性質控標準品DNA為陽性對照模板，同時以pEASY-T3空載質粒為陰性對照，驗證本方法的特異性。(3)副結核分枝桿菌RPA-LFD重復性檢測以本發(fā)明實施例1篩選得到的引物與探針對4×104拷貝/μL的副結核分枝桿菌陽性質控標準品DNA、pEASY-T3空載質粒進行RPA-LFD檢測，分別在三個不同時間段進行重復性試驗，首次檢測、第2和第3次分別間隔1周和1個月后進行，驗證本方法的重復性。2.試驗結果(1)靈敏性考察結果以10倍倍比稀釋的7個梯度的副結核分枝桿菌陽性質控標準品DNA為模板進行檢測，結果如圖2所示，25μL體系的RPA-LFD檢測限為8拷貝/反應。說明本發(fā)明提供的引物、探針及其檢測方法的靈敏性高。(2)特異性考察結果以6種分支桿菌和4株其他細菌作為對照菌株，分別進行RPA-LFD檢測，結果如圖3所示，只有以副結核分枝桿菌DNA為模板的RPA-nfo反應管在LFD的檢測線處出現(xiàn)條帶，為陽性結果；而其它細菌菌株以及pEASY-T3空載質粒均未出現(xiàn)檢測條帶，均出現(xiàn)對照條帶。說明本發(fā)明提供的副結核分枝桿菌RPA-nfo引物與探針組合能特異性檢測副結核分枝桿菌，與其他細菌均無交叉反應。(3)重復性考察結果在3個不同時間段進行重復性試驗，分別以4×104拷貝/μL的副結核分枝桿菌DNA為模板進行擴增，檢測結果一致，結果如圖4所示，說明本發(fā)明提供的引物、探針以及陽性質控標準品重復性好，可操作性強。需要說明的是，本發(fā)明的副結核分枝桿菌RPA-LFD檢測方法之所以具有靈敏性高(檢測限達8拷貝/反應)、特異性強和重復性好等優(yōu)勢，是基于特殊的靶標(IS900基因)設計RPA引物，并對RPA引物進行優(yōu)化篩選而實現(xiàn)的。首先根據(jù)特殊的靶標設計RPA引物能夠實現(xiàn)對副結核分枝桿菌的特異性檢測；目前已報道的用于副結核分枝桿菌檢測的保守基因序列有多個，但如何從眾多的保守基因序列中選擇靶標進行RPA引物設計是方案設計的難點所在。其次RPA的引物和探針設計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，目前還不能僅根據(jù)序列判斷引物的擴增性能，需要不斷的摸索條件進行優(yōu)化。第三，通過不同的探針結合到模板互補鏈后再通過核酸內切酶IV(nfo)切割掉3'端阻止序列，也會影響副結核分枝桿菌RPA-LFD檢測的效果。本申請在實驗過程中以不同的保守基因作為靶標區(qū)域，設計了多組RPA引物，但在檢測過程中有出現(xiàn)與其他細菌之間的交叉反應，檢測的特異性不如以IS900基因作為靶標設計的RPA引物。本申請還以IS900基因作為靶標設計了多組RPA引物，為與LFD技術相結合，另外設計了不同的探針序列，通過不同的引物和探針的組合，考察檢測的靈敏度，結果發(fā)現(xiàn)，不同引物和探針的組合，其檢測的靈敏度相差較大，以本發(fā)明實施例1中篩選和優(yōu)化得到的引物和探針組合的檢測靈敏度最優(yōu)。實施例3：用于副結核分支桿菌檢測的試劑盒1.試劑盒的組成：實施例1篩選的引物和探針組合，陽性質控標準品、陰性質控標準品，rehydration緩沖液，醋酸鎂(280mM)、ddH2O和側流層析試紙條。2.擴增體系及檢測方法：RPA-nfo反應體系為25μL：將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接置于37℃恒溫水浴鍋反應25min。反應結束后取1μL與49μLLFD檢測緩沖液混合，將LFD垂直浸入上述混合緩沖液，5min之內觀察結果，通過試紙條的顯示進行判讀。若同時出現(xiàn)檢測條帶和對照條帶，則該樣品中副結核分枝桿菌核酸陽性；僅出現(xiàn)對照條帶則說明該樣本中不含副結核分枝桿菌核酸，如果僅出現(xiàn)檢測條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測不成立。實施例4：副結核分枝桿菌RPA-LFD檢測方法的應用1.實驗步驟(1)臨床樣本的現(xiàn)場制備將糞便、奶樣離心沉淀等臨床樣本用200μLTE緩沖液[1.0MTris-HCl(pH8.0)10mL，0.5MNa2EDTA·2H2O(pH8.0)2mL，加蒸餾水至1000mL]重懸，血液、血清等液體樣本直接取200μL，然后加入30μL10％(w/v)SDS和3μL2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃溫育1h，期間上下顛倒數(shù)次。(2)臨床樣本的檢測按照步驟(1)中臨床樣本現(xiàn)場裂解處理的方法，分別對本實驗室保存的已經(jīng)用副結核分枝桿菌特異性PCR引物擴增后測序正確的9份糞便樣本，1份血清樣本，4份血液樣本以及1份奶樣樣本，進行副結核分枝桿菌RPA-LFD檢測，同時將上述不同類型樣本各取1份陰性樣本進行處理，以4×104拷貝/μL副結核分枝桿菌DNA和pEASY-T3空載質粒分別為陽性、陰性對照。同時以本實驗室建立的副結核分枝桿菌SYBRGreenI熒光定量PCR和LAMP檢測方法為對照進行10份糞便樣本的檢測。2.試驗結果對本實驗室確診的10份糞便、2份血清、5份血液、2份奶樣樣本，應用本發(fā)明實施例3的試劑盒中提供的副結核分枝桿菌RPA-nfo引物與探針進行檢測，結果見圖5，檢測結果與測序確診的結果均一致。以上結果充分說明用本發(fā)明提供的副結核分枝桿菌RPA-LFD引物、探針組合以及試劑盒可用于不同臨床樣本的檢測，該方法具有較高的靈敏度和特異性，最重要的是可以對臨床糞便、奶樣等樣本直接進行現(xiàn)場快速的診斷。3.結果對比以SYBRGreenI熒光定量PCR和LAMP檢測方法為對照，進行10份糞便臨床樣本的檢測。將上述10份糞便臨床樣本(9個陽性樣本，1個陰性樣本)分別采用SYBRGreenI熒光定量PCR、LAMP快速檢測和RPA-LFD檢測，對比結果如下：表2：對比結果SYBRGreenI熒光定量PCRLAMP快速檢測RPA-LFD檢測陽性989陰性121由上述對比結果可以看出，采用本申請的RPA-LFD檢測方法與LAMP快速檢測相比，其檢測的準確性更高，無假陽性或假陰性的檢測結果；與SYBRGreenI熒光定量PCR相比，本申請的RPA-LFD檢測無需特殊儀器設備，只需借助恒溫水浴鍋，25min能對待測樣本的粗裂解物進行副結核分支桿菌DNA的靈敏、特異、快速地檢測，適合現(xiàn)場或基層實驗條件差的地區(qū)副結核病的診斷工作。以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>山東師范大學<120>用于現(xiàn)場快速檢測副結核分支桿菌的引物、探針及試劑盒<130>2017<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgtcgttggccacccgctgcgagagcaat30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>2actcgaccgctaattgagagatgcgattg29<210>3<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>3ccacaaccacctccgtaaccgtcattgtcagatcaacccagcagac46<210>4<211>259<212>DNA<213>人工序列<400>4atcagcgcggcacggctcttgttgtagtcgaaggcgcgttccagcgccgaaagtattcca60gcagctgggcgcgcattcggttcgatcgcccgggtccgatcagccaccagatcggaacgt120cggctggtcaggatgcgcagctcgactgcgatgtcatcgccggcgcgcagaggctgcaag180tcgtggcgcatccgggcctgatcggcgatgatcgcagcgtctttggcgtcggtcttgcct240tcgccgcggtaactacccg259當前第1頁1 2 3