本發(fā)明屬于病原微生物檢測領(lǐng)域，具體的涉及一種養(yǎng)殖水產(chǎn)動物中常見的病原菌：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種革蘭氏陰性的嗜鹽弧菌，在海水、海產(chǎn)品和食物中的檢出率較高，其為海洋中正常菌群之一，存在于多種海洋動物中，是魚蝦貝等海水養(yǎng)殖動物的條件致病菌，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。溶藻弧菌也能引起人體傷口感染和敗血癥。近年來，溶藻弧菌引起食物中毒和胃腸炎的報道屢見不鮮，癥狀主要表現(xiàn)為不同程度的頭痛、頭暈、乏力、腹痛、惡心等消化道癥狀。因此，溶藻弧菌作為一種致腹瀉菌和影響食品安全的病原菌日益受到重視。

目前國內(nèi)外對溶藻弧菌檢測方法主要有細菌生化方法、免疫學檢測方法、變性高效液相色譜、環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)、分子生物檢測法。但存在著檢測方法復雜，靈敏性差等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR檢測方法。本發(fā)明的方法可快速鑒定致病源，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的安全和水產(chǎn)食品進出口安全提供技術(shù)支持。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)溶藻弧菌的PCR檢測方法，方法如下：

1)提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA；

2)以所提取的DNA為模板，采用溶藻弧菌特異性引物，進行PCR擴增；所述的溶藻

弧菌特異性引物是針對溶藻弧菌的topA基因的特異性引物P1、toxR基因的特異性引

物P2、toxR基因的特異性引物P3；

所述的特異性引物P1的序列為：P1-F:TCGCTTCATGGACCGTGTC；P1-R:GGCGCTTAGGTTAGTCGAGT。

所述的特異性引物P2的序列為：P2-F:CTGACGTTGAAGAAGCCACTT；P2-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT。

所述的特異性引物P3的序列為：P3-F:CCTAAACGCGGTTATCAACTCA；P3-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT。

PCR反應條件：第一階段：94℃5min；

第二階段：94℃30s，60℃或69℃30s，72℃30s；30循環(huán)；

第三階段：72℃5min；

第四階段：4℃保存。

3)根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷水產(chǎn)養(yǎng)殖動物是否被溶藻弧菌感染。

判斷標準為：

針對特異性引物P1，如果PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果有484bp條帶產(chǎn)生，則水產(chǎn)養(yǎng)殖動物被溶藻弧菌感染，否則沒有被感染。

針對特異性引物P2，如果PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果有286bp條帶產(chǎn)生，則大菱鲆被溶藻弧菌感染，否則沒有被感染。

針對特異性引物P3，如果PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果有353bp條帶產(chǎn)生，則海參被溶藻弧菌感染，否則沒有被感染。

上述的一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)溶藻弧菌的PCR檢測方法，所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物為大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦或三文魚。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明，設(shè)計的溶藻弧菌特異性引物，能有效從各常見致病菌株中區(qū)分出溶藻弧菌，表現(xiàn)出很強的特異性。

2.本發(fā)明，設(shè)計的溶藻弧菌特異性引物，靈敏性高，可有效檢出養(yǎng)殖水產(chǎn)品動物體內(nèi)殘留的溶藻弧菌，其最低檢測濃度可達到10^-5ng/ul。

3.本發(fā)明，所提供的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留溶藻弧菌的PCR檢測方法，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留溶藻弧菌檢測更為簡便。在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中，一旦存在病原菌溶藻弧菌，即能夠做到快速鑒定，為我國水產(chǎn)品進出口提供有效的檢查方法。

4.本發(fā)明的檢測方法可有效檢出水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的高危致病菌溶藻弧菌，經(jīng)驗證此檢測方法特異性強，靈敏度高。該檢測方法的確立為今后水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留病原菌溶藻弧菌的檢測和分析提供了必要的理論依據(jù)和完善的方法體系，不僅為我國水產(chǎn)品進出口食品安全提供技術(shù)支持，同時為我國養(yǎng)殖水產(chǎn)品食品安全健康發(fā)展做出了貢獻。

附圖說明

圖1是實施例1溶藻弧菌特異性引物P1的PCR反應條件優(yōu)化；

其中，M:Marker D，1-5:退火溫度分別為65℃，66℃，67℃，68℃，69℃。

圖2是實施例1溶藻弧菌特異性引物P1的特異性驗證；

其中，1.Vibrio furnissi；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio hollisae；4.Vibrio parahemolyticus5.Vibrio harveyi；6.Vibrio fluvialis；7.Vibrio campbellii；8.Vibrio alginolyticus；9.Vibrio metschnikovii；10.Vibrio mimicus；11.Vibrio cyclitrophicus；12.Aeromonas hydrophila；13.Aeromonas salmonicida；14.Aeromonas sobria 15.Aeromonas veronii 16.Pseudomonas helmanticensis；17.Pseudomonas aeruginosa；18.Pseudomonas kilonensis，M:Marker D。

圖3是實施例1溶藻弧菌特異性引物P1的PCR反應靈敏性驗證。

其中，M:Marker D，1-7:模板濃度分別為10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul，10^-5ng/ul。

圖4是實施例1溶藻弧菌特異性引物P1對不同水產(chǎn)養(yǎng)殖動物PCR擴增產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果；

其中，M:Marker D，1-7分別為注射0.1ml溶藻弧菌菌液的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織；8-14分別為注射0.90％生理鹽水的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織。

圖5是實施例2溶藻弧菌特異性引物P2的PCR反應條件優(yōu)化；

其中，M:Marker DL 2000，1-5:退火溫度分別為56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。

圖6是實施例2溶藻弧菌特異性引物P2的特異性驗證；

其中，1.Vibrio furnissi；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio hollisae；4.Vibrio parahemolyticus；5.Vibrio harveyi；6.Vibrio fluvialis；7.Vibrio alginolyticus；8.Vibrio campbellii；9.Vibrio metschnikovii；10.Vibrio mimicus 11.Vibrio gigantis；12.Vibrio cyclitrophicus；13.Aeromonas hydrophila；14.Aeromonas salmonicida；15.Aeromonas veronii；16.Pseudomonas helmanticensis；17.Pseudomonas aeruginosa 18.Pseudomonas kilonensis；19.Bordetella trematum；M:Marker DL 2000。

圖7是實施例2溶藻弧菌特異性引物P2的PCR反應靈敏性驗證。

其中，M:Marker D，1-7:模板濃度分別為10²ng/ul，10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul。

圖8是實施例2溶藻弧菌特異性引物P2對大菱鲆人工感染溶藻弧菌PCR擴增產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果；

其中，M:Marker D，1-7分別為注射0.1ml溶藻弧菌菌液的大菱鲆肌肉組織，8-14分別為注射0.90％生理鹽水的大菱鲆肌肉組織。

圖9是實施例3溶藻弧菌特異性引物P3的PCR反應條件優(yōu)化；

其中，M:Marker DL 2000，1-5:退火溫度分別為56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。

圖10是實施例3溶藻弧菌特異性引物P3的特異性驗證；

其中，1.Vibrio furnissi；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio parahemolyticus；4.Vibrio hollisae；5.Vibrio harveyi；6.Vibrio fluvialis；7.Vibrio campbellii；8.Vibrio alginolyticus；9.Vibrio metschnikovii；10.Vibrio mimicus 11.Vibrio gigantis；12.Vibrio cyclitrophicus；13.Aeromonas hydrophila；14.Aeromonas salmonicida；15.Aeromonas veronii；16.Pseudomonas helmanticensis；17.Pseudomonas aeruginosa 18.Pseudomonas kilonensis；19.Bordetella trematum；M:Marker DL 2000。

圖11是實施例3溶藻弧菌特異性引物P3的PCR反應靈敏性驗證。

其中，M:Marker D，1-7:模板濃度分別為10²ng/ul，10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul。

圖12是實施例3溶藻弧菌特異性引物P3對海參人工感染溶藻弧菌PCR擴增產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果；

其中，M:Marker D，1-7分別為注射0.1ml溶藻弧菌菌液的海參組織，8-14分別為注射0.90％生理鹽水的海參組織。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實施例1

(一)溶藻弧菌特異性引物P1的設(shè)計

本實施例針對菌種溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的topA基因，利用軟件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6軟件，設(shè)計出對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)具有特異性強且靈敏性高的一對特異性引物P1，該溶藻弧菌特異性引物的具體信息如表1所示。

表1

(二)溶藻弧菌特異性引物P1最佳PCR反應條件的探索

1、溶藻弧菌DNA的提取

使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒(細菌)，提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的DNA，具體步驟如下：

1.1)取1ml過夜培養(yǎng)的含有菌種溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的菌液，加入1.5ml離心管中，室溫8000rmp離心1min，棄上清，收集菌體，加入180ul Buffer Digestion，再加入20ul Proteinase K溶液，震蕩混勻。56℃水浴1h至細胞完全裂解。水浴過程中，每10分鐘顛倒混勻一次，促進細胞裂解。

1.2)加入200ul Buffer BD，充分顛倒混勻。加入Buffer BD后，如有沉淀產(chǎn)生，可70℃水浴10分鐘。

1.3)加入200ul的無水乙醇，充分顛倒混勻。加入無水乙醇后可能產(chǎn)生半透明纖維狀懸浮物，不影響DNA的提取和應用。

1.4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟1.3)獲得的溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。

1.5)將吸附柱重新放回收集管中，加入500ul PW Solution，10000rmp離心30s，倒掉收集管濾液。

1.6)將吸附柱重新放回收集管，加入500ul Wash Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾液。

1.7)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室溫離心2min，棄去殘留的Wash Solution。將吸附柱打開蓋子于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的Wash Solution，Wash Solution的殘留會影響基因組DNA的產(chǎn)量和后續(xù)的實驗。

1.8)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50-200ul CE Buffer靜置3min，12000rmp室溫離心2min，收集DNA溶液，即為溶藻弧菌的DNA。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20℃保存。

2、溶藻弧菌特異性引物P1最佳退火溫度的探索

分別以提取的溶藻弧菌的DNA為模板做PCR擴增，并將目的引物的退火溫度分別設(shè)置為65℃、66℃、67℃、68℃、69℃，PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，根據(jù)PCR后的凝膠電泳結(jié)果確定溶藻弧菌特異性引物的最佳退火溫度。具體PCR反應條件和體系如表2所示，結(jié)果如圖1。

表2目的引物最佳PCR反應探索條件

由圖1可見，溫度對該引物并無明顯影響，但根據(jù)PCR基本原則，溫度越高越有利于引物的特異性結(jié)合，故確定最佳退火溫度為69℃。

(三)溶藻弧菌特異性引物P1的特異性探索

1、待試菌株DNA的提取

使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒(細菌)，分別提取如表3所示的不同菌種的DNA，具體步驟如上述(二)中步驟1。

2、特異性探索

分別以表3中，提取的不同菌種的DNA為模板做PCR擴增，具體PCR反應條件和體系如表4所示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

表3待試菌株如下：

表4目的引物最佳PCR反應條件

由圖2可見，本發(fā)明的溶藻弧菌特異性引物在弧菌屬內(nèi)，以及氣單胞菌屬和假單胞菌屬內(nèi)均表現(xiàn)出很強的特異性，只能和目的菌株溶藻弧菌產(chǎn)生特異性擴增，而非目的菌株未產(chǎn)生特異性擴增。故可見其表現(xiàn)出很強的特異性。

(四)溶藻弧菌特異性引物P1的靈敏性的探索

1、溶藻弧菌DNA的提取

使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒(細菌)，提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌種的DNA，具體步驟如上述(二)中步驟1。

2、靈敏性的探索

將溶藻弧菌的DNA濃度調(diào)至10¹ng/ul，并且依次稀釋為10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul、10^-5ng/ul，分別取1ul DNA作為PCR反應模板，具體PCR反應條件和體系如表5所示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。

表5目的引物最佳PCR反應探索條件

由圖3可見，本發(fā)明的溶藻弧菌特異性引物在溶藻弧菌DNA濃度為10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul、10^-5ng/ul、時均可產(chǎn)生特異性擴增，其最低檢測濃度可達到10^-5ng/ul。

(五)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)溶藻弧菌的PCR檢測方法

1、提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA；

使用Ezup柱氏動物基因組DNA抽提試劑盒，提取水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的DNA，具體步驟如下：

1.1)分別取約未注射溶藻弧菌和注射0.1ml溶藻弧菌菌懸液的25mg水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml離心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震蕩混勻。56℃水浴1h至細胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分顛倒混勻。加入Buffer CL后，如有沉淀產(chǎn)生，可70℃水浴10分鐘。

1.3)加入200ul的無水乙醇，充分顛倒混勻。加入無水乙醇后可能產(chǎn)生半透明纖維狀懸浮物，不影響DNA的提取和應用。

1.4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟1.3)獲得的溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。

1.5)將吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp離心30s，倒掉收集管濾液。

1.6)將吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾液。

1.7)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室溫離心2min，棄去殘留的CW2 Solution。將吸附柱打開蓋子于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的CW2 Solution，CW2 Solution的殘留會影響基因組DNA的產(chǎn)量和后續(xù)的實驗。

1.8)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50-200ul CE Buffer靜置3min，12000rmp室溫離心2min，收集DNA溶液，即為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織的總DNA。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20℃保存。

2、PCR方法擴增

以提取的DNA為模板，采用溶藻弧菌特異性引物P1，利用PCR方法擴增，得到PCR產(chǎn)物；

P1-F:TCGCTTCATGGACCGTGTC

P1-R:GGCGCTTAGGTTAGTCGAGT

PCR反應條件：第一階段：94℃5min；

第二階段：94℃30s，69℃30s，72℃30s；30循環(huán)；

第三階段：72℃5min；

第四階段：4℃保存。

3、PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，如圖4所示。

M:Marker D，1-7分別為注射0.1ml溶藻弧菌菌液的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織；8-14分別為注射0.90％生理鹽水的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織。

4、判斷標準：根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷該引物實際檢測效果；如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結(jié)果有484bp條帶產(chǎn)生，則實際檢測效果良好。如果瓊脂糖凝膠未呈現(xiàn)結(jié)果有484bp條帶產(chǎn)生，則實際檢測效果不理想。

由圖4可見，注射0.1ml溶藻弧菌菌液的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織(1-7)均產(chǎn)生484bp大小條帶，而注射0.90％生理鹽水的大菱鲆、海參、泥鰍魚、螃蟹、爬蝦、青蝦、三文魚組織(8-14)未產(chǎn)生484bp大小條帶，由此可見，本發(fā)明根據(jù)溶藻弧菌topA基因所設(shè)計的特異性引物具有較好的檢測能力，可應用到實際檢測中。

實施例2

(一)溶藻弧菌特異性引物的設(shè)計

本實施例針對菌種溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的toxR基因，利用軟件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6軟件，設(shè)計出對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)具有特異性強且靈敏性高的一對特異性引物P2，該溶藻弧菌特異性引物的具體信息如表6所示。

表6

(二)溶藻弧菌特異性引物P2最佳PCR反應條件的探索

1、溶藻弧菌DNA的提?。和瑢嵤├?

2、溶藻弧菌特異性引物P2最佳退火溫度的探索

分別以提取的溶藻弧菌的DNA為模板做PCR擴增，并將目的引物的退火溫度分別設(shè)置為56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，根據(jù)PCR后的凝膠電泳結(jié)果確定溶藻弧菌特異性引物P2的最佳退火溫度。具體PCR反應條件和體系如表7所示，結(jié)果如圖5。

表7目的引物最佳PCR反應探索條件

由圖5可見，溫度對該引物并無明顯影響，但根據(jù)PCR基本原則，溫度越高越有利于引物的特異性結(jié)合，故確定最佳退火溫度為60℃。

(三)溶藻弧菌特異性引物片的特異性探索

1、待試菌株DNA的提取

使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒(細菌)，分別提取如表8所示的不同菌種的DNA，具體步驟如實施例1的(二)中步驟1。

2、特異性探索

分別以表8中，提取的不同菌種的DNA為模板做PCR擴增，具體PCR反應條件和體系如表9所示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。

表8待試菌株如下：

表9目的引物最佳PCR反應條件

由圖6可見，本發(fā)明的溶藻弧菌特異性引物在弧菌屬內(nèi)，以及氣單胞菌屬和假單胞菌屬內(nèi)均表現(xiàn)出很強的特異性，只能和目的菌株溶藻弧菌產(chǎn)生特異性擴增，而非目的菌株未產(chǎn)生特異性擴增。故可見其表現(xiàn)出很強的特異性。

(四)溶藻弧菌特異性引物P2的靈敏性的探索

1、溶藻弧菌DNA的提?。和瑢嵤├?

2、靈敏性的探索

將溶藻弧菌的DNA濃度調(diào)至10²ng/ul，并且依次稀釋為10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul，分別取1ul DNA作為PCR反應模板，具體PCR反應條件和體系如表10所示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖7所示。

表10目的引物最佳PCR反應探索條件

由圖7可見，本發(fā)明的溶藻弧菌特異性引物在溶藻弧菌DNA濃度為10²ng/ul、10¹ng/ul、10^-1ng/ul時均可產(chǎn)生特異性擴增，其最低檢測濃度可達到10^-1ng/ul。

(五)大菱鲆養(yǎng)殖過程中溶藻弧菌的PCR檢測

1、提取大菱鲆組織的總DNA

使用Ezup柱氏動物基因組DNA抽提試劑盒，提取大菱鲆組織的DNA，具體步驟如下：

1.1)分別取約未注射溶藻弧菌和注射0.1ml溶藻弧菌菌懸液的25mg大菱鲆組織，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml離心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震蕩混勻。56℃水浴1h至細胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分顛倒混勻。加入Buffer CL后，如有沉淀產(chǎn)生，可70℃水浴10分鐘。

1.3)加入200ul的無水乙醇，充分顛倒混勻。加入無水乙醇后可能產(chǎn)生半透明纖維狀懸浮物，不影響DNA的提取和應用。

1.4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟1.3)獲得的溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。

1.5)將吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp離心30s，倒掉收集管濾液。

1.6)將吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾液。

1.7)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室溫離心2min，棄去殘留的CW2 Solution。將吸附柱打開蓋子于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的CW2 Solution，CW2 Solution的殘留會影響基因組DNA的產(chǎn)量和后續(xù)的實驗。

1.8)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50-200ul CE Buffer靜置3min，12000rmp室溫離心2min，收集DNA溶液，即為大菱鲆組織的總DNA。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20℃保存。

2、PCR方法擴增

以提取的DNA為模板，采用溶藻弧菌特異性引物P2，利用PCR方法擴增，得到PCR產(chǎn)物；

P2-F:CTGACGTTGAAGAAGCCACTT

P2-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT

PCR反應條件：第一階段：94℃5min；

第二階段：94℃30s，60℃30s，72℃30s；30循環(huán)；

第三階段：72℃5min；

第四階段：4℃保存。

3、PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，如圖8所示。

4、判斷標準：根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷該引物實際檢測效果；如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結(jié)果有286bp條帶產(chǎn)生，則實際檢測效果良好。如果瓊脂糖凝膠未呈現(xiàn)結(jié)果有286bp條帶產(chǎn)生，則實際檢測效果不理想。

由圖8可見，注射0.1ml溶藻弧菌菌液的大菱鲆組織(1-7)均產(chǎn)生286bp大小條帶，而注射0.90％生理鹽水的大菱鲆組織(8-14)未產(chǎn)生286bp大小條帶，由此可見，本發(fā)明根據(jù)溶藻弧菌toxR基因所設(shè)計的特異性引物具有較好的檢測能力，可應用到實際檢測中.

實施例3

(一)溶藻弧菌特異性引物的設(shè)計

本實施例針對菌種溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的toxR基因，利用軟件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6軟件，設(shè)計出對溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)具有特異性強且靈敏性高的一對特異性引物P3，該溶藻弧菌特異性引物的具體信息如表11所示。

表11

(二)溶藻弧菌特異性引物P3最佳PCR反應條件的探索

1、溶藻弧菌DNA的提?。和瑢嵤├?。

2、溶藻弧菌特異性引物P3最佳退火溫度的探索

分別以提取的溶藻弧菌的DNA為模板做PCR擴增，并將目的引物的退火溫度分別設(shè)置為56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，根據(jù)PCR后的凝膠電泳結(jié)果確定溶藻弧菌特異性引物的最佳退火溫度。具體PCR反應條件和體系如表12所示，結(jié)果如圖9。

表12目的引物最佳PCR反應探索條件

由圖9可見，溫度對該引物并無明顯影響，但根據(jù)PCR基本原則，溫度越高越有利于引物的特異性結(jié)合，故確定最佳退火溫度為60℃。

(三)溶藻弧菌特異性引物P3的特異性探索

1、待試菌株DNA的提取

使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒(細菌)，分別提取如表13所示的不同菌種的DNA，具體步驟如實施例1的(二)中步驟1。

2、特異性探索

分別以表13中，提取的不同菌種的DNA為模板做PCR擴增，具體PCR反應條件和體系如表14所示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖10所示。

表13待試菌株如下：

表14目的引物最佳PCR反應條件

由圖10可見，本發(fā)明的溶藻弧菌特異性引物在弧菌屬內(nèi)，以及氣單胞菌屬和假單胞菌屬內(nèi)均表現(xiàn)出很強的特異性，只能和目的菌株溶藻弧菌產(chǎn)生特異性擴增，而非目的菌株未產(chǎn)生特異性擴增。故可見其表現(xiàn)出很強的特異性。

(四)溶藻弧菌特異性引物的靈敏性的探索

1、溶藻弧菌DNA的提?。和瑢嵤├?

2、靈敏性的探索

將溶藻弧菌的DNA濃度調(diào)至10²ng/ul，并且依次稀釋為10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul，分別取1ul DNA作為PCR反應模板，具體PCR反應條件和體系如表15所示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖11所示。

表15目的引物最佳PCR反應探索條件

由圖11可見，本發(fā)明的溶藻弧菌特異性引物在溶藻弧菌DNA濃度為10²ng/ul、10¹ng/ul、10⁰ng/ul時均可產(chǎn)生特異性擴增，其最低檢測濃度可達到10⁰ng/ul。

(五)海參養(yǎng)殖過程中溶藻弧菌的PCR檢測方法

1、提取海參組織的總DNA；

使用Ezup柱氏動物基因組DNA抽提試劑盒，提取海參組織的DNA，具體步驟如下：

1.1)分別取約未注射溶藻弧菌和注射0.1ml溶藻弧菌菌懸液的25mg海參組織，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml離心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震蕩混勻。56℃水浴1h至細胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分顛倒混勻。加入Buffer CL后，如有沉淀產(chǎn)生，可70℃水浴10分鐘。

1.3)加入200ul的無水乙醇，充分顛倒混勻。加入無水乙醇后可能產(chǎn)生半透明纖維狀懸浮物，不影響DNA的提取和應用。

1.4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟1.3)獲得的溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫離心1min，倒掉收集管中的廢液。

1.5)將吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp離心30s，倒掉收集管濾液。

1.6)將吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾液。

1.7)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室溫離心2min，棄去殘留的CW2 Solution。將吸附柱打開蓋子于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的CW2 Solution，CW2 Solution的殘留會影響基因組DNA的產(chǎn)量和后續(xù)的實驗。

1.8)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50-200ul CE Buffer靜置3min，12000rmp室溫離心2min，收集DNA溶液，即為海參組織的總DNA。提取的DNA可立即進行下一步實驗或-20℃保存。

2、PCR方法擴增

以提取的DNA為模板，采用溶藻弧菌特異性引物P3，利用PCR方法擴增，得到PCR產(chǎn)物；

P3-F:CCTAAACGCGGTTATCAACTCA

P3-R:GGCGTCATCACAGGTACATTTT

PCR反應條件：第一階段：94℃5min；

第二階段：94℃30s，60℃30s，72℃30s；30循環(huán)；

第三階段：72℃5min；

第四階段：4℃保存。

3、PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄，如圖12所示。

4、判斷標準：根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷該引物實際檢測效果；如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結(jié)果有353bp條帶產(chǎn)生，則實際檢測效果良好。如果瓊脂糖凝膠未呈現(xiàn)結(jié)果有353bp條帶產(chǎn)生，則實際檢測效果不理想。

由圖12可見，注射0.1ml溶藻弧菌菌液的海參組織(1-7)均產(chǎn)生353bp大小條帶，而注射0.90％生理鹽水的海參組織(8-14)未產(chǎn)生353bp大小條帶，由此可見，本發(fā)明根據(jù)溶藻弧菌toxR基因所設(shè)計的特異性引物具有較好的檢測能力，可應用到實際檢測中。