本發(fā)明涉及玉米粗縮病病原的快速檢測技術(shù)及其在病害診斷和測報(bào)上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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玉米粗縮病(Maize rough dwarf disease，MRDD)在我國病原物為水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，屬于呼腸孤病毒科斐濟(jì)病毒屬第二組成員，以灰飛虱為主要傳毒介體進(jìn)行持久性傳播，灰飛虱一旦染毒，終身帶毒，并能連續(xù)傳毒，但不經(jīng)卵傳毒。自然條件下，主要寄主有水稻、玉米、大麥、小麥、高粱、粟、看麥娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。感染玉米粗縮病玉米植株的典型癥狀為植株矮縮，葉色濃綠，葉片僵直、寬短而厚，葉背面出現(xiàn)蠟白色短條狀突起，后期變褐色，籽粒較少或不結(jié)籽粒。自1954年在新疆和甘肅省發(fā)現(xiàn)該病害以來，玉米粗縮病在我國各玉米產(chǎn)區(qū)均有不同程度發(fā)生，特別是近年來由于氣候環(huán)境變化和種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，玉米粗縮病的發(fā)生呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，給玉米產(chǎn)量帶來嚴(yán)重?fù)p失。

目前植物病毒鑒定常用的方法有：生物學(xué)接種實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)檢測、電鏡觀察及分子生物學(xué)方法。這些方法大都需要特定儀器且耗時(shí)久，不適用于田間快速檢測。環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，是一種高靈敏鏈置換技術(shù)，一種新型PCR替代技術(shù)。LAMP特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒溫(60-65℃)的條件下反應(yīng)1小時(shí)左右即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。鈣黃綠素是一種熒光染料，在LAMP反應(yīng)之前加入到反應(yīng)體系中，避免了開蓋造成的反應(yīng)產(chǎn)物污染，這與SYBR Green I染料不同。通過熒光染色直接目測比色就可以得到清晰的反應(yīng)結(jié)果。不需要長時(shí)間的溫度循環(huán)，不需要PCR儀等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應(yīng)用于人類和動植物各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供了一種快速檢測玉米粗縮病病原的方法，通過該方法可以快速診斷出玉米是否攜帶該病毒。

本發(fā)明所提供的一種快速檢測玉米粗縮病病原的方法，是通過以下方法獲得的：

1)根據(jù)NCBI已報(bào)道水稻黑條矮縮病毒S10核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后選擇相對保守區(qū)域700-1700bp，利用AJ297433.1上對應(yīng)區(qū)域通過在線引物設(shè)計(jì)軟件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)4條引物，其中包括2條外引物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP；

2)Trizol reagent提取植株總RNA；

3)設(shè)置不同內(nèi)外引物濃度比例、Mg²⁺濃度、Mn²⁺濃度、鈣黃綠素濃度，確定最佳反應(yīng)體系；分別改變反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)條件；

4)與RT-PCR方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證RT-LAMP方法的可靠性；

本發(fā)明提供的引物序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

RIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

RT-LAMP的反應(yīng)溫度為60-65℃，反應(yīng)時(shí)間為90-150min。

一種檢測玉米上玉米粗縮病病原方法的應(yīng)用包括：玉米疑似病株的快速診斷與鑒別。

利用這一方法可以快速鑒定出玉米植株是否感染玉米粗縮病，進(jìn)而采取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。

附圖說明：

圖1：不同反應(yīng)溫度條件下RT-LAMP結(jié)果的電泳圖(A，RT-LAMP反應(yīng)電泳圖；B，鈣黃綠素顏色變化圖；M，標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，60℃；2，61℃；3，62℃；4，63℃；5，64℃；6，65℃；7，陰性對照)。

圖2：不同反應(yīng)時(shí)間條件下RT-LAMP結(jié)果的電泳圖(A，RT-LAMP反應(yīng)電泳圖；B，鈣黃綠素顏色變化圖；M，為標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，30min；2，60min；3，90min；4，120min；5，150min；6，陰性對照)。

圖3：RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較圖(A，RT-LAMP反應(yīng)電泳圖；B，RT-PCR反應(yīng)電泳圖；C，鈣黃綠素顏色變化圖；1-9，1.0578μg/μL-1.0578×10^-8μg/μL；10為陰性對照)。

具體實(shí)施方式：

下面實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1，玉米粗縮病毒RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

(1)引物設(shè)計(jì)。

根據(jù)NCBI上已報(bào)道的水稻黑條矮縮病毒S10核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。選取相對保守的一段序列699-1699bp作為模板，使用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)引物。將模板序列上傳后，由系統(tǒng)軟件計(jì)算獲得初步的LAMP引物組合(F3，B3，F(xiàn)IP，BIP)，再通過軟件提供的引物相應(yīng)的3’端或5’端穩(wěn)定性及引物二聚體等參數(shù)對設(shè)計(jì)出的多對引物進(jìn)行比較選擇，選取5組合適的引物，再用外引物F3/B3PCR驗(yàn)證，最終確定序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

BIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

(2)溫度梯度實(shí)驗(yàn)

從南京江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院采集玉米病株，參照季英華等RT-PCR方法篩選出玉米粗縮病樣品用于RT-LAMP檢測試驗(yàn)(季英華等，《中國水稻科學(xué)》，2011)。參照Reagents(康為世紀(jì))使用說明，提取樣品總RNA。雖然Bst DNA polymerase的最適反應(yīng)溫度為65.8℃，但許多報(bào)道已經(jīng)證實(shí)RT-LAMP適宜反應(yīng)溫度在60℃-65℃之間，同時(shí)由于不同引物的Tm值不可能完全一致，而且RT-LAMP還要考慮到反轉(zhuǎn)錄酶的適宜反應(yīng)溫度，因此，本發(fā)明對RT-LAMP反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。RT-LAMP體系為：外引物F3和B3各0.2μM，內(nèi)引物FIP和BIP各1.2μM，1.4mM dNTP混合物，8mM MgSO₄，0.5mM MnCl₂，50μM鈣黃綠素，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％TritonX-100，Bst DNA聚合酶，大片段8U，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶100U，RNase Inhibitor 20U，0.8M甜菜堿，2μL總RNA模板，補(bǔ)充DEPC水至25μL。混勻反應(yīng)物在60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃六種條件下恒溫反應(yīng)90min，80℃反應(yīng)5min終止RT-LAMP反應(yīng)，直接目測比色或取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果EB染色。結(jié)果顯示在同樣反應(yīng)體系條件下，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃恒溫反應(yīng)90min后均有階梯狀擴(kuò)增條帶，61℃，62℃，63℃恒溫反應(yīng)90min后的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶亮度幾乎相同，64℃，65℃恒溫反應(yīng)90min后擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶亮度略微有些減弱，陰性對照無階梯狀擴(kuò)增帶(圖1)。因此本發(fā)明RT-LAMP的反應(yīng)溫度應(yīng)為61-63℃。

(3)反應(yīng)時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)

許多報(bào)道已經(jīng)證實(shí)RT-LAMP反應(yīng)時(shí)間少于90min也能檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。按照(2)中已經(jīng)優(yōu)化好的RT-LAMP體系加樣后置于61℃恒溫條件下反應(yīng)，分別設(shè)置恒溫反應(yīng)30min，60min，90min，120min，150min五種處理，按(2)中完成反應(yīng)后電泳檢測。結(jié)果顯示當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為90min時(shí)才有擴(kuò)增產(chǎn)物，但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于90min時(shí)，沒有RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物。此后當(dāng)繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量幾乎不發(fā)生改變(圖2)。因此本發(fā)明確定的RT-LAMP的反應(yīng)時(shí)間為90-150min。

(4)RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較

為了確定RT-LAMP和RT-PCR兩種檢測方法的靈敏度，將提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000C)測定濃度(1.0578μg/μL)后用DEPC水進(jìn)行10倍比稀釋，-70℃保存作為模板。分別取總RNA倍比稀釋液2μL作為模板，采用所設(shè)引物用(2)中RT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)(反應(yīng)時(shí)間為90min)。直接目測比色或取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1％瓊脂糖凝膠上電泳。同時(shí)，以RT-LAMP相同的2μL總RNA倍比稀釋液為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以RT合成的cDNA為模板，以F3和B3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用常規(guī)PCR反應(yīng)體系。取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果EB染色。結(jié)果顯示用RT-LAMP方法可以檢測到濃度是1.0578×10^-6μg/μL的玉米粗縮病毒的總RNA，而RT-PCR只能檢測到濃度是1.0578×10^-4μg/μL的玉米粗縮病毒的總RNA，即RT-LAMP比RT-PCR靈敏性高出100倍(圖3)。

一種檢測玉米植株上玉米粗縮病病原的方法應(yīng)用包括：在玉米疑似病株的快速診斷與鑒別。

上述實(shí)施不以任何形式限定本發(fā)明。